Biol. Mar. Mediterr. (2012), 19 (1): 269-270
D. Sartori, I. Buttino1,2, J.-S. Hwang3, A. Gaion1, A. Scuderi1,
L. Morroni1, D. Pellegrini1, G. Sansone
Università degli Studi di Napoli “Federico II”, Via Università, 100 - 80055 Portici (NA), Italia.
[email protected]
1
ISPRA Istituto Superiore per la Protezione e Ricerca Ambientale,
Viale Nazario Sauro, 4 - 57128 Livorno, Italia.
2
Stazione Zoologica Anton Dohrn, Villa Comunale - 80121 Napoli, Italia.
3
Institute of Marine Biology, National Taiwan Ocean University, Keelung, Taiwan.
VALUTAZIONE DEGLI EFFETTI DEL CLORURO DI MERCURIO
SULLO SVILUPPO DI PARACENTROTUS LIVIDUS
ED ECHINOMETRA MATHAEI MEDIANTE
LA MICROSCOPIA NON LINEARE
THE EFFECT OF MERCURIC CHLORIDE ON THE DEVELOPMENT
OF PARACENTROTUS LIVIDUS AND ECHINOMETRA MATHAEI:
APPLICATION OF HARMONIC GENERATION MICROSCOPY
TECHNIQUE TO OBSERVATION OF SEA URCHIN EMBRYO
Abstract - The effect of Mercuric Chloride (HgCl 2) dissolved in sea water was assessed on two
sea urchin larvae species: the regular echinoid Paracentrotus lividus and the subtropical sea urchin
Echinometra mathaei. Sea urchin larvae were exposed for 48 h to different concentration of HgCl 2
and larvae abnormalities and their frequencies were evaluated in both species in order to calculate the
EC50 and compare their sensitivity towards chemicals. Moreover, Harmonic Generation Microscopy was
employed to assess f signals possibly related to apoptotic tissue.
Key-words: mercuric chloride, Paracentrotus lividus, Echinometra mathaei, Harmonic Generation Microscopy.
Introduzione - Il Mercurio (Hg) è uno dei metalli più tossici presenti in natura
e può essere rilasciato nell’ambiente sia attraverso processi naturali (disgregazione
minerale) sia attività antropiche (McCartor e Becker, 2010). Gli effetti tossici del
mercurio in forma di composti inorganici su vertebrati e invertebrati acquatici sono
ben documentati e consistono in aberrazioni in larve di pesci (Weis e Khan, 1990)
e in plutei di riccio di mare (Fernandez e Beiras, 2001). In questo studio gli effetti
dell’esposizione a basse concentrazioni di HgCl2 sono stati analizzati su due specie di
riccio di mare; Echinometra mathaei e Paracentrotus lividus mediante l’utilizzo delle
tradizionali tecniche dell’ecotossicologia e quelle della microscopia ottica non lineare
(Harmonic Generation Microscopy, HGM).
Materiali e metodi - Individui adulti di Paracentrotus lividus ed Echinometra
mathaei sono stati raccolti lungo la costa di Livorno (Italia) e Keelung (Taiwan)
e immediatamente stimolati al rilascio di gameti mediante la somministrazione di
1 ml di soluzione 0,5 M KCl nella cavità celomatica. Dopo la fecondazione, gli zigoti
sono stati incubati con differenti concentrazioni di cloruro di mercurio (HgCl2) in
acqua di mare. Le concentrazioni di HgCl2 valutate sono state rispettivamente: 5, 10,
15, 20, μg l-1 per P. lividus e 1, 2, 3, 4, μg l-1 per E. mathaei. Il test è stato bloccato
mediante l’aggiunta di 1 ml di formaldeide al 40% (Carlo Erba Reagents, Milano);
i campioni fissati sono stati lavati con tampone PBS; successivamente sono state
determinate le curve dose risposta mediante la procedura best-fit (Scholze et al.,
2001), è stata stimata la percentuale di plutei normali e determinati i valori di EC50.
I campioni inoltre, sono stati osservati mediante un’analisi di microscopia di seconda
(SHG) e terza (THG) generazione d’armonica presso il Molecular Imaging Center
della National Taiwan University di Taiwan. Il sistema SHG è in grado di rivelare la
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D. Sartori, I. Buttino, J.-S. Hwang, A. Gaion, A. Scuderi, L. Morroni, D. Pellegrini, G. Sansone
distribuzione e l’orientamento di proteine strutturate come collagene o microtubuli,
mentre il sistema THG è stato impiegato con successo per l’individuazione di corpi
apoptotici nell’encefalo dei “pesci Zebra”. Presuntivi corpi apoptotici sono stati
positivamente colorati mediante acridine orange e osservati mediante tecniche di
microscopia a fluorescenza (Chen et al., 2006; Hsieh et al., 2008).
Risultati e conclusioni - Per quanto riguarda P. lividus, effetti significativi sullo
sviluppo dei plutei sono stati registrati già a partire dalla concentrazione di 10 µg l-1
(P<0,05) con un EC50 di 16,72 µg l-1±1,50, in accordo con quanto riportato in
letteratura (Arizzi Novelli et al., 2003). In E. mathaei una correlazione significativa
tra la concentrazione di HgCl2 e la frequenza di aberrazioni nello sviluppo dei plutei
è stata osservata già a concentrazioni inferiori a 2 µg l-1 (P<0.001). Il valore di EC50
per questa specie è risultato pari a 2,407±1,72. Le scansioni effettuate su embrioni
di ambedue le specie mediante tecniche di HGM rivelano un segnale di fluorescenza
che cresce con l’aumentare delle concentrazioni di HgCl2. Pochi studi riportano gli
effetti di sostanze tossiche su E. mathaei, tuttavia, sulla base dei risultati ottenuti in
questo lavoro, la specie subtropicale sembrerebbe essere più sensibile rispetto a P.
lividus, proveniente da una zona climatica temperata. Sulla base dei risultati ottenuti
con microscopia HGM, l’esposizione a concentrazioni crescenti di HgCl2 induce
un aumento del segnale di fluorescenza, una risposta che sembrerebbe legata alla
presenza di corpi apoptotici (Hsieh et al., 2008).
Bibliografia
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