Microbiologia Clinica e
Laboratorio
 Docente : Dott.ssa Mariateresa Vitiello
Dipartimento di Medicina Sperimentale
Sez. Microbiologia e Microbiologia Clinica
Seconda Università degli Studi di Napoli
Facoltà di Medicina e Chirurgia
E-mail: [email protected]
 Testi consigliati:
La Placa
Poli
Temi cardine del programma
1. Lo sviluppo della microbiologia come scienza.
2. Modalità di interazione tra microrganismi e
ambiente.
3. La natura e l’importanza delle tecniche
adottate per isolare, coltivare, osservare e
identificare i microrganismi.
4. Le principali tecniche batteriologiche e
parassitologiche.
5. I più frequenti batteri e parassiti agenti
eziologici di malattie
Programma d’esame
•
Rapporti ospite-parassita: saprofitismo, patogenicità, virulenza, opportunismo, fonti e
serbatoi, veicoli e vettori di microrganismi, modalità di trasmissione e vie di ingresso,
colonizzazione batterica, micetica, protozoaria e virale
•
Flora microbica normalmente residente nei vari distretti corporei
•
Principi di diagnostica microbiologica: procedure di raccolta, conservazione, trasporto e
trattamento dei campioni. Metodi di diagnosi diretta ed indiretta
•
Diagnostica batterica:
esame microscopico, colturale, sierologico diretto, saggi di
sensibilità agli antibiotici, reazioni Ag-Ab “in vitro”, tecniche di diagnostica molecolare per
analizzare DNA ed RNA (PCR, ibridazione molecolare con sonde marcate, dot blot)
•
I principali batteri responsabili di malattie: Enterobatteri, Stafilococchi, Streptococchi,
Brucelle, Pasteurelle, Treponemi, Micobatteri
•
Diagnostica parassitologica: tecniche colturali e substrati utilizzati in parassitologia
(caratteristiche e differenze per scelta d’impiego), metodiche per identificazione da
campioni biologici (esame diretto ed esame attraverso coltura), tecniche di preparazione
vetrini, coloranti per la parassitologia, tecniche d’identificazione: metodologia classica
•
I principali parassiti responsabili di malattie: Toxoplasma, Plasmodi, Cestodi
INTRODUZIONE ALLA
MICROBIOLOGIA
Storia e scopo della
Microbiologia
Definizione
 La Microbiologia è la scienza che studia i
microrganismi e la loro attività.
 Ha per oggetto la forma, la struttura, la
riproduzione, la fisiologia, il metabolismo e
l’identificazione dei microrganismi.
Dimensioni dei batteri e dei virus
Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Microbiology 5th Ed. 1997
Dimensioni dei microrganismi
Definizione
 Comprende lo studio della loro
distribuzione in natura, delle relazioni
tra loro e con gli altri esseri viventi,
degli effetti benefici e dannosi che
hanno sugli esseri umani, delle
modificazioni fisiche e chimiche che
provocano nel loro ambiente.
Settori della Microbiologia
• BATTERIOLOGIA
• PROTOZOOLOGIA (Parassitologia)
• MICOLOGIA
• ALGOLOGIA
• VIROLOGIA
Membri del mondo microbico
• Cellule procariotiche sono prive di un
nucleo delimitato da una membrana
(batteri)
• Cellule eucariotiche possiedono un
nucleo racchiuso da una membrana,
sono morfologicamente più complesse e
generalmente più grandi delle cellule
procariotiche (alghe, protozoi e miceti)
Eukaryotic cell
Prokaryotic cell
Gram +
Flagellum
(e.g. animal)
Rough endoplasmic
reticulum
Nucleus
Cell membrane
Nucleoid
Cell wall
Gram Pili
Granule
Cytoplasm
Mitochondria
Capsule
Cell (inner) membrane
Outer membrane
Ribosomes
Cell wall
Differenze tra cellula procariotica ed
eucariotica
Tipi di Classificazione
•
Schema a cinque regni
comprendente Monera,
Protista, Fungi,
Animalia e Plantae. I
microbi si trovano nei
primi tre regni
•
Schema a tre regni,
basato sul confronto
dell’RNA ribosomale.
Classifica i
microrganismi in
Bacteria (batteri veri),
Archaea e Eucarya
(eucarioti)
Regno degli Archaea – tutti procarioti
• Procariotici
• Si distinguono dai Bacteria per sequenze ribosomali
caratteristiche
• Non contengono peptidoglicano nella parete
• Molti si trovano in ambienti estremi
Includono:
– Metanogeni
– Alofili estremi
– Termofili estremi
• Non si conoscono specie patogene
Regno Eucarya – tutti eucarioti
•
animali, piante e microrganismi eucarioti
– I microrganismi comprendono i protisti (alghe unicellulari, protozoi,
muffe) e funghi
– La maggior parte sono più grandi delle cellule procariotiche
Fungi
Parassiti animali pluricellulari
Protozoa
Algae
Regno dei Bacteria – tutti procarioti
• La maggior parte è costituita da singole cellule
• La maggior parte contiene peptidoglicano nella
parete
• Possono sopravvivere in una infinità di ambienti
• La maggior parte non sono patogeni ed hanno un
ruolo fondamentale nel riciclo dei nutrienti
BATTERI
Sferica (cocchi)
Forma
Cilindrica/bastoncellare (bacilli)
Curvata (vibrioni, spirilli)
CELLULA BATTERICA
STRUTTURE
Involucro
• Capsula
• Parete cellulare
• Membrana citoplasmatica
Citoplasma
• Mesosomi
FUNZIONE
Aderenza, ostacola la fagocitosi
Protezione, rapporto ospite parassita
Scambi osmotici, secrezione, meccanismi
energetici
• Ribosomi
Metabolismo generale
Divisione cellulare,secrezione di
esoenzimi,fosforilazione ossidativa
Sintesi proteica
Sostanza nucleare (nucleo)
genetica
Strutture accessorie
• Flagelli
• Ciglia
• Pili o fimbrie
• Spore (cellule dormienti)
Mobilità
Movimenti ondulatori
Aderenza, trasferimenti genetici
Sopravvivenza a condizioni avverse
COMPONENTI STRUTTURALI
DEI BATTERI
Membrana esterna
Spazio periplasmatico
Granulo intracitoplasmatico
Citoplasma
Capsula
Membrana
citoplasmatica interna
Peptidoglicano
Flagello
Corpo
basale
Ribosomi
pilo
Cromosoma
Mesosoma
pilo
Spirilli
Forma: cocchi (in colonie), diplococchi, streptococchi, spirilli,
vibrioni, bacilli (isolati), spirochete.
Caratteristiche della parete cellulare: Gram-positivi o Gramnegativi
Gram: Speciale colorazione inventata
dall'omonimo scienziato, che permette di dividere
in due grandi tronconi i batteri, i Gram + e i
Gram -, in base alla composizione della parete
batterica.
Cocchi e bacilli
MORFOLOGIA BATTERICA
ESEMPI
COCCHI
BACILLI
SPIRILLI
STREPTOCOCCHI
STAFILOCOCCHI
ENTEROBATTERI
TREPONEMA PALLIDUM
VIBRIO CHOLERAE
MORFOLOGIA BATTERICA
MORFOLOGIA BATTERICA (COCCHI)
COCCHI
SINGOLI
SARCINE
DIPLOCOCCHI
STREPTOCOCCHI
TETRADI
STAFILOCOCCHI
MORFOLOGIA BATTERICA (BACILLI)
BACILLI
COCCOBACILLI
DIPLOBACILLI
STREPTOBACILLI
Nomenclatura e classificazione dei
microrganismi
• Linneo (Linnaeus) stabilì il metodo della nomenclatura
binomiale nel sistema di classificazione delle piante e
degli animali.
• A ciascun organismo sono attribuiti due nomi (in origine in
latino): il primo si riferisce al GENERE di appartenenza
dell'organismo stesso ed è uguale per tutte le specie che
condividono alcuni caratteri principali; il secondo termine,
che è spesso descrittivo, designa la SPECIE
propriamente detta.
Nomi scientifici
• Staphylococcus aureus
– Descrive la distribuzione a grappolo dal
greco [stafule]: grappolo e [coccos]:
(bacca, acino d'uva) ed il colore dorato
delle colonie.
Nomi scientifici
• Escherichia coli
– Rende omaggio allo scienziato che lo ha
scoperto, Theodor Eshcerich, e descrive
l’habitat del batterio, il colon.
Ruolo dei Microrganismi nelle malattie
• Non era poi così ovvio
• Stabilire una connessione dipendeva dallo sviluppo
di tecniche per lo studio dei microbi
• Una volta stabilito, ha permesso lo studio delle
difese dell’ospite - l’immunologia
L’età dell’oro della Microbiologia
(1857-1914)
• Sono stati identificati molti organismi che
producono malattie
• È stato intrapreso lo studio del metabolismo
microbico
• Sono state raffinate le tecniche microbiologiche
• È stata migliorata la comprensione del ruolo
dell’immunità e di come controllare e prevenire le
infezioni microbiche
Identificazione delle relazioni tra
Microrganismi e malattia
• Agostini Bassi (1773-1856)
– Ha mostrato che una malattia dei
bachi da seta era causata da un fungo
Altre evidenze…
• Joseph Lister
– Fornisce evidenze indirette che i microrganismi sono agenti
causali delle malattie
– Sviluppa una metodologia in chirurgia elaborata per impedire
l’ingresso dei microrganismi nelle ferite ed una per il
trattamento dei ferri chirurgici e per gli abiti da camera
operatoria
– Poche volte i suoi pazienti andavano incontro a infezioni
post-operative
Prova finale…
• Robert Koch (1843-1910)
– Stabilisce la relazione fra Bacillus anthracis
e antrace
– Usa i criteri sviluppati dal suo maestro Jacob
Henle (1809-1895)
– Questi criteri sono oggi noti come i postulati
di Koch. Usati ancora oggi per stabilire il
legame fra una particolare microrganismo ed
una particolare malattia
I postulati di Koch
1.
L’agente
causale
deve
essere presente in tutti i
casi della malattia di cui è
ritenuto
responsabile
e
deve essere invece assente
negli individui sani.
2.
L’agente
causale
deve
essere isolato dall’individuo
affetto e, posto in coltura,
deve dare origine ad una
popolazione
cellulare
omogenea (una sola specie).
3.
L’inoculo di una coltura pura
dell’agente
causale
in
individui sani deve dare luogo
alla comparsa della malattia
di cui si ritiene responsabile.
4.
L’agente causale deve essere
re-isolato
dall’individuo
infettato sperimentalmente.
Lo sviluppo di tecniche per lo studio
dei microrganismi patogeni
• Il
–
–
–
–
lavoro di Koch ha permesso la scoperta o lo sviluppo di:
agar
piastre di petri
nutrient broth e nutrient agar
metodi per isolare i microrganismi
Altri sviluppi…
• Pasteur e Roux
– Hanno scoperto che la lunga incubazione di colture prima
del trasferimento nell’ospite provocava nel patogeno la
perdita della capacità di provocare la malattia
• Pasteur e collaboratori
– Hanno sviluppato il vaccino contro il colera dei polli,
antrace e rabbia
Altri sviluppi…
• Emil von Behring (1854-1917) e Shibasaburo Kitasato
(1852-1931)
– Hanno sviluppato un’antitossina contro difterite e
tetano
– Hanno fornito evidenze di un’immunità umorale
• Elie Metchnikoff (1845-1916)
– Ha scoperto le cellule fagocitarie del sangue
– Ha fornito evidenze di un’immunità cellulare
Lo sviluppo della Microbiologia
industriale e dell’Ecologia microbica
• Louis Pasteur
– Ha dimostrato che sia la fermentazione alcolica che
altre fermentazioni erano il risultato di attività
microbica
– Ha sviluppato il processo di pastorizzazione per
conservare il vino
Nascita della moderna chemioterapia
• 1928: Alexander Fleming
scoprì il primo antibiotico.
• Osservò che il fungo
Penicillium produceva un
antibiotico (la penicillina) in
grado di uccidere lo
Staphylococcus aureus.
• 1940s: la penicillina fu
clinicamente testata ed iniziò
la produzione del farmaco
Malattie Infettive
• Quando il patogeno supera la
resistenza dell’ospite, si ha la
malattia.
• Malattie infettive emergenti (EID):
Nuove malattie e malattie a maggiore
incidenza
Malattie Infettive Emergenti
• West Nile encefalite
– West Nile Virus
– Diagnosticata per la prima volta nella regione
del West Nile dell’ Uganda nel lontano 1937.
– Nel 1999 è comparsa nella città di New York.
Malattie Infettive Emergenti
• Ebola febbre emorragica
– Virus Ebola
– Causa febbre, emorragie e coagulazione del
sangue
– Isolato per la prima volta nei pressi del fiume
Ebola, Congo
Malattie Infettive Emergenti
• Hantavirus sindrome polmonare
– Hantavirus
– Identificato per la prima volta nel 1951 in
Korea come causa di febbre emorragica
– Nel 1995 è stata denunciata la comparsa di
una nuova malattia caratterizzata da sintomi
respiratori negli U.S.
– Il virus U.S., chiamato virus Hantavirus Sin
Nombre, probabilmente è stato diffuso in
U.S. tramite i ratti intorno al 1900
Malattie Infettive Emergenti
• Sindrome da Immunodeficienza Acquisita (AIDS)
– Human immunodeficiency virus (HIV)
– Isolato per la prima volta nel 1981.
– Epidemia mondiale infettante 40 milioni di persone;
14000 nuove infezioni ogni giorno.
– Malattia a trasmissione sessuale che si trasmette sia
agli uomini che alle donne.
– Negli U.S., le persone interessate dall’HIV/AIDS
hanno un’età compresa tra i 13 e 24 anni: il 44% sono
donne ed il 63% sono uomini.
Malattie Infettive Emergenti
• Encefalopatia Bovina Spongiforme
– Prioni
– Inoltre causa la malattia di CreutzfeldtJakob disease (CJD)
– La nuova variante di CJD negli uomini è
correlata al consumo di frattaglie bovine
contaminate.
Malattie Infettive Emergenti
• Escherichia coli O57:H7
– Ceppi produttori di tossine di E. coli
– Identificati nel 1982
– Principale causa di diarrea diffusa in
tutto il mondo.
Malattie Infettive Emergenti
• Streptococcus invasivo di gruppo A
– La rapida crescita batterica causa un
esteso danno tissutale.
– Incremento dell’incidenza dal 1995
Malattie Infettive Emergenti
• Antrace
– Bacillus anthracis
– Nel 1877, Koch dimostrava che il B. anthracis
era la causa eziologica dell’antrace.
– Veterinari e agricoltori sono soggetti a rischio
di antrace cutaneo.
– Nel 2001, la disseminazione di B. anthracis
tramite posta infettava 22 persone.
L’importanza dei microrganismi
I microbi possono essere:
 causa di malattie che colpiscono il regno
vegetale ed animale;
 causa di degradazione degli alimenti;
 essenziali per la vita;
 necessari per i cicli geochimici e la
fertilizzazione del suolo;
 utilizzati come biomassa e produttori di
farmaci e molecole per uso industriale.
Ruolo dei microrganismi in
natura e loro utilizzazione da
parte dell’uomo
 Vengono utilizzati come modelli
sperimentali per lo studio della
genetica molecolare e della fisiologia
cellulare.
 Vengono utilizzati per la produzione di
sostanze utili all’uomo
Alcuni impiegati come fonti per:
•produzione commerciale di
antibiotici, farmaci e altre sostanze
(vari aminoacidi ed enzimi);
•produzione di
acido acetico e
aceto;
•fermentazione
lattica del
lattosio per la
produzione di
formaggi e
yogurt;
•acido lattico usato anche per conservazione
di crauti e nelle salamoie acide;
Biotecnologie Moderne ed Ingegneria
Genetica
• Biotecnologia, l’uso di microbi per produrre cibi
e sostanze chimiche (sfruttamento dei microbi
sin dall’antichità).
• L’ingegneria genetica è una tecnica nuova nelle
biotecnologie. Attraverso l’ingegneria genetica ,
i batteri ed i funghi possono produrre una
varietà di proteine tra cui i vaccini ed enzimi.
• Nelle cellule umane i geni mancanti o difettivi
possono essere sostituiti nella terapia genica.
• Batteri geneticamente modificati vengono
utilizzati per proteggere i raccolti dagli insetti e
dal congelamento.
Insetticidi Biologici
• Microbi patogeni per gli insetti sono
l’alternativa ai pesticidi chimici in
agricoltura e nella trasmissione di
infezioni.
• Le infezioni da Bacillus thuringiensis sono
letali per alcuni insetti, ma innocue per
altri animali, come l’uomo, e per le piante.
Bioriparatori
• I batteri
degradano la
materia organica
dei liquami.
• I batteri
degradano o
detossificano
inquinanti come
gli olii ed il
mercurio
Studio dei batteri di interesse medico
Le nozioni che il biotecnologo dovrebbe possedere per ogni batterio
patogeno sono quelle necessarie a configurarne un modello mentale,
completo dei caratteri sufficienti a definirne le caratteristiche
morfo-funzionali utili a comprendere il meccanismo dell’azione
patogena, e da utilizzare come base per la comprensione delle tecniche
di identificazione a scopo diagnostico impiegate più correntemente nel
laboratorio batteriologico.
OFFRIRE AL PAZIENTE LA PRESTAZIONE MIGLIORE
Inquadrare i diversi batteri in un contesto generale, elaborato su
pochi dati precisi, dando per scontate le ampie zone di uniformità
morfo-funzionale che accomunano larghi gruppi di batteri
Focalizzare l’attenzione sulle peculiarità che
caratterizzano i singoli batteri
Elaborazione del modello del batterio X
Non è necessario imparare a memoria se esso è:
-sporigeno o asporigeno
- mobile o immobile
- se produce esotossine o endotossine
- se è aerobio o anaerobio
- etc
Morfologia
Caratteristiche
Esempio: Il batterio in questione è un cocco
Lo dice il nome: stafilococco, streptococco, etc.
Gram-positivo (tutti i cocchi sono Gram-positivi tranne le Neisserie)
Asporigeno (le spore sono prodotte solo dai bacilli)
Immobili (tutti i cocchi sono immobili tranne alcuni enterococchi)
Non produrrà endotossine tipiche (Parete cellulare dei Gram-negativi)
e quindi dovrà con ogni probabilità produrre esotossine
Altro esempio: aerobio o anaerobio?
Tutti i batteri di interesse medico
sono aerobi-anaerobi facoltativi
Eccezioni:
- Brucelle: aerobi obbligati
- Clostridi: anaerobi obbligati
Altro esempio: sporigeno o asporigeno?
La maggior parte dei batteri di interesse
medico sono asporigeni
Eccezioni:
- Bacillus spp
- Clostridi
Per sapere in quali terreni cresce un batterio è sufficiente
ricordare i batteri che necessitano di terreni arricchiti di
particolari sostanze (ad esempio gli emofili) o di incubazione in
condizioni particolari (batteri anaerobi e o microaerofili) e, quei
batteri che non ancora sono stati coltivati in terreni abiotici per
ragioni sconosciute (Treponemi) o perché parassiti intracellulari
obbligati (Rickettsie, Clamidie)
Apprendimento dei caratteri differenziali
Indiscriminata memorizzazione dei numerosi caratteri comuni
SCHEMA DI STUDIO PER LA BATTERIOLOGIA
• Struttura e caratteri antigenici
• Fattori di virulenza
• Patogenesi e immunità (meccanismi dell’azione patogena e
risposte dell’ospite)
• Malattia (sindromi cliniche e fattori predisponenti)
• Diagnostica di laboratorio (microbiologica e sierologica)
• Cenni di terapia e profilassi (terapia di elezione e
vaccinazione)