MICROSCOPIO OTTICO
in campo chiaro
- Il condensatore focalizza sul vetrino un cono di luce
- Gli Obiettivi contengono lenti di diverso potere di
ingrandimento
- La base contiene una sorgente luminosa
- Il braccio contiene due manopole per la
messa a fuoco
INGRANDIMENTO: capacità di fornire un’immagine
ingrandita dell’oggetto osservato
POTERE DI
RISOLUZIONE:
capacità di distinguere come
distinti due punti adiacenti
• l’ingrandimento dipende dall’obiettivo e dall’oculare e
corrisponde al prodotto degli ingrandimenti delle
singole lenti. E’ limitato dal potere di risoluzione
• il potere di risoluzione dipende dalle proprietà fisiche
della luce (), l’apertura numerica dell’obiettivo e
dall’indice di rifrazione del mezzo in cui è immersa la
lente. Corrisponde a circa 200 nm
La distanza minima tra due oggetti (d) affinchè questi possano essere osservati al
microscopio come entità separate è detta POTERE DI RISOLUZIONE ed è data
dall'equazione di Abbè:
d = 0.5 
n sin 
Doveè la lunghezza d'onda della luce utilizzata
n sin è l'apertura numerica
 la lunghezza d'onda è uno dei fattori che influenza
di più il potere di risoluzione
d = 0.5 
n sin 
L’altro fattore che influenza
il potere di risoluzione è l’apertura numerica (n sin 
Apertura numerica è la metà del cono di luce che entra nell’obiettivo dopo
aver attraversato il condensatore
Se il cono ha un angolo stretto non si espande molto dopo aver lasciato il
vetrino  basso potere di risoluzione
quanto più l'angolo del cono di
luce che entra nell'obiettivo è
largo tanto maggiore sarà il
potere di risoluzione
(diminuisce d e quindi la
distanza minima che consente
di distinguere due punti
adiacenti)
l'angolo del cono di luce che entra nell'obiettivo dipende dall'obiettivo e dall'
indice di rifrazione (n) del mezzo in cui si trova la lente
Quando la luce passa da un mezzo all’altro (ariavetro) subisce il fenomeno di RIFRAZIONE, il
raggio viene cioè deviato.
INDICE DI RIFRAZIONE è una misura del grado
con cui una sostanza rallenta la velocità della luce.
Un prisma devia la luce in quanto il vetro ha un indice
di rifrazione diverso dall’aria
il valore massimo di  è 90° e
sin90° = 1.00
sin  può al max essere 1.00
Nessuna lente che funzioni all'aria può avere
un'apertura numerica superiore a 1.00
aumentare l’apertura numerica (n sin ) numerica superiore aumentando
l'indice di rifrazione n e cioè non operare all'aria.
l'uso di un olio per
immersione con indice
di rifrazione uguale a
quello del vetro
consente di aumentare
l’apertura numerica
rispetto a quella che si
ha all’aria e quindi
aumentare il potere di
risoluzione
I raggi luminosi che non erano penetrati nell’obiettivo
vengono convogliati nell’obiettivo
n microscopio ottico ad immersione può al massimo avere un potere di
risoluzione di 0.2 m
microscopia in campo scuro: grazie
ad un diaframma solo i raggi di luce non
riflessi o rifratti dal campione arrivano
all'obiettivo.
Il campione osservato risulta illuminato
in un fondo scuro
microscopia ottica (m.o.)
m.o. in campo scuro
m.o. ad immersione
microscopio a contrasto di fase:
un diaframma anulare origina un cono di luce cavo.
quando un raggio di luce colpisce
un campione viene ritardata
rispetto ad un raggio che non
colpisce il campione
i due raggi vengono rimessi in
fase passando une lamina di fase
e formeranno un'immagine
definita
Microscopio a fluorescenza
il campione (naturalmente fluorescente o reso
fluorescente) viene colpito da luce UV
l'energia accumulata viene poi rilasciata dal
campione come luce a lunghezza d'onda più
alta (visibile)
Cyanobacteria
m.o. in campo chiaro
m.o. a fluorescenza dopo
aver illuminato il campione
con luce a una lunghezza d’onda
di 564nm
Il colore rosso è dovuto ad autofluorescenza
di pigmenti fotosintetici
Visualizzazione →→ →→ microscopia
Forma,
Dimensioni,
Disposizione,
Caratteristiche tintoriali
 FISSAZIONE
 COLORAZIONE
 OSSERVAZIONE
FISSAZIONE
• A CALORE
preserva la morfologia ma non le strutture interne
• FISSAZIONE CHIMICA
ETANOLO
ACIDO ACETICO
CLORURO DI MERCURIO
GLUTARALDEIDE
FORMALDEIDE
preserva le strutture subcellulari
COLORAZIONE
Colorare i batteri consente di:
• vedere maggiore contrasto tra l’organismo e lo sfondo
• differenziare vari tipi morfologici
• osservare determinate strutture subcellulari
I composti utilizzati per colorare i microrganismi:
- Contengono CROMOFORI (gruppi chimici che conferiscono alla sostanza il suo colore)
- Si legano alle strutture cellulari mediante legami ionici, covalenti o idrofobici
COLORANTI ACIDI:
la porzione colorata della molecola ha una carica negativa.
Affinità per il materiale citoplasmatico.
EOSINA, FUCSINA ACIDA, ROSSO CONGO,
FLUORESCEINA, ACIDO PICRICO
COLORANTI BASICI:
la porzione colorata della molecola ha una carica positiva.
Affinità per le strutture nucleari della cellula.
BLU DI METILENE, FUCSINA BASICA,
SAFRANINA, CRISTAL VIOLETTO
COLORANTI COMPOSTI:
(O NEUTRI)
si ottengono mescolando gli acidi e i
basici, colorano le strutture
cellulari in modo diverso a seconda se acidofile
o basofile
SOSTANZE MORDENZANTI:
aumentano l’efficienza della
colorazione permettendo al colorante
di legarsi con maggiore affinità
SOSTANZE FLUORESCENTI:
hanno la capacità di emettere luce
se illuminate ad una determinata
lunghezza d’onda (visibile o UV).
ARANCIO DI ACRIDINA,
ACRIFLAVINA,
FLUORESCEINA
Tecniche di colorazione
Colorazioni semplici:
richiedono l’uso di un solo colorante
Colorazioni complesse: applicazione successiva di più coloranti
Colorazioni differenziali: consentono di distinguere tra loro microrganismi diversi
FISSAZIONE
la fissazione può essere fatta al calore o con sostanze chimiche
(etanolo, ac. acetico, formaldeide).
Il calore preserva la morfologia cellulare ma può alterare le strutture
interne. La fissazione chimica si usa per osservare le strutture
intracellulari.
Colorazione semplice
dopo la fissazione i campioni vengono colorati, lavati ed osservati
i coloranti devono avere un gruppo cromoforo e devono legarsi ai campioni
coloranti basici (blu di metilene, fucsina basica, cristal violetto) - composti
cationici, carichi positivamente che legano strutture e molecole cariche
negativamente (parete cellulare, DNA)
coloranti acidi (eosina, fucsina acida, rosa bengala) - composti anionici,
carichi negativamente che legano strutture e molecole cariche positivamente
Colorazione differenziale
permette di classificare i batteri in base alla loro reazione alla colorazione
Colorazione per acido-resistenza (o di Ziehl-Neelsen)
si usa per riconoscere batteri delle specie Mycobacterium tuberculosis e
Mycobacterium leprae
la colorazione viene fatta a caldo con fucsina basica e fenolo. dopo la
colorazione le cellule vengono lavate con acido solforico e etanolo.
tutte le cellule batteriche, tranne quelle di Mycobacterium, si decolorano.
Colorazione di Gram
si usa per classificare tutti i batteri in
due gruppi, i Gram-positivi ed i
Gram-negativi
soluzione mordenzante
Gram-positivi
Gram-negativi
• l’ingrandimento è limitato dal potere di risoluzione
• il potere di risoluzione dipende dalle proprietà fisiche
della luce e corrisponde a circa 200 nm
Per aumentare l’ingrandimento bisogna
aumentare il limite di risoluzione
SOSTITUZIONE DELLA LUCE CON GLI ELETTRONI
microscopio ottico
microscopio elettronico
lastra
fotografica
occhio
oculare
obiettivo
oggetto
lenti
elettromagnetiche
condensatore
sorgente
luminosa
sorgente di
elettroni
Microscopia elettronica
il campione viene colpito da un fascio di elettroni
(il sistema opera nel VUOTO)
questo aumenta il potere di risoluzione rispetto
ad un microscopio ottico, infatti il potere di
risoluzione aumenta al diminuire della lunghezza
d'onda della luce (la lunghezza d'onda di un
fascio di elettroni e circa 0.005 nm -100000 volte
più bassa della luce visibile)
Microscopio elettronico a
trasmissione (TEM)
il potere di risoluzione del microscopio elettronico
è circa 1000 volte superiore a quello del
microscopio ottico e permette di distinguere due
punti distanti tra loro 0.5 nm
i campioni devono essere fissati chimicamente
(glutaraldeide o osmio e solventi organici) e poi
inclusi in una resina inerte a formare un blocco
da questi blocchi vengono fatte fettine sottilissime con un ultramicrotomo
le fettine vengono "colorate" con metalli pesanti (piombo, uranile) che si
legano alle strutture biologiche e ne aumentano il contrasto
alternativamente si fa una "colorazione negativa" (ombreggiatura) facendo
depositare sulle cellule un velo di vapore di un metallo (platino)
una tecnica alternativa è quella
del freeze-etching che prevede il
congelamento del campione in
azoto liquido (-196°C) ed il taglio
con una lama preraffreddata
così le cellule si spezzano
lungo le linee di minor
resistenza (al centro della
membrana)
le superfici esposte vengono
ombreggiate con platino
facendo un "calco" delle
superfici che poi è osservato
per TEM
microscopio elettronico a scansione
(SEM) scanning electron microscope
il campione viene fissato e rivestito
da uno strato metallico
una sonda effettua una scansione
del campione tramite un fascio
molto sottile di elettroni
quando il fascio di elettroni
colpisce una cellula, gli atomi di
superficie liberano elettroni
(secondari) raccolti da un
rivelatore
cellule batteriche osservate
mediante TEM
(ultrastuttura della cellula)
cellule batteriche osservate
mediante SEM
(superficie delle cellule,
immagine tridimensionale)
Microscopia Confocale
(CSLM Confocal Scanning Laser Microscope)
Diagramma del funzionamento di un microscopio laser a scansione confocale. Le
linee gialle rappresentano la luce laser usata per illuminare il campione. Le linee rosse
simbolizzano la luce che si diparte dal piano del fuoco; quelle blu, la luce proveniente da
parti del campione al di sopra e al di sotto del piano del fuoco.
il campione (reso fluorescente) colpito da un
raggio laser focalizzato emette luce che viene
concentrata da una lente in grado di bloccare la
luce fuori fuoco con produzione di immagini di
diverse sezioni ottiche
Quic kTime™ e un
dec ompres sore TIFF (Non c ompres so)
s ono nec es sari per visualiz zare ques t'immagine.
Confocal microscope images of
Pseudomonas syringae growing in
the leaf intercellular spaces of the
model plant Arabidopsis thaliana.
The bacteria are marked with
green fluorescent protein, which
contrast with the red fluorescence
of chloroplasts in plant cells.
si possono osservare campioni di notevole
spessore che (dopo elaborazione al computer)
possono originare immagini tridimensionali
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Bacteria (red fluorescence)
show an intimate
association with carbonate
precipitates (blue
autofluorescence). Sample
is stained with propidium
iodide; scale bar, 5m
Microscopio a scansione di sonda
(SPM Scanning Probe Microscope)
misura le strutture superficiali delle cellule grazie allo spostamento di una
microsonda lungo la superficie dell'oggetto da osservare
microscopio elettronico a scansione a
effetto tunnel
(STM Scanning Tunnelling Microscope)
potere di risoluzione molto elevato (100
milioni di volte);
permette di visualizzare singoli atomi
microscopio a forza atomica
(AFM Atomic Force Microscope)
usato per studiare le superfici di cellule
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
High magnification AFM image of a
single Pseudomonas putida bacterium
on mica, scanned in air. Surface
features on the bacterium are resolved.
Bacterial flagellae can also be seen.
Image size: 2 x 2 microns.
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Very high magnification AFM image of
the surface of a single Pseudomonas
putida bacterium showing clearly
resolved features. Imaged on mica and
scanned in air. Image size: 0.5 x 0.5
micron.
spore batteriche osservate mediante microscopia:
TEM
ottica ad immersione
ottica a fluorescenza
AFM
SEM
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Dimensioni e forma della
cellula procariotica
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
batteri giganti 6000x800 nm
(visibili a occhio nudo)
nanobatteri o ultramicrobatteri (UMB)
con diametro tra 200 e 50 nm
?
QuickT ime ™e un
dec ompr esso re TIFF ( Non co mpre sso)
son o nece ssar ip er visu aliz zar e ques t'immagine .
QuickTi me™ e un
decom pressore T IFF (Non compresso)
sono necessari per vi suali zzare quest 'im magi ne.
grappoli
diplococchi
Quic k Ti me™ e un
dec om pres s ore T IFF (Non c ompres s o)
s ono nec es s ari per vi s uali zzare ques t 'im magi ne.
tetradi
QuickT i me™ e un
decompressore T IFF (Non com presso)
sono necessari per vi suali zzare quest 'i mm agine.
streptococchi
Quic kT i me™ e un
dec ompres s ore T IFF (Non c om pres s o)
s ono nec es s ari per vi s uali zzare ques t 'i mm agine.
sarcina
coppie
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
filamenti
vibrioni
spirilli - spirochete
miceli
Quick Time™e u n
de compr ess ore T IF F (Non c ompr esso )
so no nec essa ri per v is ualizzar e que st'immag in e.
batteri pleiomorfi = a morfologia variabile
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
QuickTi me™ e un
decom pressore T IFF (Non compresso)
sono necessari per vi suali zzare quest 'im magi ne.