Lavoro di diploma
Data: 1 giugno 2011
Scuola Medico Tecnica – Tecnico in analisi biomediche 2010/2011
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di Clostridium difficile di origine clinica e in alimenti pronti al consumo Autore: Giada Guerrini
Laboratorio: Istituto Cantonale di Microbiologia (ICM), Bellinzona
Responsabili: Antonella Demarta, Federica Mauri
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Indice 1. Riassunto............................................................................................................................... 4 2. Abbreviazioni ......................................................................................................................... 5 3. Introduzione ........................................................................................................................... 6 3.1 Il Clostridium difficile ........................................................................................................ 6 3.2 Patogenicità, fattori di virulenza e CDAD (Clostridium difficile associated disease) ........ 6 3.3 Trasmissione e prevenzione ............................................................................................ 7 3.4 Resistenza e trattamento ................................................................................................. 7 3.5 Il C. difficile negli alimenti ................................................................................................. 7 4. Scopo del lavoro .................................................................................................................... 8 5. Materiali e metodi .................................................................................................................. 8 5.1 Alimenti ............................................................................................................................ 8 5.1.1 Preparazione dei terreni ............................................................................................ 8 5.1.2 Preparazione della soluzione di spore ...................................................................... 9 5.1.3 Preparazione dei campioni da analizzare ............................................................... 10 5.1.4 Estrazione diretta di DNA da brodo in caso di crescita negativa ............................. 11 5.1.5 Colorazione di Gram e catalasi ............................................................................... 12 5.2 Ceppi clinici .................................................................................................................... 12 5.3 Estrazione DNA ............................................................................................................. 13 5.4 Reazioni PCR per gluD e tossine .................................................................................. 14 5.5 Messa in evidenza del prodotto PCR ............................................................................. 16 5.6 Ribotipo PCR ................................................................................................................. 17 5.7 Messa in evidenza del prodotto PCR ............................................................................. 18 5.8 PCR per la tossina binaria ............................................................................................. 19 5.9 Messa in evidenza del prodotto PCR ............................................................................. 20 6. Risultati e discussione ......................................................................................................... 21 6.1 Studio preliminare, confronto e scelta dei metodi di coltura........................................... 21 6.2 Studio di campioni di alimenti ........................................................................................ 23 6.3 Analisi di campioni di origine clinica ............................................................................... 24 7. Conclusioni .......................................................................................................................... 26 8. Ringraziamenti..................................................................................................................... 27 9. Bibliografia ........................................................................................................................... 28 10. Allegati ............................................................................................................................... 30 10.1 Allegato 1 ..................................................................................................................... 30 10.2 Allegato 2 ..................................................................................................................... 31 10.3 Allegato 3 ..................................................................................................................... 33 10.4 Allegato 4 ..................................................................................................................... 33 10.5 Allegato 5 ..................................................................................................................... 36 10.6 Allegato 6 ..................................................................................................................... 36 10.7 Allegato 7 ..................................................................................................................... 36 10.8 Allegato 8 ..................................................................................................................... 36 10.9 Allegato 9 ..................................................................................................................... 36 10.10 Allegato 10 ................................................................................................................. 36 10.11 Allegato 11 ................................................................................................................. 37 10.12 Allegato 12 ................................................................................................................. 37 10.13 Allegato 13 ................................................................................................................. 37 10.14 Allegato 14 ................................................................................................................. 37 2
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
10.15 Allegato 15 ................................................................................................................. 37 10.16 Allegato 16 ................................................................................................................. 37 10.17 Allegato 17 ................................................................................................................. 37 10.18 Allegato 18 ................................................................................................................. 38 10.19 Allegato 19 ................................................................................................................. 38 10.20 Allegato 20 ................................................................................................................. 38 3
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
1. Riassunto 1. Abstract Il C. difficile è un batterio bacillo gram
positivo, anaerobio e sporigeno, con crescita
ottimale a 37°C. E’ isolato nel 80% delle feci
di bambini e neonati e nel 3% di adulti sani.
E’ anche presente nelle feci di molti animali.
Causa infezioni del tratto gastro-intestinale e
colpisce pazienti che fanno uso prolungato di
antibiotici. Causa la CDAD (Clostridium
difficile associated disease) con sintomi che
variano
dalla
diarrea,
alla
colite
pseudomembranosa fino al megacolon
tossico. I fattori di virulenza principale del C.
difficile sono la tossina A (TcdA), la tossina B
(TcdB) e la tossina binaria (CDT). La CDAD
è una delle infezioni nosocomiali più comuni
ma negli ultimi tempi però si sono riscontrate
molte infezioni anche a livello comunitario.
L’origine delle infezioni comunitarie è
sconosciuta e per questo motivo si è voluto
indagare se il cibo potesse essere una
possibile fonte di contaminazione. L’obiettivo
del lavoro è stato di determinare se vi fosse
la presenza di C. difficile in alimenti pronti al
consumo come insalata
e carne,
determinandone eventualmente il tossinotipo
in modo da poter eventualmente stabilire una
correlazione con i ceppi isolati. Nello studio
sono stati analizzati insaccati crudi e insalate
provenienti da tutto il Ticino. Per quanto
concerne i ceppi clinici sono stati analizzati
quelli isolati presso ICM. Gli alimenti vengono
inserti nel brodo di coltura. Dopo incubazione
nel caso in cui è stata rilevata la presenza di
C. difficile si è provveduto a eseguire: una
PCR Multiplex per la determinazione dei geni
delle
tossine
e
della
glutammato
deidrogenasi ed una PCR per il ribotipo.
Sono stati analizzati 27 campioni di carne e 7
di insalate, tutti sono risultati negativi per la
presenza di C. difficile. Con questi risultati si
può concludere che gli alimenti pronti al
consumo come carne e insalata non
dovrebbero
essere
una
fonte
di
contaminazione in Ticino.
C. difficile is a Gram positive spore-formig
bacteria bacillus with optimal growth at 37 °C.
It is isolated in 80% of the faeces of babies
and children and 3% of healthy adults. It is
found in animal and human intestines.
It causes infections of the gastrointestinal
tract and affects patients who are long-term
users of antibiotics. It causes the CDAD
(Clostridium difficile associated disease), with
symptoms which vary from diarrhea,
pseudomembranous
colitis
to
toxic
megacolon. The virulence factors are: the
toxin A (TcdA), the toxin B (TcdB) and the
binary toxin (CDT). The CDAD is one of the
most
common
nosocomial
infections,
however in recent times, many infections are
found also at community level. The source of
community infection is unknown and that is
why we wanted to investigate if food could be
a possible source of contamination. The
objective of this study was to determine if
there was the presence of C. difficult in food
ready for consumption such as meat and
salad, and determine the toxinotype in order
to possibly establish a correlation with the
strains isolated. In the study, raw meats and
salads from all over the Ticino were
analyzed. With regard to the clinical strains
those isolated at ICM were analyzed. The
foods were placed in the grow broth for
spores isolation. Clinical strains were grown
on agar blood. After detection C. difficile in
culture, determination of toxin and glutamate
dehydrogenase genes was performed by
Multiplex PCR. The ribotype was also
performed by PCR. 27 samples of meat and
7 of salads were analyzed, all were negative
for the presence of C. difficile. With these
results we conclude that ready-to-eat foods
such as meat and salad should not be a
source of contamination in Ticino.
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Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
2. Abbreviazioni AS
ANA
BHI
C. difficile
CDAD
CDT
CLO
CMM
gluD
ICM
PCR
TBE
TcdA
TcdB
Agar Sangue
Anaerobiosi
Brain heart infusion
Clostridium difficile
Clostridium difficile associated disease
Clostridium difficile Toxin
Clostridium difficile agar
Cooked meat medium
Glutammato deidrogenasi
Istituto Cantonale di Microbiologia Bellinzona
Polymerase Chain Reaction
Tris borato EDTA
Toxin Clostridium difficile A
Toxin Clostridium difficile B
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Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
3. Introduzione 3.1 Il Clostridium difficile I clostridi sono l’unica famiglia di batteri sporigeni anaerobi associati con gli esseri umani sia
come non patogeni, infatti fanno parte della normale flora intestinale di uomini ed animali, sia
come agente patogeno [3]. Il C. difficile è un batterio a bastoncino Gram positivo, anaerobico
e sporigeno con una crescita ottimale a 37°C. E’ stato scoperto come agente patogeno nel
1978 [1] [2] [3].
Vive nell’intestino umano e fa parte della flora batterica intestinale normale. Viene isolato dalle
feci del 3% di adulti sani e dell’80% di bambini e neonati sani. E’ anche presente nelle feci di
animali come cani, gatti, cavalli, maiali, roditori e nell’ambiente, ad esempio nel suolo,
nell’acqua, nei sedimenti [3].
Su agar sangue le colonie non sono emolitiche (gamma emolisi), si presentano di colore
grigio-giallognolo e superficie lucente, rotonde con bordi frastagliati. L’odore è inconfondibile:
simile a “sudore di cavallo” [3].
3.2 Patogenicità, fattori di virulenza e CDAD (Clostridium difficile associated disease) Il C. difficile è la causa principale, in ambito ospedaliero, di CDAD (Clostridium difficile
associated disease) anche se normalmente non è un batterio invasivo. Questa patologia è
associata all’assunzione di antimicrobici di tutte le classi (in particolare ampicillina,
cefalosporine e clidamicina), chemioterapici ed antitumorali. I pazienti più comunemente
colpiti sono anziani, immunocompromessi, pazienti che hanno subito operazioni chirurgiche al
tratto gastrointestinale e pazienti ospedalizzati o degenti in case di cura [2] [3].
Negli ultimi anni il C. difficile è diventato protagonista di molte infezioni comunitarie. In questi
casi i fattori di rischio non sono sempre collegabili all’uso di antibiotici o ad un
ospedalizzazione precedente come dimostrato nel lavoro di Kujiper e van Dissel [5] nel quale
in 33 pazienti che avevano contratto l’infezione, 8 (24%) non avevano assunto nessuna cura
antibiotica nei 3 mesi precedenti l’inizio dei sintomi. E’ quindi necessario individuare i fattori di
rischio e le vie di trasmissione per la malattia comunitaria. Alcuni studi si sono occupati degli
animali (anche quelli domestici), che sono un serbatoio molto importante e che spesso
albergano ceppi molto simili a quelli isolati nell’uomo [5].
I due principali fattori di virulenza del C. difficile sono la tossina A (tcdA) e la tossina B (tcdB)
che modulano diversi eventi fisiologici nella cellula e causano la malattia. Le tossine entrano
nella cellula mediante endocitosi causando la disorganizzazione del citoscheletro e morte
cellulare.
La tossina A è un’enterotossina che causa necrosi delle cellule epiteliali intestinali, aumento
della permeabilità, secrezione di liquidi e reclutamento di neutrofili che portando alla
formazione di pseudomembrane. La tossina B è una citotossina che innesca l’apoptosi.
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e in alimenti pronti al consumo
Il C. difficile produce anche una terza tossina chiamata tossina binaria (CDT) che aumenta la
virulenza del ceppo. Il meccanismo di azione di questa tossina non è tuttora chiaro ma si sa
che non è relazionata con le tossine A e B [1].
Il C. difficile è stato isolato per la prima volta nel 1935 ma fino agli anni ’70 non è stato
considerato patogeno [3]. In seguito, è stato identificato come causa di diarrea associata a
terapia antibiotica e colite pseudomembranosa. Oggi il 25% delle diarree associate all’uso di
antibiotici è causato dal C. difficile. Solitamente la diarrea è di carattere benigno senza crampi
addominali e potrebbe cessare terminando la cura antibiotica in corso; in alcuni casi invece
evolve a colite, colite pseudomembranosa, megacolon tossico fino alla perforazione
dell’intestino. Neonati e bambini portano il C. difficile nelle feci ma non hanno nessun tipo di
sintomo. La condizione predisponente principale che permette lo sviluppo del C. difficile è la
distruzione della flora normale del colon causata normalmente dall’uso di antibiotici,
immunosoppressori o chemioterapici. La contaminazione avviene per via oro-fecale; le spore
ingerite sopravvivono alla barriera acida dello stomaco e germinano nel colon [6].
Uno studio ha dimostrato che l’uso di medicamenti gastrici per la soppressione di acido sono
un fattore di rischio per contrarre la CDAD a causa dell’indebolimento della barriera acida [7].
3.3 Trasmissione e prevenzione Il clostridio produce delle spore che persistono per anni nell’ambiente divenendo una delle
contaminazioni più comuni in ambito sanitario [5].
Le spore sono molto resistenti al calore e all’alcool; in ambito ospedaliero il veicolo principale
conosciuto dell’infezione da C. difficile sono le mani. E’ importante lavarle in modo accurato
con il sapone ogni volta che si entra in contatto con un paziente, poiché la sola disinfezione
con alcool non è sufficiente per eliminare le spore. Se è possibile il paziente affetto da CDAD
deve essere isolato ed il personale medico ed infermieristico deve indossare camice e guanti
quando vengono svolte le cure. La trasmissione tra paziente e paziente è comune e spesso si
riescono ad isolare le spore del batterio anche sulle mani, sui vestiti e stetoscopi usati dal
personale sanitario [2][6].
Oltre alla disinfezione della mani è importante stare attenti ad endoscopi o altri strumenti che
possono trasportare spore. La decontaminazione deve essere eseguita con disinfettanti
sporicidi o in autoclave [8].
3.4 Resistenza e trattamento Il C. difficile può essere resistente ad antibiotici come cloramfenicolo, tetraciclina e
eritromicina [3].
In caso di CDAD bisogna sospendere la cura antibiotica in corso ed, in alcuni casi, questo
provvedimento è sufficiente per far cessare la diarrea. Se la malattia non dovesse cessare si
somministra un antibiotico attivo su C. difficile come vancomicina o metronidazolo [2].
3.5 Il C. difficile negli alimenti L’infezione comunitaria da C. difficile sta diventando un problema serio; di conseguenza si
stanno cercando le possibili fonti di contaminazione.
Si sa che il C. difficile è un batterio ambientale che si trova nel terreno e nell’intestino di molti
animali. Per questo motivo si analizzano alimenti di origine animale e vegetale. Sono stati
effettuati diversi studi su alimenti come carne di origine varia ed insalate pronte al consumo,
con risultati discordanti. La discordanza dei risultati è in parte dovuta al metodo: oggi non
esiste un metodo standard che permetta la ricerca di C. difficile negli alimenti. Infatti in ogni
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studio effettuato sono state usate metodiche differenti. Ad esempio in Svizzera è stato
effettuato uno studio su 46 carni (manzo e maiale): tutti e 46 i campioni sono risultati negativi
[9]. Negli USA invece è stato effettuato uno studio su 88 carni di origine varia e ben il 42%
(37) dei campioni è risultato positivo per la presenza di C. difficile [10].
Su un totale di 1140 alimenti analizzati in diversi studi, in media l’8% (96) dei campioni sono
risultati positivi alla presenza di C. difficile [9][10][11][12][13][14][15].
4. Scopo del lavoro Il C. difficile è considerato il principale agente patogeno di diarree in ambito nosocomiale. In
molti paesi però si sono constatate infezioni comunitarie non associate all’assunzione di
antibiotici. In Ticino non si conoscono dati relativi alla malattia comunitaria.
Una possibile fonte di contaminazione da C. difficile nella popolazione non ospedalizzata
potrebbe essere il cibo.
Nello studio si è voluto stabilire se alcuni alimenti pronti al consumo, in particolare insaccati
crudi e insalata, potessero rappresentare una fonte di contaminazione per l’essere umano.
Nell’eventualità di poter confrontare i ceppi rilevati negli alimenti con i ceppi risultati positivi al
C. difficile isolati nel 2010 e 2011 nel reparto di batteriologia presso ICM di Bellinzona, questi
ultimi sono stati tipizzati. Si potrebbe speculare che il cibo possa essere una fonte di
contaminazione se ci fosse una correlazione molecolare tra i ceppi clinici e da alimenti.
5. Materiali e metodi
5.1 Alimenti lo studio ha previsto la ricerca di C. difficile in insaccati da consumare prevalentemente crudi e
insalata. Tutti i prelievi sono stati eseguiti dagli ispettori del Laboratorio Cantonale su tutto il
territorio ticinese. Gli insaccati crudi comprendono: salame, salametto, mortadella, luganiga e
luganighetta. Il prelievo degli ispettori è stato eseguito tra febbraio e luglio 2011 con la
raccolta di 40 campioni in supermercati e macellerie. Le insalate analizzate sono lavate,
pretagliate, imballate e pronte al consumo. I 10 campioni sono stati raccolti tra febbraio e
maggio 2011, e provenivano da supermercati del territorio.
5.1.1 Preparazione dei terreni Materiale:
 Cooked meat medium (Biolife, Italia) (allegato 1)
 Brain heart infusion (Oxoid, UK) (allegato 2)
 Sodim Taurocholate Hydrate (Sigma, Svizzera) (allegato 3)
 Clostridium difficile selective supplement (Oxoid, UK) (allegato 4)
 Acqua Milli-Q, Millipore, (Noionaqua Sagl, Svizzera)
 Contenitori bottiglie di vetro da 1 litro per Brain heart infusion
 Contenitori bottiglie di vetro da 50 ml per Cooked meat medium
 Agitatore
 Autoclave
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e in alimenti pronti al consumo
Protocollo Coocked meat medium (CMM):
 Pesare 2 g di CMM e versare in 20 ml di acqua Milli-Q
 Il terreno deve essere messo in autoclave per essere sterilizzato prima dell’utilizzo
 Conservare a 4°C
Protocollo Brain heart infusion (BHI):
1. Aggiungere 47 g di BHI e 1 litro di acqua Milli-Q
2. Sciogliere con l’agitatore
3. Aggiungere 1 g di sodium taurocholate hydrate
4. Sciogliere sull’agitatore
5. Autoclavare
6. Una volta che il brodo è raffreddato dobbiamo aggiungere l’antibiotico (1 antibiotico per
500 ml di BHI):
a. Antibiotico liofilizzato (Clostridium difficile selective supplement)
b. Ricostituire con 2 ml di H2O sterile
c. Versare l’antibiotico nel brodo
7. Conservare a 4°C
5.1.2 Preparazione della soluzione di spore Per stabilire la sensibilità del metodo abbiamo contaminato gli alimenti direttamente con le
spore provenienti dal ribotipo di referenza 029 (A+B+CDT-).
Materiale:




Ceppo di riferimento 029 (ICM)
Thioglicolato (BBL, USA )(allegato 5)
NaCl (allegato 6)
Agar Sangue COL-S Columbia 5% SB 067689 (Becton Dickinson, Svizzera)
Protocollo preparazione soluzione di spore:
1. Scongelare in brodo thiglicolato il ceppo 029
2. Incubare in anaerobiosi a 37°C per 7-10 giorni
3. Dopo incubazione eseguire alcool shock:
a. Prelevare del brodo (da 3 a 6 ml) e inserirlo in un tubo Falcon da 50 ml con
etanolo 70% in rapporto 1:1
b. Lasciare a temperatura ambiente per 50-60 minuti su agitatore
c. Centrifugare a 3’800 rpm per 10 minuti
d. Risospendere il sedimento con NaCl in proporzione 1:1
4. Eseguire diluizioni seriali: 10-1, 10-2, 10-3,10-4
5. Inseminare 100 µl di ogni diluizione su Agar Sangue e incubare per 24-48 ore in
anaerobiosi a 37°C per 24-48 ore.
6. Contare CFU (devono essere minimo di 30 e massimo di 300)
Dopo aver contato le CFU bisogna eseguire una serie di calcoli per conoscere il numero di
spore in sospensione (ml) e quindi stabilire il volume necessario per contaminare (allegato 7).
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Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
5.1.3 Preparazione dei campioni da analizzare
Materiale
 Coltello
 Tagliere
 Cucchiaio
 Pinzetta
 Sacchetto sterile: Seward stomacher lab system standard bags classic 400 (Seward,
UK)
 Incubatore 80°C
 Incubatore 60°C
 Camera anaerobiosi
 Fiamma
 Sigma Laboratory Centrifughe (Sigma, Svizzera)
 Tubi Falcon 50 ml CELLSTAR®Tubes (Greiner bio-one, Germania)
 CLO 90 mm 43 431 (Biomérieux, Svizzera)
 Agar Sangue COL-S Columbia 5% SB 067689 (Becton Dickinson, Svizzera)
Salame: Tagliare il salame in pezzi molto piccoli con il coltello (sterilizzato alla fiamma), usare
come piano di lavoro un tagliere ricoperto con un sacchetto di plastica sterile.
Insalata pronto al consumo: se necessario tagliare a pezzi piccoli con un coltello (sterilizzato
alla fiamma).
Protocollo del metodo che utilizza BHI:
1. Aggiungere 10 g di alimento in 30 ml di brodo
2. Incubare in anaerobiosi da 10 a 15 giorni
3. Dopo incubazione eseguire l’alcool shock:
a. Prelevare del brodo (da 3 a 6 ml) e inserirlo in un tubo Falcon da 50 ml con
etanolo 70% in rapporto 1:1
b. Lasciare a temperatura ambiente per 50-60 minuti su agitatore
c. Centrifugare a 3’800 rpm per 10 minuti
d. Eliminare il surnatante
4. Inseminare il sedimento su piastra CLO selettiva per C. difficile
5. Incubare in anaerobiosi a 37°C per 48 -72 ore
Protocollo del metodo che utilizza CMM:
1. Aggiungere 10 grammi di alimento in 20 ml di CMM
a. Incubazione a 80°C per 10 minuti
b. Incubare in anaerobiosi a 37°C per 7 giorni
2. Dopo eseguire l’alcool shock: vedi punto 3 del protocollo precedente
3. Inseminare il sedimento su piastra CLO selettiva per C. difficile
4. Incubare a 37°C in anaerobiosi per 48-72h
Grazie all’incubazione a 80°C si selezionando solo le spore del C. difficile presente nel
campione. Con l’alcool shock si selezionano le spore, eliminando le cellule in fase vegetativa.
Dopo incubazione le colonie sospette vengono isolate su Agar Sangue ed incubate sia in
anaerobiosi che in aerobiosi per 24-48 ore. Il C. difficile deve crescere solo in anaerobiosi.
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5.1.4 Estrazione diretta di DNA da brodo in caso di crescita negativa In caso di crescita negativa su piastra si esegue un’estrazione direttamente dal brodo di
coltura per accertarsi che realmente non ci sia la presenza di C. difficile.
Materiale:
 QIAamp® DNA Stool Mini Kit (50) (Qiagen, Svizzera)
 Centrifuge 54172 R (Eppendorf, Svizzera)
 Tubi 2 ml sterili, (Eppendorf, Svizzera)
 Tubi 1.5 ml sterile, (Eppendorf, Svizzera)
 Ghiaccio
 Vortex
 Incubatore 70°C
Protocollo estrazione diretta da brodo:
1. Depositare 200 µl di brodo in un tubo da 2 ml
2. Immergere la provetta nel ghiaccio
3. Aggiungere 1.4 ml di Buffer ASL
4. Vortex per 1 minuto
5. Incubare il campione per 5 minuti a 70°C
6. Vortex per 1 minuto
7. Centrifugare a 14'000 rpm per 1 minuto
8. Depositare 1.2 ml di surnatante in un nuovo tubo da 2 ml ed eliminare il sedimento
9. Aggiungere 1 pastiglia InhibitEX
10. Vortex per 1 minuto fino a quando la pastiglia non si sia sciolta completamente
11. Incubare 1 minuto a temperatura ambiente
12. Centrifugare a 14'000 rpm per 3 minuti
13. Depositare il surnatante in un nuovo tubo da 1.5 ml
14. Centrifugare a 14'000 rpm per 3 minuti
15. Depositare 15 µl di proteinasi K in un nuovo tubo da 1.5 ml
16. Prelevare 200 µl dalla centrifugazione precedente e inserire nel nuovo tubo con la
poteinasi K
17. Aggiungere 200 µl di Buffer AL
18. Vortex per 15 secondi
19. Incubare 10 minuti a 70°C
20. Aggiungere 200 µl di etanolo (96-100%)
21. Vortex
22. Aggiungere tutto il contenuto nella QIAamp spin column
23. Centrifugare a 14'000 rpm per 1 minuto e gettare il tubo contentente il filtrato
24. Spostare la colonna in un tubo pulito e aggiungere 500 µl di Buffer AW1
25. Centrifugare a 14'000 rpm per 1 minuto e gettare il tubo contenete il filtrato
26. Spostare la colonna in un tubo pulito e aggiungere 500 µl di Buffer AW2
27. Centrifugare a 14'000 rpm per 3 minuti e gettare il tubo contenente il filtrato
28. Spostare la colonna in un tubo pulito
29. Centrifugare a 14'000 rpm per 1 minuto
30. Trasferire la colonna in un tubo Eppendorf da 1.5 ml e aggiungere 200 µl di Buffer AE
31. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente
32. Centrifugare a 14'000 rpm per 1 minuto
33. Conservare a -20°C.
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e in alimenti pronti al consumo
5.1.5 Colorazione di Gram e catalasi Sulle colonie sospette vengono eseguiti la catalasi e la colorazione di Gram. Il C. difficile è un
batterio Gram positivo con catalasi negativa.
Materiale:
 Vetrini
 Ansa
 Acqua ossigenata H2O2 (allegato 8)
 NaCl (allegati 6)
 Violetto di Genziana (Fluka, Svizzera) (allegato 9)
 Lugol (Fluka, Svizzera) (allegato 10)
 Acetone-Alcool (Centazone, Svizzera) (allegato 11)
 Fucsina (Fluka, Svizzera) (allegato 12)
 Fiamma
Protocollo per il test della catalasi:
1. Prelevare una colonia e porla su un vetrino
2. Aggiungere sopra la colonia una goccia di acqua ossigenata
La catalasi risulta positiva quando la colonia forma delle bolle, se è negativa invece non si
presenterà nessuna reazione.
Protocollo della colorazione di Gram:
1. Su un vetrino depositare una goccia di NaCl
2. Prelevare e distribuire nella goccia con un ansa la colonia desiderata
3. Lasciar asciugare
4. Fissare alla fiamma per qualche secondo
5. Aggiungere violetto di genziana per 1 minuti
6. Sciacquare con acqua
7. Aggiungere il Lugol per 2 minuti
8. Sciacquare con acqua
9. Aggiungere Acetone e Alcol e lasciare agire per qualche secondo
10. Sciacquare con acqua
11. Aggiungere la Fucsina per 30 secondi
12. Sciacquare con acqua
13. Asciugare
Il C. difficile è un bacillo, solitamente corto, Gram positivo. A volte si possono notare le spore
che non vengono colorate.
5.2 Ceppi clinici Presso ICM il C. difficile viene isolato tramite una piastra selettiva di nome Brazier’s C. difficile
selective medium. In caso di crescita sulla piastra selettiva, per la conferma di C. difficile
vengono inseminate altre 2 piastre Agar Sangue, una viene incubata in aerobiosi ed una in
anaerobiosi entrambe a 37°C. Se la piastra in aerobiosi presenta una crescita non si tratta di
C. difficile. Se invece la coltura è positiva solo sulla piastra incubata in anaerobiosi si esegue
un test di agglutinazione con il C. difficile Test Kit (Oxoid, UK) che riconosce la proteina
glutammato deidrogenasi, specifico per il C. difficile [17].
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Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Sia le colture di C. difficile che il materiale fecale in analisi vengono testate per la presenza di
tossine. Il test permette di stabilire se il ceppo di C. difficile produce tossine, ma non permette
di stabilire quali siano presenti. Il kit usato si chiama Premier Toxins A&B della ditta Meridian
Bioscience Inc. (USA). Tutti i ceppi positivi da coltura per C. difficile, anche con tossine
negative, vengono congelati in Skim Milk (allegato 13) a -20°C nel reparto di igiene
ospedaliera. Le feci che risultano negative in coltura vengono tenute per un breve periodo in
congelatore prima di essere eliminate.
Per questo studio sono stati scongelati i ceppi patogeni isolati da materiale fecale identificati
dal laboratorio nel 2010 e nel 2011. I ceppi vengono inseminati su Agar Sangue e messi ad
incubare in anaerobiosi per 48-72 ore.
Sia i ceppi clinici che quelli di origine alimentare sono stati analizzati tramite PCR per la
messa in evidenza del tossinotipo e della PCR ribotipo mediante le manipolazioni dettagliate
di seguito.
5.3 Estrazione DNA L’estrazione avviene da colonie di C. difficile isolate su AS con il kit InstaGene™Matrix di
Biorad secondo la metodologia fornita. Le cellule vengono lisate, si aggiunge una matrice che
assorbe i resti della cellula (membrana batterica, polisaccaridi e proteine) e che mediante
centrifugazione, li trascina sul fondo, lasciando li DNA purificato nel surnatante.
Materiale:
 InstaGene™Matrix (Bio-Rad, Svizzera)
 Tubi 1.5 ml sterili (Eppendorf, Svizzera)
 Ansa
 Incubatore 56°C
 Incubatore 100°C
 Centrifuge 54172 R (Eppendorf, Svizzera)
 Vortex
Protocollo:
1. Aggiungere 1 ml di acqua sterile autoclavata in un tubo da1.5 ml
2. Prelevare una colonia e stemperarla nell’acqua
3. Centrifugare 12'000 rpm per 1 minuto
4. Eliminare surnatante
5. Aggiungere 200 ml µl di IstaGene™ Matrix
6. Incubare a 56°C per 30 minuti
7. Vortex per 10 secondi
8. Incubare a 100°C per 8 minuti
9. Vortex per 10 secondi
10. Centrifugare a 10'000 rpm per 3 minuti
11. Conservare l’estratto di DNA a -20°C.
13
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
5.4 Reazioni PCR per gluD e tossine Vengono eseguite 2 PCR multiplex, in una vengono messi i primer per rilevare il gene per la
tossina B (tcdBs e tcdBas) e per la glutammato deidrogenasi (GluDs e GluDas). Nella
seconda PCR, invece, con una coppia di primer (CLDs e CLDas) rivela la presenza del gene
A, amplificando una regione del gene piuttosto conservata mentre la seconda coppia di
primers (CLDToxAs e CLDToxAas) è complementare ad una regione più variabile che
contiene delle sequenze oligopeptidiche ripetute. Questi primers permettono di identificare la
più comune delezione del gene A che avviene proprio all’interno di queste zona. Dal punto di
vista fenotipico i ceppi che presentano questa delezione non producono la tossina A.
CLDToxA
Primer CLDToxA
Primer CLDToxA
Figura 1: L'immagine mostra una regione del gene della tossina A, che contiene le sequenze
ripetute, lunga 2'535 bp: il primer CLDToxA amplifica per la mutazione più comune. La
mutazione consiste in una delezione di 1'821 bp (nel disegno sono indicate in bianco) che porta
alla formazione di una sequenza lunga 714 bp [16].
Materiale:
 QIAGEN Multiplex 2x PCR Kit (1000), (Qiagen, Svizzera) (allegato 14)
 Primer mix 1
o tcd BS 10 µM (Microsynth, Svizzera)
o tcd BAS 10 µM (Microsynth, Svizzera)
o GluDS 10 µM (Microsynth, Svizzera)
o gluDAS 10 µM (Microsynth, Svizzera)
 Primer mix 2
o CLDToxAS 10 µM (Microsynth, Svizzera)
o CLDToxAas 10 µM (Microsynth, Svizzera)
o CLDs 10 µM (Microsynth, Svizzera)
o CLDAS 10 µM (Microsynth, Svizzera)
 H2O RNAase free
 Applied Biosystem VERITI 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA)
14
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Tabella 1: Primer utilizzati nella reazione
Nome
Sequenza
Referenza
tcdBs forward
5’-GTGTAGCAATGAAAGTCCAAGTTTACGC-3’
tcdBas reverse
5’-CACTTAGCTCTTTGATTGCTGCACCT-3’
gluDs forward
5’-GTCTTGGATGGTTGATGAGTAC-3’
gluDas reverse
5’-TTCCTAATTTAGCAGCAGCTTC-3’
CLDtoxAs forward
5’-TTTTGATCCTATAGAATCTAACTTAGTAAC-3’
CLDtoxAas reverse
5’-CCACCAGCTGCAGCCATA-3’
CLDs forward
5’-TGTTGGAATAGGTGCTGAAG-3’
CLDAs reverse
5’-AGATGGAGATGAGAAAAAGTGA-3’
[16]
[17]
[16]
Tox A in
house
(LUMC)*
* I primers per amplificare il gene della tossina A sono stati disegnati al centro di referenza per
il Clostridium difficile in Olanda al Leiden University Medical Centre.
Protocollo:
Tabella 2: Volume per il mix di reazione per la multiplex PCR GluD e tossina B e per PCR tossina
A
Per un campione:
GluD e TcdB
TcdA
Master Mix 2x
12.5 µl
12.5 µl
Primer Mix 1
2.5 µl
Primer Mix 2
2.5 µl
H2O RNAse free
7.5 µl
7.5 µl
DNA campione
2.5 µl
2.5 µl
Totale
25 µl
25 µl
Il programma del termociclatore è composto da 15 minuti a 95°C seguito da 11 cicli dove la
temperatura di annealing parte da 65°C e finisce a 55°C diminuendo 1°C ogni ciclo. Gli 11
cicli sono composti da: denaturazione per 30 secondi a 95°C, annealing per 30 secondi a 6555°C e elongazione per 30 secondi a 72°C. Successivamente il programma è composto da
altri 29 cicli: denaturazione per 30 secondi a 95°C, annealing per 30 secondi a 55°C,
elongazione per 30 secondi a 72°C ed un estensione finale per 7 minuti a 72°C. [18]
15
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
5.5 Messa in evidenza del prodotto PCR Materiale:
 Resophor agarose hight resolution (Eurobio, Fancia)
 TBE 1x (allegato 15)
 DNA Molecular Weight Marker XIV 100 base pair ladder, (Roche, Svizzera) (allegato
16)
 Loading buffer 6x (allegato 17)
 GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain (Biotium, USA) (allegato 18)
 Microonde
 Beuta
Protocollo:
1. Pesare 1.5 g di agarosio
2. Sciogliere nel microonde l’agarosio in una beuta con 100 ml di TBE 1x (portare a
ebollizione)
3. Raffreddare
4. Aggiungere 10 µl di GelRed (10 µl per 100 ml di soluzione)
5. Versare il gel nello stampo
Nella migrazione viene caricato un marcatore di massa molecolare, un controllo negativo ed
uno positivo (ribotipo 027) ed i campioni.
Tabella 3: Volume da caricare su gel per elettroforesi
Campione controlli
Campione/controlli
10 µl
Loading buffer 6x (allegato)
2 µl
Marcatore di massa molecolare
Volume da caricare
Peso molecolare
10 µl
12 µl
10 µl
Il gel viene fatto migrare a 150 V per circa 40 minuti. Se il campione è positivo per la gluD si
ottiene una banda a 158 bp, per la tossina B invece a 200 bp. La presenza della tossina A è
indicata da una banda a 369 bp, mentre la presenza della delezione della tossina A da una
banda a 714 bp.
16
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Ladder
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Delezione gene A (714 bp)
TcdA (369 bp)
Tossina A
Ladder
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
TcdB (200 bp)
gluD (158 bp)
Tossina B e GluD
Figura: 2 Risultato PCR multiplex per il gene della gluD e i geni delle tossine: nel pozzetto
numero 1 fino al numero 13 sono stati inseriti i campioni provenienti da pazienti. Al centro
troviamo il marcatore di massa molecolare con scala da 100 bp. Il campione 14 è il controllo
positivo, mentre il 15 è il controllo negativo. Il campione 3 e 8 sono C. difficile ma non
producono nessuna tossina. Il campione 4 presenta la mutazione della tossina A. Il campione 7
invece non è un C. difficile.
5.6 Ribotipo PCR Il ribotipo si basa sulla presenza nel cromosoma batterico, di numerosi alleli dell’operone
rRNA che è costituito da: una subunità 16S, una regione intergenica una subunità 23S; ogni
allele differisce dall’altro per la diversa lunghezza della regione intergenica situata tra le due
subunità. Mediante PCR viene amplificata questa regione e si ottengono tanti frammenti di
DNA di diverse lunghezze. [19]
16S
Spazio intergenico
Primer 16S
23S
Primer 23S
Figura 3: rappresentazione dell’operone rRNA; mediante i due primer 16S e 23S si amplifica lo
spazio intergenico.
Materiale:
 Taq PCR Master Mix 2x Kit 1000 units (Qiagen, Svizzera) (allegato 19)
 Closd 16s 10 µM (Microsynth, Svizzera)
 Closd 23s 10 µM (Microsynth, Svizzera)
 H2O RNAase free
 Applied Biosystem VERITI 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystem, USA)
17
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Tabella 4: Primer utilizzati nella reazione
Nome
Sequenza
Referenza
Closd 16S
5’-GTGCGGCTGGATCACCTCCT-3’
Closd 23S
5’-CCCTGCACCCTTAATAACTTGACC-3’
[20]
Tabella 5: Volume per il mix di reazione per PCR ribotyping
Per un campione
Master Mix 2x
12.5 µl
Primer 16s
0.75 µl
Primer 23s
0.75 µl
H2O RNAse free
8.5 µl
DNA campione
2.5 µl
Totale
25 µl
Il programma è composto da 6 minuti a 95°C seguito da 35 cicli composti da: denaturazione
per 1 minuti a 94°C, annealing 1 minuto a 57°C, elongazione per 1 minuto a 72°C ed un
estensione finale a 72°C per 7 minuti. [19]
5.7 Messa in evidenza del prodotto PCR Vedi protocollo 5.5: pesare 3,75 g di agarosio e sciogliere in 250 ml di TBE 1x.
Il gel viene fatto migrare a 150 V per circa 5 ore. Tutti i risultati vengono analizzati con il
programma informatico BioNumerics versione 6.01 (Applied Maths, Belgio). Il programma
permette di standardizzare i gel e confrontare le bande con una banca dati esistente per
stabilire il ribotipo.
18
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Figura 4: Risultato PCR ribotipo di alcuni ceppi clinici: nel primo e nell’ultimo pozzetto vengono
inseriti marcatori di massa molecolare con scala da 100 bp. Il campione numero 1 è compatibile
con il riboprofilo 106, i profili dei campioni 2, 3, 7, 9, 10, 11 non sono presenti nella banca
dell’Istituto. I campioni 4 e 6 corrispondono al ripotipo 001, il campione 5 al ribotipo 050, il
campione 8 al ribotipo 126. In penultima posizione invece abbiamo inserito un controllo
negativo (CN).
5.8 PCR per la tossina binaria La PCR permette di determinare la presenza della tossina binaria mediante due primer che
amplificano la subunità A (CDTA F e CDTA R) e la subunità B (CDTB F CDTB R). [20]
Primer CDTA
Primer CDTB
Figura 5: Gene della tossina binaria, la coppia di primer per la subunità A aplificheranno la
regione cdtA, mentre la coppia di primer per la subunità B amplificheranno la regione cdtB [21]
Materiale:
 Taq PCR Master Mix 2x Kit 1000 units, (Qiagen, Svizzera) (allegato 19)
 CDTA F 10 µM (Microsynth, Svizzera)
 CDTA R 10 µM (Microsynth, Svizzera)
 CDTB F 10 µM (Microsynth, Svizzera)
 CDTB R 10 µM (Microsynth, Svizzera)
 H2O RNAase free
 Applied Bioyistem VERITI 96 Well Thermal Cycler ( Applied Byosistem, USA)
19
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Tabella 6: Primer utilizzati nella reazione:
Primer
Seguenza
CDTA F forward
5’-3TGAACCTGGAAAAGGTGATG-3’
CDTA R reverse
5’-AGGATTATTTACTGGACCATTTG-3’
CDTB F forward
5’-CTTAATGCAAGTAAATACTGAG-3’
Referenza
[22]
[22]
CDTB R reverse
5’-AACGGATCTCTTGCTTCAGTC-3’
Tabella 7: Volume per il mix di reazione per PCR tossina binaria
Per un campione:
Sub unità A
Sub unità B
Master Mix 2x
25 µl
25 µl
CDTA F
1.5 µl
CDTA R
1.5 µl
CDTB F
1.5 µl
CDTB R
1.5 µl
H2O RNAse free
17 µl
17 µl
DNA campione
5 µl
5 µl
50 µl
50 µl
Totale
Il programma è composto da 5 minuti a 95°C seguito da 30 cicli composti da: denaturazione
per 45 secondi a 94°C, annealing 1 minuto a 52°C, elongazione per 1 minuto a 72°C ed un
estensione finale a 72°C per 7 minuti.[21]
5.9 Messa in evidenza del prodotto PCR Vedi protocollo 5.5
Il gel viene fatto migrare a 150 Volt per circa 40 minuti. La positività della tossina binaria è
data dalla presenza della subunità A, a 327 bp, e dalla subunità B a 451bp.
20
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Subunità A (327bp)
Subunità B (451 bp)
Figura 6: Risultato della PCR per la tossina binaria: il campione 1 e 2 risultano negativi, il
campione 3 invece è positivo per la tossina binaria come pure il campione 6. Il campione 4
corrisponde al controllo negativo, mentre il 5 al controllo positivo. Al centro troviamo il
marcatore di massa molecolare con scala da 100bp.
6. Risultati e discussione 6.1 Studio preliminare, confronto e scelta dei metodi di coltura In primo luogo abbiamo eseguito uno studio preliminare, utilizzando dei campioni non ufficiali
(campioni che non fanno parte della campagna di prelevamento), che ha permesso di testare
quale dei due metodi utilizzati (metodo con cooked meat medium e metodo con brain heart
infusion) fosse più sensibile nella rivelazione di spore di C. difficile. Gli alimenti sono stati
contaminati direttamente, con quantitativi diversi, con spore provenienti da un ceppo con
ribotipo 029 (A+B+CDT-).
I cibi, dopo essere stati inseriti nel brodo, vengono contaminati con le spore. Dopo
incubazione, viene eseguito l’alcool shock per eliminare tutte le cellule in fase vegetativa
contenute nel campione: il sedimento viene poi inseminato su piastra CLO selettiva per C.
difficile. Se dopo 48 ore di incubazione a 37°C in anaerobiosi la crescita risulta positiva si
prosegue con le analisi molecolari sopra descritte per confermare la presenza del ceppo con
ribotipo 029 usato per contaminare gli alimenti.
21
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Tabella 8: Tabella riassuntiva dello studio preliminare sulla carne eseguito per determinare la
sensibilità del metodo:
Campione
Metodo
Contaminazione
BHI
Carne 1
Crescita
ANA
gluD
TcdA
TcdB
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo Negativo Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
029
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
029
Negativo
Negativo Negativo Negativo
10’000 per g
CMM
BHI
Carne 2
029
5’000 per g
CMM
BHI
Carne 3
Ribotipo
029
029
1’000 per g
CMM
BHI
Carne 4
-
500 per g
CMM
BHI
Carne 5
50 per g
CMM
BHI = Brain heart infusion
- = non eseguito
CMM = Cooked meat medium
-
ANA = anaerobiosi
Entrambi i metodi hanno evidenziato una buona sensibilità di detezione del C. difficile fino alla
contaminazione con 5'000 spore per grammo. Il metodo che utilizza Brain heart infusion,
riesce a rilevare la presenza del patogeno fino a una contaminazione di 50 spore per grammo.
Tabella 9: Tabella riassuntiva dello studio preliminare sull’insalata eseguito per determinare la
sensibilità del metodo
Campioni
Metodo
Insalata
1
BHI
Insalata
2
Insalata
3
Contaminazione
Crescita
ANA
gluD
TcdA
TcdB
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo Negativo Negativo
Negativo
Negativo Negativo Negativo
10’000 per g
CMM
BHI
029
5’000 per g
CMM
BHI
029
1’000 per g
CMM
BHI = Brain heart infusion
- = non eseguito
Ribotipo
-
CMM = Cooked meat medium
ANA = anaerobiosi
22
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
La sensibilità di detezione del patogeno riscontrata nelle insalate risulta essere di 5'000 spore
per grammo con entrambi i metodi. Con una contaminazione di 1'000 spore per grammo si
ottengono risultati negativi con entrambi i metodi.
Entrambi i metodi sono riusciti a rilevare la presenza di C. difficile con una contaminazione di
5'000 spore per grammo, sia nella carne che nell’ insalata. E’ stato quindi deciso di
contaminare tutti gli alimenti con 5'000 spore per grammo, visto che al di sotto di questa soglia
il ritrovamento di C. difficile non è certo.
A causa del basso numero di campioni preliminari e dei risultati discordanti degli studi
pubblicati non abbiamo voluto scegliere un metodo unico ed abbiamo quindi continuato il
lavoro utilizzando entrambi i metodi in parallelo.
6.2 Studio di campioni di alimenti Tutti i campioni ufficiali sono stati raccolti dagli Ispettori del Laboratorio Cantonale e messi in
coltura con entrambi i metodi sopra citati. Ogni campione è stato suddiviso in due parti in
modo da utilizzarne una come controllo positivo, contaminandola con 5'000 spore per
grammo. Le tabelle completi dei risultati di carne e insalata sono in allegato (allegato 20).
Tabella 10: tabella riassuntiva degli alimenti ufficiali
Metodo
Alimento
Crescita su terreno
selettivo
Risultato PCR dopo
estrazione DNA da
brodo
BHI
27 insaccati
Negativo
Negativo
BHI
7 insalate
Negativo
Negativo
CMM
27 insaccati
Negativo
Negativo
CMM
7 insalate
Negativo
Negativo
BHI = Brain heart infusion
CMM = Cooked meat medium
Tabella 11: tabella riassuntiva degli alimenti ufficiali usati come controllo positivo
Risultato PCR dopo
estrazione DNA da
brodo
Metodo
Alimento
Crescita positiva su
terreno selettivo
BHI
27 insaccati
22 positivi
0 positivi
BHI
7 insalate
5 positivi
-
CMM
27 insaccati
16 positivi
5 positivi
CMM
7 insalate
6 positivi
1 positivo
BHI = Brain heart infusion
- = analisi non effettuata
CMM = Cooked meat medium
23
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
I 27 insaccati crudi sono risultati tutti negativi. Da nessuno di esso è stato possibile isolare il
C. difficile. I controlli positivi mostrano risultati discordanti. Dei 27 campioni analizzati con il
metodo Brain heat infusion contaminati con 5'000 spore per grammo, 5 non hanno mostrato
nessuna crescita in coltura. Anche per 5 di questi l’analisi tramite PCR è risultata negativa nei
5 campioni per i quali è stata effettuata. Per quanto concerne i campioni contaminati analizzati
con il metodo Cooked meat medium, risulta che per 11 campioni non è stato possibile
ottenere una coltura positiva. Anche per questi campioni è stata effettuata l’estrazione di DNA
direttamente dal brodo di crescita per verificare tramite PCR la presenza di C. difficile. Il
metodo molecolare ha permesso di confermare la presenza di C. difficile solo in 5 degli 11
campioni.
I 7 campioni ufficiali di insalata sono risultati negativi per C. difficile .Il metodo basato sul Brain
heat infusion ha rilevato la presenza di C. difficile in 5 dei 7 campioni di insalata contaminati
con 5'000 spore per grammo. Al momento della stesura dei risultati, l’analisi tramite PCR non
era stata eseguita. Il metodo che utilizza Cooked meat medium ha rilevato la contaminazione
in 6 campioni su 7; il campione negativo per la crescita in coltura è però risultato positivo
tramite PCR dopo estrazione di DNA diretta da brodo.
Malgrado l’esiguo numero di campioni analizzati, i risultati sembrano indicare che il metodo
che utilizza Brain heat insufion sia più sensibile per i campioni di carne poiché è stato
possibile valutare correttamente il 79% dei campioni contaminati. I campioni contaminati
negativi in coltura però sono risultati tali anche dopo estrazione di DNA diretta dal brodo.
Il metodo Cooked meat medium invece, ha rilevato il C. difficile in 6 su 7 campioni di insalata
contaminati. Nell’unico campione contaminato risultato negativo in coltura è però stato
possibile mettere in evidenza C. difficile tramite PCR.
Nel tentativo di spiegare il risultato negativo dell’analisi tramite PCR degli alimenti contaminati,
abbiamo aggiunto del DNA sia all’estratto di DNA dal brodo di coltura che direttamente nel
brodo di coltura prima dell’estrazione. Nei due casi i risultati sono stati positivi escludendo
quindi sia possibili problemi del metodo PCR che problemi dovuti alla presenza di inibitori.
D’altra parte, non è sempre stato possibile mettere in evidenza il C. difficile tramite PCR nei
campioni di alimenti contaminati. E’ possibile che, forse a causa di un ambiente non
favorevole, le spore introdotte non siano germinate impedendo sia la crescita su piastra sia
un’estrazione ottimale di DNA. D’altra parte, non è possibile escludere una non omogenea
distribuzione delle spore immesse nel campione.
6.3 Analisi di campioni di origine clinica Lo studio comprendeva anche un indagine sui C. difficile di origine clinica. I campioni sono
stati isolati dal reparto di microbiologia dell’ICM di Bellinzona. Sono stati analizzati 83 ceppi
del 2010 mentre 26 ceppi erano del 2011 (analisi effettuate fino ad aprile 2011).
24
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Figura 7: il grafico mostra l’andamento dei ceppi clinici nel 2010 e nel 2011. Il ribotipo “?” sono
dei ribotipi vari che non sono stati identificati (nessuna referenza nella banca dati).
Il grafico mostra molto bene la prevalenza del C. difficile ribotipo 014 (A+B+CDT-) in Ticino; la
sua frequenza nel 2010 e all’inizio del 2011 è stata del 19%. Si noti anche che il ribotipo 018
(A+B+CDT-) nel 2010 ha avuto una frequenza del 5% (4 ceppi) mentre nei primi 4 mesi
dell’anno è stato isolato nel 19% (5 ceppi) dei casi. Queste frequenze potrebbero indicare una
piccola epidemia in corso. Nel periodo considerato, è stato possibile osservare che in Ticino
sono presenti anche i ribotipi 066, 078 e 126 che possiedono la tossina binaria positiva che
rende particolarmente patogeno il C. difficile.
25
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
7. Conclusioni Le fonti di contaminazione e i fattori predisponenti delle infezioni nosocomiali da C. difficile
sono ben conosciuti mentre poco si sa sull’origine delle infezioni comunitarie, la cui
prevalenza è in aumento.
Tra i serbatoi conosciuti di questi batteri anaerobi sporigeni predominano l’ambiente e gli
animali da reddito e di compagnia, ma recentemente, sono state indagate altre possibili fonti
di contaminazione quali gli alimenti.
La frequenza di isolamento di C. difficile negli alimenti varia da 0 al 45% circa a dipendenza
del tipo di alimento e della Nazione in cui si è svolto lo studio. Nell’unico studio svizzero a
nostra conoscenza [9] nessuno dei 46 campioni di carne analizzati è risultato positivo.
Anche i nostri risultati sono stati negativi ma solo un numero esiguo di campioni è stato
analizzato; per conclusioni statisticamente valide avremmo dovuto aumentare il numero di
campioni.
Malgrado le limitazioni menzionate, abbiamo potuto stabilire che il metodo che utilizza il Brain
heart infusion risulta più sensibile rispetto a quello con Cooked meat medium per la
rivelazione su piastra di C. difficile nei campioni di carne, mentre quest’ultimo sembra più
adatto all’analisi delle insalate. Possiamo perciò confermare le difficoltà già riscontrate da altri
autori per la ricerca di C. difficile negli alimenti.
Dai nostri dati preliminari, sembrerebbe che la ricerca tramite PCR di C. difficile nelle carni e
nelle insalate sia possibile; bisognerebbe però ottimizzare il metodo per un’estrazione ottimale
di DNA anche dalle spore e per una migliore omogeneizzazione dei campioni.
A causa del numero limitato di campioni analizzati, in questo studio non è stato possibile
stabilire se alimenti pronti al consumo come insaccati crudi ed insalate possano rappresentare
una causa di contaminazione da C. difficile in Ticino; sembra però che anche nell’impossibilità
di escluderla, questa origine sia poco probabile.
L’analisi dei ceppi di C. difficile isolati da pazienti nel periodo 2010-2011 mostra una netta
prevalenza di ceppi appartenenti al ribotipo 014 (A+B+CDT-), uno dei ribotipi più frequenti in
Europa. L’origine e/o il serbatoio di questo ribotipo resta ancora sconosciuto.
26
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
8. Ringraziamenti Ringrazio il direttore dell’Istituto Cantonale di Microbiologia Dr. Orlando Petrini per avermi dato
la possibilità di svolgere il mio lavoro di diploma presso l’istituto e il direttore del Laboratorio
Cantonale Dr. Marco Jermini per la preziosa collaborazione. Ringrazio la Dr.ssa Antonella
Demarta e Federica Mauri per avermi seguita durante il mio percorso, aiutandomi e dandomi
consigli.
Ringrazio la Dr.ssa Petra Giannini e tutto il team del Laboratorio Cantonale per la pazienza e
l’aiuto fornito.
Ringrazio anche la tecnica in analisi biomediche AnnaPaola Caminada per i numerosi
consigli.
Un grazie immenso anche a Nadia Ruggeri che ha saputo aiutarmi in un momento
particolarmente delicato.
Un grazie va a tutti i dipendenti dell’Istituto che anno animato ogni mia giornata lavorativa.
Ringrazio il direttore della Scuola Superiore Medico Tecnica di Locarno Andrea Boffini ed
i docenti Claudio Naiaretti e Giovanni Togni per tutti i consigli metodologici. Un
ringraziamento anche Susan Gilbert.
Ringrazio la mia famiglia e tutte le persone che mi hanno aiutato, sostenuto e sopportato
durante tutto il percorso formativo.
27
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
9. Bibliografia [1] Voth D.E., Ballard J.D., Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role in
disease. Clinical microbiology reviews, 2005;18:247-63
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challenges from an enstablished pathogen. Cleveland clinic journal of medicine, 2006;73:18797
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microbiology. 9th edition. Volume 1, 2007;889-910
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description of a new pathogenic anaerobe bacillus difficilis. American journal of diseases in
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28
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
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actin-specific ADP-ribosyltransferase (binary toxin) by strains of Clostridium difficile. FEMS
microbiology letters, 2000,186:307-12
29
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
10. Allegati
10.1 Allegato 1 http://www.biolifeit.com/biolife/upload/file/Documenti/56aeb910303.pdf ultima visita:
04.04.2011
Biolife
Italiana S.r.l. Scheda
Tecnica
N°401310 B I-2 9/2003 Pagina 1 di 1
Biolife Italiana S.r.l. Viale Monza 272, 20128 Milano. Tel. n° 02-25209.1, Fax n° 02-2576428,
E-mail: [email protected] ; sito Web: www.biolifeit.com
COOKED MEAT MEDIUM
Terreno d’uso generale per la crescita
ed il mantenimento di microrganismi aerobi ed anaerobi
FORMULA TIPICA (g/l)
Cuore di vitello, infuso da 454
Peptone 10
Estratto di carne 10
Sodio cloruro 5
Glucosio 2
PREPARAZIONE
Sospendere 10 g di particelle in 100 ml di acqua distillata, oppure 1 g in 10 ml in provetta. Lasciare assorbire per
circa 15 minuti, quindi sterilizzare a 121°C per 15 minuti. Raffreddare lentamente per evitare l’espulsione delle
particelle dai contenitori.
pH finale 7.2 ± 0.2
DESCRIZIONE
Cooked Meat Medium è un terreno indicato per la crescita di una larga varietà di microrganismi inclusi quelli a
sviluppo difficile, partendo anche da inoculi molto bassi. Il terreno mantiene vitali le cellule batteriche per lungo
tempo e per questo motivo è un eccellente substrato per il trasporto ed il mantenimento delle colture microbiche.
Il terreno può essere addizionato di glucosio, emina e vitamina K per la crescita rapida dei batteri anaerobi.
IMPIEGO
Per la coltivazione dei batteri anaerobi, bollire le provette che non sono state preparate in giornata, per eliminare
l’ossigeno disciolto. Inoculare pesantemente nella zona delle particelle di carne ed incubare a 35°C fino a 7
giorni in condizioni di anaerobiosi. I clostridi saccarolitici coltivano con produzione di gas e di acidi, i proteolitici
provocano una disgregazione delle particelle di carne e l’annerimento del terreno.
CONTROLLO QUALITÀ DELL’UTILIZZATORE
Controllo positivo di proteolisi
C.histolyticum ATCC 19401
Controllo positivo di saccarolisi
C.perfringens ATCC 13124
CONSERVAZIONE
Conservare a 10-30°C, in luogo asciutto. In queste condizioni Cooked Meat Medium è valido fino alla data di
scadenza indicata in etichetta. Non utilizzare oltre questa data. Eliminare se vi sono segni evidenti di
deterioramento della polvere (modifiche del colore, indurimento della polvere ecc.).
Conservare le provette preparate in laboratorio per un massimo di 7 giorni a 2-8°C. Bollire le provette che non
sono state preparate in giornata, per eliminare l’ossigeno disciolto.
PRECAUZIONI E SICUREZZA DEGLI OPERATORI
Il preparato qui descritto non è classificato come pericoloso ai sensi della legislazione vigente né contiene
sostanze pericolose in concentrazioni _1%. Come per tutti i terreni in polvere anche la manipolazione del
Cooked Meat Medium deve essere effettuata con una adeguata protezione delle vie respiratorie.
Il prodotto qui descritto è solo per uso diagnostico in vitro e deve essere usato in laboratorio, da operatori
adeguatamente addestrati, con metodi approvati di asepsi e di sicurezza nei confronti degli agenti patogeni.
Sterilizzare le provette dopo il loro uso e prima dell’eliminazione come rifiuto.
BIBLIOGRAFIA
• Robertson, M. (1916) J. Path. Bact. 20, 327-349
CONFEZIONE
4013102 Cooked Meat Medium, 500 g (50 l)
IVD
30
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
10.2 Allegato 2 http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM1135&org=133&c=UK&lang
=EN
ultima visita: 04.04.2011
BRAIN HEART INFUSION BROTH
Code: CM1135
A highly nutritious infusion medium recommended for the cultivation of streptococci, Neisseria and other
fastidious organisms.
Formula
gm/litre
Brain infusion solids
12.5
Beef heart infusion solids
5.0
Proteose peptone
10.0
Glucose
2.0
Sodium chloride
5.0
Disodium phosphate
2.5
pH 7.4 ± 0.2 @ 25°C
Directions
Dissolve 37g in 1 litre of distilled water. Mix well and distribute into final containers. Sterilize by autoclaving at
121°C for 15 minutes.
Description
A versatile liquid infusion medium which is suitable for the cultivation of streptococci, Neisseria and other
fastidious organisms, this medium is recommended for blood culture work and, with the additions described
below, for the isolation and cultivation of pathogenic fungi.
Oxoid Brain Heart Infusion Broth is essentially a buffered infusion broth, giving similar results to the brain
dextrose broths originally employed for the cultivation of streptococci1, and for the cultivation of dental
pathogens2. The addition of 0.1% agar will serve to reduce convection currents and so create conditions of
varying oxygen tension which favour the growth and primary isolation of aerobes and anaerobes3, while even
easily cultivated organisms show improved growth4.
Oxoid Brain Heart Infusion Broth was used in a test for the pathogenicity of streptococci5,6 and the same
medium was enriched with ascitic fluid for the cultivation of gonococci7. It is especially useful as a growth and
suspension medium for staphylococci which are to be tested for coagulase production; Newman8 employed a
similar medium for this purpose in an investigation of food poisoning caused by dairy products.
A satisfactory medium for blood culture can be prepared by adding 1g of agar per litre of Brain Heart Infusion
Broth. Ensure that the agar is uniformly distributed in the sterile broth before dispensing into bottles. More
conveniently, add one Agar Tablet (CM0049) to each 100ml of Brain Heart Infusion and sterilize by
31
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
autoclaving for 15 minutes at 121°C. Cool to 60-70°C and mix gently to ensure uniform distribution of the
agar.
Tubes of Oxoid Brain Heart Infusion Broth which are not used the same day as sterilized should be placed in
a boiling water bath for several minutes to remove absorbed oxygen, and cooled rapidly without shaking, just
before use.
Further supplements to improve the recovery of organisms from blood can be added before sterilization or
aseptically post-sterilization. Co-enzyme1 (NAD), penicillinase and p-amino benzoic acid are examples. Brain
Heart Infusion Broth supplemented with yeast extract, haemin and menadione was consistently better in
producing heavy growth of five species of Bacteroides than three standard anaerobic broths. Furthermore,
microscopy of overnight cultures showed normal morphology in Brain Heart Infusion Broth but abnormal
morphology in the three anaerobic broths9.
Storage conditions and Shelf life
Store the dehydrated medium at 10-30°C and use before the expiry date on the label.
Store tubed or bottled medium in the dark and below 20°C.
Appearance
Dehydrated medium: Straw coloured, free-flowing powder.
Prepared medium: Straw coloured solution.
Quality control
Positive controls
Expected results
Streptococcus pneumoniae ATCC® 6303*
Turbid growth
Candida albicans ATCC® 10231*
Turbid growth
Negative control
Uninoculated medium
No change
*This organism is available as a Culti-Loop®
References
1. Rosenow E. C. (1919) J. Dental Research l. 205-249.
2. Haden R. L. (1923) Arch. Internal Med. 32. 828-849.
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4. Falk C. R. et al. (1939) J. Bact. 37. 121-131.
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6. Chapman G. H. (1946) Am. J. Digestive Diseases 13. 105-107.
7. Reitzel R. J. and Kohl C. (1938) J. Am. Med. Assoc. 110. 1095-1098.
8. Newman R. W. (1950) J. Milk and Food Tech. 13. 226-233.
9. Eley A., Greenwood D. and O’Grady F
32
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
10.3 Allegato 3 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO
%7CBRAND_KEY&N4=86339%7CSIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC ultima visita:
04.04.2011, allegato in forma parziale
Description Other Notes
For the solubilization of unconjugated bilirubin1
Propriétés EQP level
http://www.sigmaaldrich.com/insite_enhanced_quality
Description
Anionic
Assay
≥97.0% (TLC)
optical activity
[α]20/D +23±1°, c = 3% in H2O (dry matter)
total impurities
≤1% taurine
≤2% cholic acid
Solubilità
H2O: soluble50 mg/mL, clear
10.4 Allegato 4 http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=SR0096&org=52&c=UK&lang=
EN
ultima visita: 04.04.2011
CLOSTRIDIUM DIFFICILE SELECTIVE SUPPLEMENT
Code: SR0096
Vial contents (each vial is sufficient for
500mls of medium)
per vial
per litre
D-cycloserine
125.0mg
250.0mg
Cefoxitin
4.0mg
8.0mg
Directions
Suspend 34.5g in 500ml of distilled water and bring gently to the boil to dissolve completely. Sterilise by
autoclaving at 121°C for 15 minutes. Allow to cool to 50°C and add aseptically the contents of 1 vial of Oxoid
Clostridium Difficile Supplement (SR0096) reconstituted as directed, together with 7% (v/v) Defibrinated
33
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
Horse Blood (SR0050). Sheep Blood (SR0051) may be used in place of Horse Blood but some strains of the
organism will show a slightly reduced growth recovery. Mix well and pour into sterile Petri dishes.
Description
Clostridium difficile was first isolated in 1935 by Hall and O’Toole1 who proposed the name `difficile’ because
it was very difficult to isolate. In 1940 Snyder2 isolated Clostridium difficile from infants aged 10 weeks to 1
year. No further isolations were reported until 1960, when the organism was cultured by McBee3 from the
intestinal contents of a seal, and in 1962 Smith and King4 reported its presence in human infections.
Toxicogenic isolates of Clostridium. difficile have been demonstrated to be a major cause of antibioticassociated ileo-caecitis in laboratory animals5 and pseudomembranous colitis in man6,7. Keighley8 found
Clostridium difficile was associated with colitis and diarrhoea without pseudomembranous changes after
antibiotic therapy following gastrointestinal operations.
Hafiz and Oakley9 devised a medium for the selective isolation of Clostridium difficile based on the
observation that the organism has a high tolerance to cresol, which it produces during its growth, and used
Reinforced Clostridial Medium (CM0151) plus 0.2% phenol or p-cresol.
George et al10 in a study of selective media for the routine isolation of Clostridium difficile from faecal
specimens found this medium was inhibitory compared with growth on blood agar. They recommended the
use of a fructose containing nutrient medium plus egg yolk, with D-cycloserine and cefoxitin as selective
agents for the isolation of Clostridium difficile.
The combination of Oxoid Clostridium difficile Agar Base plus the Culture Media Supplement (SR0096) is
based on the formulation proposed by George et al.10
The selective agents D-cycloserine (500µg/ml) and cefoxitin (16µg/ml) inhibit growth of the majority of
Enterobacteriaceae, as well as Streptococcus faecalis, staphylococci, Gram-negative non-sporing anaerobic
bacilli and Clostridia species. (except Clostridium difficile) which may be found in large numbers in faecal
samples.
Levett11, noting reports12,13 that some strains of Clostridium difficile had low minimum inhibitory concentrations
to both cycloserine and cefoxitin, reduced the antibiotic concentrations to 125µg per ml cycloserine and 4µg
per ml cefoxitin and combined this with alcohol shock14 to compensate for the reduction in selectivity.
Clostridium difficile was isolated from all of the 33 faecal specimens plated on to CCFA Medium containing
cycloserine and cefoxitin at 250µg per ml and 8µg per ml respectively, but from only 25/33 specimens plated
on to medium containing 500µg per ml cycloserine and 16µg per ml cefoxitin. The specimen should be
treated with alcohol before inoculation (see technique).
It can be expected that medium containing the lower concentration of antibiotics will yield a greater growth of
contaminating organisms if antibiotics are used alone, but Levett reported that there was no difference in the
growth of contaminating organisms on plates containing either concentration of antibiotics following alcohol
shock treatment of the specimen.
Phillips and Rogers15 have described a simple modification to the medium in which the ability of Clostridium
difficile to produce p-cresol from p-hydroxyphenyl acetic acid is used for the rapid presumptive identification
by gas chromatographic detection of the p-cresol. Addition of 7% horse blood to the agar base increases the
recovery of Clostridium difficile and produces larger colonies compared with Egg Yolk Emulsion used by
George et al.10
Technique
1.
Lightly inoculate the medium with the faecal sample spreading part of the original inoculum in order
to obtain well separated colonies.
34
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
2.
3.
Incubate plates at 35°C for 18-24 hours in a conventional anaerobic gas jar. The use of the Oxoid
Anaerobic Jar (HP0011) with an Anaerobic Gas Generating Kit (BR0038) is strongly recommended.
Alternatively use Anaerogen (AN0025 or AN0035). Anaerogen does not require the addition of water
or a catalyst.
Colonies of Clostridium difficile after 48 hours incubation are 4-6mm diameter irregular, raised
opaque, grey-white.
Technique for Alcohol Shock Treatment (if required)
1.
2.
3.
4.
Mix equal parts of industrial methylated spirit or absolute alcohol and the faecal specimen.
Homogenise using a vortex mixer.
Leave at room temperature for 1 hour.
Inoculate on to Clostridium difficile Selective Agar and incubate anaerobically.
Storage conditions and Shelf life
Store the dehydrated medium at 10-30°C and use before the expiry date on the label.
Store the prepared medium at 2-8°C no longer than 5-7 days.
Appearance
Dehydrated medium: Straw coloured, free-flowing powder
Prepared medium: Straw coloured coloured gel
Quality control
Positive control:
Expected results
Clostridium difficile NCTC 11204
Good growth; grey-white coloured
colonies
Negative controls:
Staphylococcus aureus ATCC®
25923*
No growth
Escherichia coli ATCC® 25922*
No growth
* This organism is available as a Culti-Loop®
Precautions
Colonies of Clostridium difficile from faecal cultures are smaller when egg yolk is used in place of horse
blood.
The Oxoid formula does not contain the neutral red indicator proposed by George et al.10 because it is
designed for use with horse blood. On this medium the typical colour of the colony of Clostridium difficile will
not appear however there will be a fluorescent reaction.
Typical Gram stain morphology of Clostridium difficile may not be evident in colonies picked from this
medium because of the antibiotics present. Subculture to blood agar to obtain characteristic morphology10.
35
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
10.5 Allegato 5 Thioglicolato:
 sciogliere 30 gThioglycolate Medium (BBL) in 1 litro di acqua demineralizzata
 Portare a ebollizione e bollire per 1 minuto
 Aggiungere 100 µl di vitamina K1 1% (Fluka, Svizzera) (sciogliere 1 g in 100 ml di
Etanolo 96% e conservare al buio)
 Distribuire 6 ml in provette
 Sterilizzare a 118°C per 15 minuti
10.6 Allegato 6 NaCl allo 0,9%:
 18 g di cloruro di sodio (NaCl) (Fluka, Svizzera)
 2 litri di acqua demineralizzata
 Sterilizzare a 121°C per 15 minuti
10.7 Allegato 7 Numero di spore per ml:
CFU : 100 µl = x : 1000 µl
Numero di spore per diluizione:
Diluizione = Numero di spore per ml : x
Calcolo di spore da aggiungere al campione:
Numero spore desiderato (o volume da contaminare) = Numero spore per grammo (ml)
Numero spore per ml : 1000 ul = Numero spore per grammo( ml) : x
10.8 Allegato 8 Acqua ossigenata:
 10 ml di acqua ossigenata 35% (Fluka, Svizzera)
 90 ml di acqua demineralizzata
10.9 Allegato 9 Violetto di Genziana:
Soluzione madre:
 Sciogliere 100 g di violetto di genziana in 2 litri di alcool etilico (Centazone, Svizzera)
 Mescolare bene con il miscelatore
 Filtrare in bottiglia scura
Soluzione di lavaro:
 Mescolare 500 ml di soluzione madre con 2 litri di acqua demineralizzata
 Mettere in bottiglia scura
10.10 Allegato 10 Lugol:
 Aggiungere 3 litri di acqua demineralizzara a 200 g di Potassium lodide (Fluka,
Svizzera)
 Mescolare bene con il miscelatore
 Aggiungere 100 g di Iodine (Fluka, Svizzera)
36
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo


Mescolare a lungo (tutta la notte)
Versare in bottiglia scura
10.11 Allegato 11 Alcool – Acetone (Centazone, Svizzera):
 Mescolare 3 parti di Alcool 96% e 1 parte di Acetone
10.12 Allegato 12 Fucsina (Fluka, Svizzera):
 Sotto cappa aggiungere 4 litri di acqua a 20 di fucsina
 Mescolare bene con l’agitatore
 Filtrare in bottiglia scura
10.13 Allegato 13 Skim milk:
 Aggiungere 70 ml di acqua demineralizzata a 10 grammi di Skim milk (BBL)
 Mescolare bene
 Sterilizzare a 121°C per 15 minuti
 Lasciar raffreddare
 Aggiungere 10 ml di Calf serum (Sigma, Svizzera) e 20 ml di glicerolo (Fluka,
Svizzera)
 Mescolare bene
10.14 Allegato 14 QIAGEN Multiplex 2x PCR Kit (1000), Cat. No. 20614 (Qiagen,Svizzera):
 HotStarTaq DNA polymerase
 Multiplex PCR buffer
 dNTP mix
10.15 Allegato 15 Tampone TBE 10x
 108 g di Tris base
 55 g di boric acid
 40 ml di 0.5 M EDTA, pH 8
Tampone TBE 1x:
 900 ml di acqua demineralizzata
 100 ml di TBE 10x
10.16 Allegato 16 DNA molecular weigh marker XIV 100 base pair ladder (Roche, Svizzera)
Concentrazione 250µg/ml
 36 µl di marker 100 bp
 54 µl di H2O RNAse free
 18 µl di loading buffer 6x
10.17 Allegato 17 Loading buffer 6x:
 0.25% di Blu di bromotimolo
37
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo


0.25% di Xylene cyanol
30% di glicerolo in acqua
10.18 Allegato 18 http://www.biotium.com/product/product_info/flyer/GelRed%20&%20GelGreen%20Flyer.pdf
ultima visita: 25.5.2011 allegato in forma ridotta
GelRed
TM
and GelGreen
TM
The best nucleic acid gel stains by combining sensitivity,
safety and stability
GelRed™ and GelGreen™ represent a new generation
of fluorescent nucleic acid gel stains designed to
replace the highly toxic ethidium bromide (EtBr) for
staining dsDNA, ssDNA or RNA in agarose gels or
polyacrylamide gels. GelRed and GelGreen are
superior to EtBr and other EtBr alternatives by having a
combination of low toxicity, superior sensitivity and
exceptional stability.
Nucleic acid dyes are inherently hazardous because of
their potential to cause DNA mutation. However, for
genotoxicity to occur, it is necessary for the dyes to
enter cells. With this insight, we engineered the
chemical structures of GelRed™ and GelGreen™ so
that the dyes are unable to cross cell membranes, thus
denying the opportunity for them to interact with
intracellular DNA. As a result of the novel designs,
GelRed™ and GelGreen™ are shown to be
nonmutagenic and noncytotoxic at concentrations
relevant to nucleic acid gel staining. Moreover,
GelRed™ and GelGreen™ have also been tested to be
nontoxic to aquatic life, meeting the environmental
regulatory requirement by the state of California for
safe disposal in the drain.
GelRed™ is a direct replacement for EtBr due to its
nearly identical spectra to those of EtBr. Key features
of GelRed include the following::
10.19 Allegato 19 Taq PCR Master Mix 2x Kit 1000 units, Cat. No. 201445 (Qiagen, Svizzera):
 Taq DNA Polymerase
 QIAGEN PCR Buffer
 dNTPs
10.20 Allegato 20 Tabella 12: Tabella dei 27 campioni di carne e dei controlli positivi
Campione
Metodoa)
Contaminazioneb)
Crescita su
terreno selettivoc)
Risultato PCR dopo
estrazione DNA da brodod)
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
BHI
1
CMM
38
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
Positivo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
SI
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
SI
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
Positivo
-
No
Negativo
BHI
2
CMM
BHI
3
CMM
BHI
4
CMM
BHI
5
CMM
BHI
6
CMM
BHI
7
CMM
BHI
8
CMM
BHI
9
CMM
10
BHI
39
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
No
Positivo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
CMM
BHI
11
CMM
BHI
12
CMM
BHI
13
CMM
BHI
14
CMM
BHI
15
CMM
BHI
16
CMM
BHI
17
CMM
18
BHI
40
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
No
Positivo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
Negativo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
Si
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
CMM
BHI
19
CMM
BHI
20
CMM
BHI
21
CMM
BHI
22
CMM
BHI
23
CMM
BHI
24
CMM
BHI
25
CMM
BHI
26
CMM
41
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
X
No
Positivo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
BHI
27
CMM

a) BHI = Brain heart infusion; CMM = Cooked meat medium

b) X= contaminazione con 5’000 spore/grammo; - = nessuna contaminazione

c) No= nessuna crescita su terreno selettivo; Si = crescita su terreno selettivo

d) Risultato analisi PCR positivo, negativo o non effettuato (-)
Tabella 13: Tabella dei 7 campioni di insalata e dei controlli positivi
Campione
Metodoa)
Contaminazioneb)
Crescita su
terreno selettivoc)
Risultato PCR dopo
estrazione DNA da brodod)
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
No
-
-
No
Negativo
X
No
Positivo
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
BHI
1
CMM
BHI
2
CMM
BHI
3
CMM
BHI
4
CMM
BHI
5
CMM
6
BHI
42
Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica
e in alimenti pronti al consumo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
-
No
Negativo
X
Si
-
CMM
BHI
7
CMM

a) BHI = Brain heart infusion; CMM = Cooked meat medium

b) X= contaminazione con 5’000 spore/grammo; - = nessuna contaminazione

c) No= nessuna crescita su terreno selettivo; Si = crescita su terreno selettivo

d) Risultato analisi PCR positivo, negativo o non effettuato (-)
43