La via per accelerare i processi biologici
ENZIMI
Sono delle proteine altamente specializzare con attività catalitica, accelerano
le reazioni chimiche rimanendo inalterati al termine della reazione stessa.
La loro struttura, come quella delle proteine, è molto complessa e caratterizzata da
una ben precisa configurazione tridimensionale con ripiegamenti, rientranze e
sporgenze.
Il sito attivo dell’enzima è un regione (estremamente piccola della molecola) a
forma di fessura o di tasca che istaura legami con il substrato. E’ costituito da pochi
residui di amminoacidi con una configurazione spaziale ben definita,
complementare a quella del substrato con cui interagisce.
Per l’interazione enzima substrato è stato suggerito il modello chiave serratura:
La maggior parte degli enzimi portano nella loro molecola una parte non proteica.
In questo caso l’enzima intero prende il nome di oloenzima,
la componente proteica di apoenzima,
la non proteica di gruppo prostetico
Se il gruppo prostetico è facilmente dissociabile dall’apoenzima esso prende il nome di
coenzima.
La nomenclatura e la classificazione degli enzimi si basa sul tipo di reazione catalizzata, si hanno
così 6 classi di enzimi:
All’interno delle classi gli enzimi vengono generalmente classificati in base al nome del
substrato specifico
DIFFERENZE TRA ENZIMI E CATALIZZATORI INORGANICI
Gli enzimi si distinguono dai comuni catalizzatori inorganici per le seguenti significative
caratteristiche:
Peso
molecolare
Specificità
Potere
catalitico
A differenza dei catalizzatori della chimica inorganica che sono composti
molto semplici spesso anche semplici atomi, gli enzimi sono molecole
proteiche e, pertanto, espressione dei geni. Sono caratterizzati da un peso
molecolare molto alto e da una configurazione tridimensionale piuttosto
complessa, articolata nelle quattro strutture proprie delle proteine.
Diversamente dai catalizzatori inorganici che molto spesso si
comportano da pas-partout e catalizzano numerose reazioni anche
molto diverse tra loro, gli enzimi sono altamente specifici sia verso il
substrato sul quale agiscono, sia verso il tipo di reazione che
catalizzano. La maggior parte di enzimi agisce su di un unico
substrato o su un numero molto limitato di composti.
Gli enzimi accelerano le reazioni almeno di un milione di volte.
ENERGIA DI ATTIVAZIONE
Perché una reazione chimica possa avvenire, si devono rompere i legami preesistenti e si
devono eventualmente formare nuovi legami.
Consideriamo una popolazione di molecole R-X che devono reagire per formare il prodotto R+
X-.
Affinché una reazione chimica avvenga è necessario:
• le molecole si urtino
• urto efficace, nel senso che le molecole che si urtano devono avere un contenuto energetico
tale da permettere loro di formare il complesso attivato (Rδ+--- X δ-) ad alto contenuto
energetico e bassa stabilità.
Il livello energetico a cui è localizzato il complesso attivato si chiama stato di transizione.
La differenza di energia tra i reagenti e lo stato
di transizione viene detta energia di attivazione
(Ea).
Ea rappresenta quindi una barriera energetica che i
reagenti devono superare per trasformarsi nei
prodotti.
Il tutto può essere simpaticamente rappresentato come un sasso (reagente) che per arrivare a
valle (prodotto) deve superare la montagna (Ea)
Maggiore è il numero di molecole R-X capaci di
formare, nell’unità di tempo, il complesso attivato
maggiore sarà la velocità di reazione.
La velocità di reazione è definita come la quantità di sostanza
consumata o prodotta nell’unità di tempo:
v = dc/dT
Una reazione chimica può essere accelerata aumentando la temperatura. Infatti
aumentando la T aumenta l’energia cinetica delle particelle
aumenta il numero
degli urti efficaci tra le molecole
un maggior numero di particelle, nell’unità di tempo,
formerà il complesso attivato.
CATALISI ENZIMATICA
Un altro modo per accelerare una reazione è quello di aggiungere un enzima (E). E si lega
alle molecole R-X per formare il complesso attivato (E-Rδ+---Xδ-) il cui stato di transizione è
più basso rispetto a quello della reazione non catalizzata. Così alcune molecole di R-X che
prima non erano in grado di reagire, adesso legandosi a E entrano nello stato di transizione (più
basso) per formare i prodotti.
Gli Enzimi catalizzano tutte le reazioni che
avvengono nell’ambiente cellulare dove le
condizioni di temperatura e concentrazione
esistenti
comporterebbero
tempi
di
reazione molto lunghi.
Come si misura la velocità di una reazione catalizzata
La velocità di reazione è definita come la quantità di sostanza consumata o prodotta
nell’unità di tempo.
Un altro modo per esprimere la velocità di una reazione catalizzata è il
numero di turnover. Esso indica il numero di molecole di substrato che
reagiscono con una sola molecola di enzima nell’unità di tempo. La velocità
di reazione cambia da enzima ad enzima ed è caratteristica di ognuno di
Concentrazione
essi.
[P]
[S]
vo
Andamento nel tempo di una reazione
enzimatica misurata come comparsa del
prodotto (P) o scomparsa del substrato (S).
La linea tratteggiata tangente alla curva
rappresenta la velocità iniziale v0
Tempo
All’inizio quando è praticamente presente tutto il substrato la velocità segue un andamento rettilineo (v0), a mano a mano
che il substrato viene consumato la velocità rallenta fino a raggiungere un plateau quando tutto il substrato è stato
convertito in prodotto.
La velocità di una reazione catalizzata è influenzata dai
seguenti fattori
Concentrazione del substrato
Concentrazione dell’enzima
Temperatura
pH
Inibitori
CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO
A parità di altre condizioni (temperatura,
concentrazione di enzima, pH, ecc.) riportando in
grafico la concentrazione di substrato in funzione
della v0 si ottiene una curva iperbolica.
Si osserva che, nel primo tratto della curva
(rettilineo) la v0 è direttamente proporzionale alla
concentrazione di substrato (aumentando la
concentrazione di S aumenta proporzionalmente il
numero di molecole che formano il complesso ES).
Una volta raggiunta una certa concentrazione di S la
v0 cresce più lentamente fino a raggiungere un
valore massimo quando tutto l’enzima è saturato dal
substrato e pur continuando ad aumentare la
concentrazione di S la v0 rimane costante (Vmax).
E’ possibile risalire alla velocità di una reazione enzimatica dall’equazione v0= Vmax
[S] / [S] + Km proposta dai due studiosi Michaelis e Menten. Nell’equazione, v è la
velocità di reazione, Vmax la velocità massima, [S] la concentrazione del substrato e
Km è la costante di Michaelis-Menten.
Km corrisponde alla concentrazione di S alla quale la velocità è = Vmax/2
Equazione di Michaelis-Menten
Vmax [S]
v0 =
Km + [S]
A basse concentrazioni di substrato, quando [S] è molto più piccola di Km e quindi trascurabile,
si ha
v0 = Vmax [S] / Km cioè, la velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato.
Ad alte concentrazioni di substrato, quando [S] è molto più grande di Km, Km diventa
trascurabile e si ha
v0 = Vmax, cioè, la velocità è la massima, indipendentemente dalla
concentrazione del substrato.
I valori di Km variano moltissimo da enzima ad enzima ed esprimono l’affinità che l’enzima ha per il
substrato. Osservando la posizione di Km sul grafico velocità contro concentrazione di substrato, si
può notare che se Km è bassa, in ogni istante è necessaria una bassa concentrazione di substrato
per saturare metà delle molecole di enzima e questo è segno di alta affinità dell’enzima per il
substrato, mentre se Km è alta, occorre una più alta concentrazione di substrato per saturare metà
delle molecole di enzima in ogni istante e questo vuol dire che l’enzima presenta bassa affinità per
il substrato. Il valore di Km è indipendente dalla concentrazione dell'enzima e dalla concentrazione
del substrato.
Per un calcolo più accurato della Vmax e della Km è opportuno trasformare
matematicamente l’equazione di Michealis-Menten facendo il reciproco di
entrambi i lati dell’equazione
Vmax [S]
v0 =
Km + [S]
…………
1
v0
=
KM
1
Vmax
[S]
+
1
Vmax
Si ottiene il grafico dei doppi reciproci (o grafico di Lineweaver-Burk) mediante il
quale la curva iperbolica viene convertita in una retta
CONCENTRAZIONE DELL’ENZIMA
Km è indipendente dalla concentrazione
dell’enzima
v0
La velocità iniziale v0 di una reazione
enzimatica è direttamente proporzionale alla
concentrazione dell’enzima.
5
Unità enzimatica: quantità di enzima capace
di trasformare una µmole di S in 1 minuto a
25 °C nelle condizioni ottimali del saggio.
È quindi possibile misurare l’attività di un enzima
(cioè la sua concentrazione espressa come unità per
volume o per g di peso fresco o secco) mediante una
misura della Vo ed in particolare della Vmax. Tali
misure si effettuano utilizzando una concentrazione
saturante di substrato (∼ 5 volte la Km quando la
vo=Vmax) e monitorando la reazione nei primi
minuti, quando tutto il substrato è praticamente
disponibile.
TEMPERATURA
La velocità delle reazioni enzimatiche varia col
crescere della temperatura secondo il grafico a
campana riportato. Si può osservare che,
inizialmente, la velocità cresce al crescere della
temperatura,
raggiunge
un
massimo
in
corrispondenza di una certa temperatura definita
ottimale, si riduce, in seguito, per effetto della
denaturazione dell’enzima.
pH
Come la variazione della temperatura, in
modo un poco più complesso, anche la
variazione del pH influenza la velocità
delle reazioni enzimatiche. Anche in
questo caso, la curva presenta un
andamento a campana e l’attività
enzimatica manifesta un massimo in
corrispondenza di un valore definito pH
ottimale legato alla natura del substrato.
Inibitori
In molti casi, molecole specifiche o ioni possono competere con le molecole di substrato nel
legarsi con l’enzima ed inibire l’attività dell’enzima.
L’inibizione può essere irreversibile e reversibile.
IRREVERSIBILE
E’ irreversibile quando l’inibitore si va a legare al sito catalitico dell’enzima con un legame
molto forte, impedendo l’accesso del substrato.
I+E
Ki
EI inattivo
Un esempio di inibizione irreversibile è dato dall’azione dei gas nervini che bloccano
l’azione dell’enzima acetilcolinesterasi, un enzima che ha un ruolo importantissimo nella
trasmissione degli impulsi nervosi.
REVERSIBILE
L’inibizione reversibile può essere competitiva, quando gli inibitori sono, da un
punto di vista chimico, molto simili alle molecole di substrato e si legano agli
stessi siti attivi, e non competitiva, quando gli inibitori si legano a siti dell’enzima
diversi da quelli che legano il substrato e, pertanto, possono legarsi sia all’enzima
che al complesso ES.
COMPETITIVA
L’inibitore possiede una struttura molto simile a quella
del substrato la similitudine porta il substrato e
l’inibitore a competere per lo stesso sito attivo
dell’enzima. L’esito della competizione dipende dalla
concentrazione delle due molecole che si contendono il
sito attivo
Può essere completamente rimossa aumentando
notevolmente la concentrazione di substrato
NON COMPETITIVA
L’inibitore si lega all’enzima in una zona diversa da
quella del sito attivo dando luogo al complesso EI
inattivo. Il legame dell’inibitore deforma la
conformazione spaziale dell’enzima ed il suo sito
catalitico pur potendosi legare al substrato risulta
inattivo.
E’ possibile distinguere la inibizione competitiva da quella non
competitiva
1/Vmax
1/Vmax
In presenza di inibitore per ottenere la
stessa velocità di reazione che in sua
assenza, è necessario aumentare la
concentrazione di substrato. La Vmax
rimane invariata (infatti a concentrazione
elevata di substrato tutta l’inibizione
viene rimossa) mentre la Km aumenta 1/Km diminuisce.
A qualsiasi concentrazione di
substrato la velocità di reazione in
presenza di inibitore è sempre minore
che in sua assenza. Quindi la Vmax
diminuisce
1/Vmax aumenta,
mentre la Km rimane costante.
STUDIO DELLE INTERAZIONI PROTEINA-LIGANDO
Queste interazioni sono alla base del riconoscimento molecolare
e quindi rappresentano la chiave della maggior parte dei processi
biologici:
Specificità degli enzimi ed allosterismo
Trasporto attraverso i compartimenti cellulari
Trasduzione del segnale
Regolazione della trascrizione e della traduzione
Riconoscimento degli antigeni da parte degli anticorpi
ed altro
Come si analizzano tali interazioni e come si determinano le
costanti di dissociazione o di legame?
Concetti basilari per lo studio del binding
recettoriale
I recettori sono presenti in concentrazioni molto piccole nei tessuti.
Incubando il tessuto contenente i recettori R ed il ligando
radiomarcato D in opportune condizioni sperimentali si formerà il
complesso RD secondo l’equazione
R+D
RD
Quando il sistema raggiunge l’equilibrio in ogni provetta avremo:
Radioligando
Tessuto
Tampone
di incubazione
Incubazione
Ligando radiomarcato D
Equilibrio
Recettore RD
Recettore libero R
Il recettore libero R non potrà essere misurata ma possiamo
misurare la quantità di complesso ligando-recettore RD.
Per poter calcolare la quantità del complesso RD è necessaria
un’operazione di separazione del legato (Bound) dalla quantità
di ligando radiomarcato D libero in soluzione non legato al
tessuto (Free).
Equilibrio
Separazione
Metodi di separazione del RD dal mezzo di reazione
Filtrazione
Il metodo più semplice e classico è quello della
filtrazione su membrane in fibra di vetro
Whatman GF/A, GF/B, GF/C dove varia la porosità 0.7 µm-2.7 µm
Il tessuto contenente il recettore legato al radioligando
aderisce al filtro mentre il radioligando libero passa
attraverso la membrana.
Limiti e precauzioni della filtrazione
Le proteine ostruiscono il filtro
Il ligando radiomarcato tende a legarsi alle fibre del filtro.
Elevata velocità di filtrazione (deve essere completata in 4-5
secondi per evitare che il ligando radiomarcato si stacchi dal
recettore. In genere si perde il 5% di RD)
Centrifugazione
Limiti e precauzioni della centrifugazione
Una certa quantità di ligando radiomarcato (Free) potrebbe
restare intrappolato nel pellet.
Numero limitato degli alloggi nel rotore
Dialisi
Viene impiegata quando il recettore ha bassa affinità per il ligando
radiomarcato (micromolare).
Una piccola membrana simile alla cellulosa da dialisi separa
due camere
L
L
R
R
L
L
R
L
L L
La membrana è scelta in modo tale che il ligando possa
passare mentre il recettore viene trattenuto.
Il ligando diffonde fino a raggiungere l’equilibrio.
Nella camera azzurra [L] sarà Ligando libero
Nella camera gialla [L]= ligando libero +ligando legato
La differenza fra questi valori è la concentrazione di ligando
legato.
Quella che viene misurata è la deplezione di ligando libero
Analisi di saturazione
Kon
Recettore-Ligando
Recettore + Ligando
Koff
Il binding avviene quando ligando e recettore collidono mediante
diffusione e quando la collisione ha un corretto orientamento e
sufficiente energia. La velocità di associazione è data dal
numero di eventi di binding per unità di tempo
Von = [Ligando] × [Recettore] ×
kon
Una volta avvenuto il binding, ligando e recettore restano legati
per un certo periodo di tempo.
La velocità di dissociazione del complesso è data dal
numero di eventi per unità di tempo
Voff = [ligando-recettore] × koff
Dopo la dissociazione il ligando e il recettore non devono aver
subito modifiche.
All’equilibrio avremo:
Von = Voff
[Ligando] × [Recettore] × kon = [Ligando-Recettore] × koff
Riarrangiando l’equazione avremo:
[Ligando] [Recettore]
[Ligando-Recettore]
Koff
=
=
Kon
Kd
Per meglio comprendere il significato della Kd poniamo
[Ligando] = Kd
L’equazione pertanto diviene:
[Recettore]
[Ligando-Recettore]
da cui si evince che:
=
1
[Recettore] = [Ligando- Recettore]
Quando [Ligando] = Kd la quantità di recettore libero è
esattamente uguale alla quantità di recettore occupato.
I recettori totali sono la somma di quelli liberi più quelli legati al
ligando, e quando [Ligando] = Kd avremo che metà della
popolazione recettoriale sarà occupata all’equilibrio.
Se il ligando ha elevata affinità per il recettore, la Kd sarà
piccola perché basterà una piccola concentrazione di ligando per
legare la metà dei recettori.
Non bisogna confondere la Kd (costante di dissociazione
all’equilibrio) con Koff (costante di dissociazione). Non sono la
stessa cosa ed hanno dimensioni differenti.
Kon = costante di associazione (molare-1 min-1)
Koff = costante di dissociazione (min-1)
Kd = costante di dissociazione all’equilibrio (molare)
La legge di azione di massa permette di definire la frazione di
recettore occupata all’equilibrio in funzione della concentrazione
di ligando.
Frazione recettoriale occupata
[RL]
[Rtot]
=
[RL]
[R] + [RL]
Questa equazione non è utile perché non conosciamo la
concentrazione di recettore libero.
Poiché
[R] = [Rtot] - [RL]
e sapendo che:
[R] [L]
Kd =
[RL]
[R] [L] ([Rtot] - [RL]) [L]
[RL] =
=
Kd
Kd
[RL] Kd = [Rtot] [L] - [RL] [L]
[RL] Kd + [RL] [L] = [Rtot] [L]
[RL] (Kd + [L] ) = [Rtot] [L]
[RL] =
[Rtot] [L]
Kd + [L]
Bound
(pmol/mg protein)
0.15
Binding totale
Binding non specifico
Binding specifico
0.10
Le tre curve corrispondenti
sono riportate in figura
0.05
0.00
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
[3H]spiroperidolo, (nM)
Visualizzando solo la
curva
del
binding
specifico
possiamo
individuare la Kd e la
Bmax
Bound
(pmol/mg protein)
0.100
0.075
Bmax
0.050
0.025
0.000
0.00
Kd
0.25
0.50
0.75
[3H]spiroperidolo, (nM)
1.00
da cui la frazione recettoriale occupata [RL]/ [Rtot] sarà:
[Ligando]
[RL]
[Rtot]
[Ligando]
=
Ligando + Kd
Frazione recettoriale occupata
0
0%
1Kd
50%
4Kd
80%
9Kd
90%
99Kd
99%
Informazioni provenienti dall’analisi di saturazione
KD
Indica la concentrazione di radioligando che all’equilibrio
occupa il 50% dei recettori presenti nel preparato
biologico
Bmax
Indica la densità recettoriale nel tessuto studiato. Si
esprime in moli/mg di proteina.
Approccio sperimentale all’analisi di saturazione
L’esperimento di saturazione viene effettuato determinando il
Binding Totale e il Binding Non-Specifico a differenti
concentrazioni di ligando radiomarcato.
Binding Totale
Viene definito aggiungendo al tessuto concentrazioni crescenti di
radioligando
Binding Non-Specifico
Viene definito in presenza di ligando non marcato ad elevata
concentrazione alla quale tutto il radioattivo viene spiazzato dai
siti specifici di legame
Esempio: Vogliamo determinare il binding specifico all’equilibrio
per un determinato radioligando alla concentrazione di 0.5 nM
Provetta 1 (Binding totale)
Tessuto + Rx (0.5 nM)
Lettura radioattività =2500 cpm
Provetta 2 (Binding non specifico)
Tessuto + Rx (0.5 nM) + Ligando non marcato (10 µM)
Lettura radioattività= 500 cpm
Alla concentrazione 0.5 nM di RX il complesso RD (Binding
Specifico, Bound) sarà : 2500-500= 2000 cpm.
Il valore 500 cpm rappresenta la quantità di RX che si è legato
a siti non specifici di legame.
Infatti
l’impiego
del
ligando
non
marcato
ad
levata
concentrazione spiazza RX solo da tutti i siti specifici ma non
da quelli non specifici.
Realizzando differenti concentrazioni di RX e definendo per
ciascuna il Binding Totale e il binding Non-Specifico si
calcola il Binding Specifico.
Bound
(pmol/mg protein)
0.15
Binding totale
Binding non specifico
Binding specifico
0.10
Le tre curve corrispondenti
sono riportate in figura
0.05
0.00
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
[3H]spiroperidolo, (nM)
Visualizzando solo la
curva
del
binding
specifico
possiamo
individuare la Kd e la
Bmax
Bound
(pmol/mg protein)
0.100
0.075
Bmax
0.050
0.025
0.000
0.00
Kd
0.25
0.50
0.75
[3H]spiroperidolo, (nM)
1.00
Come trasformare i cpm in concentrazione
Esempio:Un campione dal volume totale di un 1 mL fornisce
5000 cpm per un Rx di attività specifica 27 Ci/mmole
cpm
= efficienza (%)
dpm
Conoscendo l’efficienza strumentale (es 55%) 5000 cpm
corrispondono a 9090 dpm
Sapendo che 2.22 x 106 dpm corrispondono a 1 µCi
Avremo che 9090 dpm corrispondono a 4.1 x 10-3 µCi
Dall’attività specifica del radioligando sappiamo che 27 Ci
corrispondono ad 1 mmole. Cioè 27 x 106 µCi ad 1 mmole
Avremo che 4.1 x 10-3 µCi corrispondono a 1.52 x10-10 mmoli
Il campione in esame ha un volume totale di 1 mL
La concentrazione sarà: 1.52x10-10 M (0.152 nM).
Analisi di Scatchard
Partendo dall’equazione:
[Rtot] [L]
[RL] =
Kd + [L]
[RL] ([L] + Kd ) = [L] [Rtot]
[RL] [L] + [RL] Kd = [L] [Rtot]
dividendo tutto per [L] Kd avremo:
[RL] [L]
[L] Kd
+
[Rtot] [L]
[RL]Kd
[L] Kd
=
[L] Kd
quindi:
[RL]
[L]
=
[Rtot]
Kd
-
[RL]
Kd
Se indichiamo con B la concentrazione di ligando legato [RL];
con Bmax la quantità massima di ligando legato [Rtot];
con F la quantità di ligando libero [L]
avremo:
B
_ B + Bmax
=
F
Kd
Kd
Riportando in grafico il rapporto tra la quantità di ligando legato
e ligando libero (B/F) rispetto alla quantità di ligando legato (B)
avremo:
1.00
B/F
0.75
0.50
Bmax
0.25
0.00
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
0.150
Bound
Si ottiene una retta con
Slope = -
1
Kd
L’intercetta sull’asse delle ascisse (B/F = 0) permette di
ricavare Bmax che rappresenta la densità recettoriale.
Se è presente un solo tipo di recettore lo Scatchard sarà
lineare.
Se sono presenti invece due tipi di recettore in uguale
concentrazione ma con differenze in Kd per il radioligando
avremo:
B
Binding specifico
A
1.00
0.75
B/F
0.50
0.25
[radioligando]
0.00
0.000 0.025
0.050 0.075
0.100 0.125 0.150
Bound
Le curve dei singoli recettori sono riportate in rosso e azzurro
mentre in nero la curva somma del binding totale.
Nel grafico di Scatchard (B) la linea nera del binding totale
(inteso come somma del binding specifico delle popolazioni
recettoriali esistenti) evidenzia una curvatura e le due linee
tratteggiate rappresentano il binding specifico di ciascun
recettore.
Dall’analisi di Scatchard si può determinare l’omogeneità di
una popolazione recettoriale (sempre che vi siano differenze
evidenti tra i valori di Kd del radioligando per ciascun recettore).
In caso contrario avremo un’informazione apparente (di un’unica
popolazione recettoriale).
La soluzione del problema è realizzata ovviamente da
radioligandi selettivi per ciascun tipo di recettore presente.
Analisi di Hill
Considerando l’equazione:
[Rtot] [L]
[RL] =
Kd + [L]
che può essere scritta:
[RL] [L] + [RL] Kd = [Rtot] [L]
[RL] Kd = [Rtot] [L] - [RL] [L]
[RL] =
[L] ([Rtot] - [RL])
Kd
da cui:
[RL]
=
[Rtot] - [RL]
[L]
Kd
se il ligando L interagisce con n siti secondo l’equazione
nL + R
avremo:
[RL]
RLn
=
[Rtot] - [RL]
B
Bmax - B
[L]n
Kd
=
[L]n
Kd
passando ai logaritmi:
B
log
Bmax - B
dove n è il coefficiente di Hill (nH)
log
n log [L] - log Kd
Se esiste un solo sito di
interazione per recettore (n =1)
si ha una retta con pendenza = 1
B
Bmax - B
Per calcolare la Kd
bisogna porre
log
=
B
=0
Bmax - B
0
pendenza = nH
log [L]