Chlamydia pneumoniae-IgM-sELISA medac
Italiano
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0123
432-TMB-VPI/010512
FABBRICANTE
medac
Gesellschaft für klinische
Spezialpräparate mbH
Fehlandtstraße 3
D-20354 Hamburg
DISTRIBUZIONE
medac
Gesellschaft für klinische
Spezialpräparate mbH
Geschäftseinheit Diagnostika
Theaterstrasse 6
D-22880 Wedel
Tel.:
Fax:
++49/ 4103 / 8006 – 348
++49/ 4103 / 8006 - 359
INDIRIZZO PER LE ORDINAZIONI
Tel.:
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++49/ 4103 / 8006 - 113
432-TMB-VPI/010512
Chlamydia pneumoniae-IgM-sELISA medac
Test immunoenzimatico per la rilevazione di anticorpi di classe IgM
anti-C. pneumoniae
Cat.no.: 432-TMB
PER SOLO USO DIAGNOSTICO IN VITRO
INTRODUZIONE
Le Chlamydie sono agenti batterici gram-negativi. Sono caratterizzate
da un ciclo vitale obbligato di tipo intracellulare a carico delle
superfici mucose, delle cellule endoteliali e delle cellule muscolari
lisce e, in base a recenti indagini, anche a carico di alcune
strutture tissutali del sistema nervoso centrale. Le Chlamydie
dipendono dai fosfati ricchi in energia delle loro cellule ospiti e
pertanto svolgono un parassitismo di tipo energetico.
Il
genere
Chlamydia
comprende
quattro
specie:
C.
pneumoniae,
C.
trachomatis,
C.
psittaci
e
C.
pecorum.
C.
pneumoniae
e
C. trachomatis sono agenti patogeni obbligati dell’uomo. C. psittaci è
patogeno per l’uomo e per una varietà di specie animali. Finora
C. pecorum è stata isolata soltanto da animali.
Le infezioni da C. pneumoniae si verificano in tutto il mondo. La
tipologia della malattia, oltre a una sindrome simil-influenzale,
comprende
sinusite,
faringite,
bronchite,
malattia
polmonare
ostruttiva cronica, polmonite e artrite reattiva. Allo stato attuale è
ancora
oggetto
di
indagine
un
coinvolgimento
eziologico
di
C. pneumoniae nell’asma di natura infettiva, sarcoidosi, neoplasia
polmonare, aterosclerosi, infarto miocardico acuto, infarto cerebrale,
sclerosi multipla e insorgenza tardiva di malattia di Alzheimer.
Secondo Grayston e Saikku (1989), che per primi hanno descritto questa
specie di Chlamydia, quasi ogni persona si infetta e reinfetta con
C. pneumoniae nel corso della vita. Il decorso sintomatologico
prevalentemente modesto e/o diffuso delle infezioni da C. pneumoniae
rende la loro diagnosi più difficile; le infezioni non diagnosticate
possono portare a un’evoluzione cronica della malattia con conseguenze
gravi.
La diagnosi di infezione da C. pneumoniae si basa sull’isolamento del
patogeno in colture cellulari, rivelazione diretta dell’antigene, test
di amplificazione degli acidi nucleici e sierologia. L’isolamento del
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1
patogeno su colture cellulari richiede normalmente diversi passaggi
successivi; richiede tempo, è limitato a particolari laboratori ed è
efficace solo in pochi casi. L’immunofluorescenza diretta (IFA) e i
test immunoenzimatici per la rivelazione dell’antigene (EIA) non sono
stati ancora utilizzati su ampia scala; è stata segnalata una loro
bassa sensibilità e specificità.
Per il riscontro di anticorpi specie-specifici, la microimmunofluorescenza (MIF) è stata considerata il metodo di scelta. La MIF è
laboriosa, soggettiva e richiede notevole esperienza. Tale test non è
standardizzato; l’uso di diversi antigeni e l’adozione di differenti
criteri per la determinazione del valore soglia per le infezioni
pregresse, recenti o in atto creano significative variazioni dei
risultati da laboratorio a laboratorio.
Il test Chlamydia pneumoniae-sELISA medac impiega un antigene
altamente purificato e specifico. La rivelazione di anticorpi IgM, IgA
e IgG consente la valutazione dello stato di infezione e il follow-up
dopo il trattamento. Gli anticorpi di classe IgM indicano, con un
elevato grado di certezza, un’infezione acuta.
Il test Chlamydia pneumoniae-sELISA medac ottempera alle esigenze di
standardizzazione, obiettività, riproducibilità e automazione nella
routine di laboratorio.
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2
PRINCIPIO DEL TEST
La piastra è sensibilizzata con
una preparazione antigenica di
C.
pneumoniae
altamente
purificata.
Gli
anticorpi
specifici
del
campione
diretti
contro
C.
pneumoniae
si
legano
all’antigene.
Gli anticorpi anti-IgM umane
coniugati con perossidasi si
legano agli anticorpi di tipo
IgM (P = perossidasi).
Incubazione
con
TMB-substrato
(*). La reazione viene bloccata
mediante l’aggiunta di acido
solforico.
L’assorbanza
viene
letta mediante spettrofotometro.
Vantaggi del test
 Elevata sensibilità e specificità.
 Le strisce di micropozetti
efficiente del test.
separabli
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consentono
un
uso
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CONTENUTO DEL KIT
Cat. no.: 432-TMB
1.
MTP
Micropiastra: 12 x 8 pozzetti (contrassegnati con CPM, con supporto
ed essicante sigillati in una busta di alluminio), separabili, con
profilo a U, sensibilizzati con un antigene specifico di
C. pneumoniae e siero bovino fetale, pronta per l’uso.
2.
CONTROL Controllo negativo: 1 flacone da 1,5 ml di siero umano, pronto per
l’uso, di colore blu, contenente siero bovino neonatale, fenolo,
ProClinTM 300 e gentamicina solfato.
3.
CONTROL +
Controllo positivo: 1 flacone da 1,5 ml di siero umano, pronto per
l’uso, di colore blu, contenente BSA, fenolo, ProClinTM 300 e
gentamicina solfato.
4.
WB
Tampone di lavaggio: 1 flacone da 100 ml, PBS/Tween (10x), a pH 7,2
- 7,4, contenente ProClinTM 300.
5.
BAC-DIL
Diluente campioni: 1 flacone da 110 ml, PBS/Tween/siero bovino
fetale, a pH 7,0 - 7,2, pronto per l’uso, di colore blu, contenente
ProClinTM 300.
6.
CON
Coniugato: 4 flaconi da 4,5 ml ciascuno, anticorpi di capra antiIgM umane coniugati con HRP, pronto per l’uso, di colore rosso,
contenente BSA, fenolo, ProClinTM 300 e gentamicina solfato.
7.
TMB
TMB-substrato: 1 flacone da 10 ml, pronto per l’uso.
8.
STOP
Soluzione di stop: 2 flaconi da 11 ml ciascuno, acido solforico
0,5 M (H2SO4), pronto per l’uso.
9.
RF-ABS
Reattivo assorbente per IgG/Rf: 1 flacone da 4 ml, anticorpi di
capra anti-IgG umane, pronto per l’uso, contenente < 0,1 % di sodio
azide.
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1.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Materiale/Reattivo
Kit
Stato
integro
Conservazione
2...8 °C
Micropiastra
aperta
Controlli
Tampone di lavaggio
Diluente campioni
Coniugato
TMB-substrato
Soluzione di stop
aperti
diluito
aperto
aperto
aperto
aperta
2...8 °C nella busta
con essiccante
2...8 °C
2...8 °C
2...8 °C
2...8 °C
2...8 °C
2...8 °C
Reattivo assorbente aperto
per IgG/Rf
2...8 °C
Stabilità
fino alla data di
scadenza
12 settimane
12 settimane
12 settimane
12 settimane
12 settimane
12 settimane
fino alla data di
scadenza
12 settimane
Non utilizzare i reattivi dopo la data di scadenza.
2.
REATTIVI E MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
2.1. Acqua per iniezione (H2O bidistillata). L’utilizzo
deionizzata può disturbare la procedura del test.
di
acqua
2.2. Micropipette regolabili.
2.3. Contenitori puliti in vetro o in plastica per la diluizione del
tampone di lavaggio e dei campioni.
2.4. Un apparecchio adeguato per il lavaggio di micropiastre (p.es.
multistepper o lavatore per micropiastre ELISA).
2.5. Incubatore a 37 °C.
2.6. Lettore per micropiastre con filtri a 450 nm e 620 - 650 nm.
3.
PREPARAZIONE DEI REATTIVI
Prima di iniziare la procedura di test, tutti i componenti del kit
devono essere portati a temperatura ambiente.
Calcolare il numero di pozzetti richiesti.
3.1. Micropiastra
La busta in alluminio deve essere accuratamente risigillata
insieme con l’essiccante dopo ogni prelievo dei pozzetti. Per la
conservazione e la stabilità dei pozzetti vedi punto 1.
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5
3.2. Tampone di lavaggio
Mescolare un volume di tampone di lavaggio (10x) con nove volumi
di acqua per iniezione (p.es. 50 ml di tampone di lavaggio (10x)
con 450 ml di acqua). Per otto pozzetti sono necessari 10 ml di
tampone di lavaggio diluito.
I cristalli nel tampone di lavaggio (10x) devono essere disciolti
mediante riscaldamento (max. 37 °C) e/o agitazione a temperatura
ambiente.
Non mescolare i reattivi specifici del kit (micropiastra, controlli,
coniugati) di lotti diversi. Per contro il diluente campioni, il
tampone di lavaggio, il TMB-substrato, il reattivo assorbente per
IgG/Rf e la soluzione di stop sono generalmente intercambiabili per
tutti i Chlamydia e Mycoplasma ELISA.
I reagenti di altri produttori non possono essere utilizzati.
Risultati validi e riproducibili si ottengono
seguita attentamente la procedura del test.
4.
soltanto
se
viene
CAMPIONI
4.1. Il test è adatto per campioni di siero ma non di plasma. Il
campioni dei pazienti possono essere conservati per 7 giorni a
2-8°C. Per una durata più lunga i campioni possono essere
conservati a ≤ -20 °C. Si consiglia di evitare ripetuti cicli di
scongelamento e congelamento dei campioni.
4.2. Allo scopo di evitare interferenze con titoli elevati di IgG e
con fattori reumatoidi, deve essere eseguito un assorbimento per
IgG/Rf.
4.3. Il
pretrattamento
dei
sieri,
p.es.
inattivazione,
non
è
necessario. Questi non devono comunque essere contaminati con
microrganismi, né contenere globuli rossi.
5.
PROCEDURA DI TEST
5.A. ASSORBIMENTO PER IgG/RF


Attenzione:
I
controlli
sono
pronti
per
assorbimento).
I volumi di seguito indicati
determinazioni singole.
l’uso
si
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(non
riferiscono
è
necessario
soltanto
a
6
5.A.1.
Siero: diluire 10 µl di siero con 240 µl di diluente campioni
(diluizione 1:25).
5.A.2.
Assorbimento: mescolare 30 µl di reattivo assorbente per
IgG/Rf con 30 µl di siero diluito (diluizione 1:50) e incubare
per 15 min a temperatura ambiente.
Alternativa: l’assorbimento può essere eseguito a 2 - 8 °C
durante tutta la notte.
5.A.3.
La diluizione del test è ora di 1:50.
5.B.
ESECUZIONE DEL TEST
5.B.1.
Tagliare la busta di alluminio al di sopra della chiusura e
prelevare il numero richiesto di pozzetti (vedi 3.1.).
I pozzetti sono pronti per l’uso e non devono essere sottoposti
a lavaggio.
5.B.2. Pipettare 50 µl di diluente campioni nel pozzetto A1 come
bianco (vedi 6.A.) e 50 µl di controllo negativo (in
duplicato),
controllo
positivo,
e
campioni
diluiti
dei
pazienti.
Se necessario i pozzetti possono essere mantenuti in camera
umida a temperatura ambiente per un massimo di 30 min prima di
procedere.
5.B.3. Incubare i pozzetti per 60 min (± 5 min) a 37 °C (± 1 °C) in
camera umida o sigillati con un cartoncino da incubazione.
5.B.4. Al termine dell’incubazione lavare i pozzetti tre volte con
200 µl di tampone di lavaggio per pozzetto. Porre attenzione
affinché tutti i pozzetti siano pieni. Dopo il lavaggio
scuotere i pozzetti su carta da filtro.
Non lasciare asciugare i pozzetti! Procedere immediatamente!
5.B.5. Aggiungere il coniugato (di colore rosso) in ogni pozzetto.
Se il test viene eseguito manualmente devono essere pipettati
50 µl di coniugato in ogni pozzetto.
Attenzione:
Allorché si utilizzano apparecchiature automatiche, devono
essere pipettati 60 µl di coniugato in ogni pozzetto a causa
della elevata evaporazione nelle camere di incubazione degli
apparecchi.
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La convalida del test ha confermato che il kit può essere
automatizzato. Si raccomanda tuttavia di verificarne la
compatibilità
con
la
strumentazione
disponibile
in
laboratorio.
5.B.6.
Incubare nuovamente per 60 min (± 5 min) a 37 °C (± 1 °C) in
camera umida o sigillati con un cartoncino da incubazione.
5.B.7.
Al termine dell’incubazione lavare nuovamente i pozzetti (vedi
5.B.4.).
5.B.8.
Aggiungere 50 µl
per 30 min (± 2
sigillati con un
campioni positivi
5.B.9.
Arrestare la reazione mediante l’aggiunta di 100 µl di
soluzione di stop a ogni pozzetto. I campioni positivi si
colorano di giallo.
di TMB-substrato a ogni pozzetto e incubare
min) a 37 °C (± 1 °C) in camera umida o
cartoncino da incubazione per l’oscurità. I
si colorano di blu.
Pulire la superficie inferiore dei pozzetti prima della
lettura e verificare l’assenza di bolle d’aria nei pozzetti.
La lettura deve essere effettuata entro 15 min dall’aggiunta
della soluzione di stop.
5.C. TABELLA PER L’ASSORBIMENTO PER IgG/RF
Indicazione per singola determinazione
10 µl di siero
+
240 µl di diluente campioni
250 µl; dil. 1:25

30 µl di reattivo assorbente per IgG/Rf
+
30 µl di siero diluito
60 µl; dil. 1:50

Vortex

Incubare per 15 min a temperatura
ambiente o a 2 - 8 °C durante tutta la
notte

Diluizione del test 1:50
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8
5.D. TABELLA PER LA PROCEDURA DI TEST
Bianco (A1)
Diluente campioni
Controllo negativo
Controllo positivo
Campione assorbito
Controllo
negativo
50 µl
-
50 µl
-
Controllo
positivo
50 µl
-
Campione
50 µl
Incubare per 60 min a 37 °C, lavare 3 x con 200 µl di tampone di
lavaggio
Coniugato
50/60 µl*)
50/60 µl*)
50/60 µl*)
50/60 µl*)
Incubare per 60 min a 37 °C, lavare 3 x con 200 µl di tampone di
lavaggio
TMB-substrato
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
Incubare per 30 min a 37 °C nell’oscurità.
Soluzione di stop
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Lettura spettrofotometrica a 450 nm (rif. 620 - 650 nm)
*) procedura manuale/automatica (vedi 5.B.5.).
6.A. CALCOLO DEI RISULTATI (VALIDITÀ)







Leggere i valori di assorbanza a 450 nm (lunghezza d’onda di
riferimento 620 - 650 nm).
Sottrarre il valore di assorbanza del bianco (pozzetto A1) da
tutti gli altri valori di assorbanza.
Il valore di assorbanza del bianco deve essere < 0,100.
Il valore di assorbanza media del controllo negativo deve essere
< 0,100.
Il valore di assorbanza del controllo positivo deve essere
> 0,800.
Valore soglia = Valore di assorbanza media del controllo negativo
+ 0,380
Zona grigia = Valore soglia ± 10 %
Ripetere il test nel caso che i risultati non corrispondano alle
specifiche sopra descritte.
432-TMB-VPI/010512
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6.B. VALUTAZIONE DEI RISULTATI
6.B.1.
QUALITATIVA
Risultato
Valutazione
assorbanza < zona grigia
assorbanza del valore soglia ± 10 %
assorbanza > zona grigia
negativo
dubbio
positivo
6.B.2.
QUANTITATIVA
Indice del valore soglia =
Assorbanza del campione
Assorbanza del valore soglia
Valutazione
< 0,9
0,9 - 1,1
> 1,1
negativo
dubbio
positivo

I campioni con valori di assorbanza nella zona grigia devono
essere nuovamente sottoposti a test insieme con un campione
fresco prelevato 14 giorni dopo al fine di valutare un’eventuale
variazione del titolo.

I risultati devono essere sempre interpretati in correlazione ai
dati clinici e a parametri diagnostici addizionali.

Elevate concentrazioni di emoglobina e di bilirubina nel siero
non influenzano i risultati. Elevate concentrazioni di lipidi
possono tuttavia aumentare i valori di assorbanza dei campioni
negativi.

In casi singoli non possono essere escluse reazioni crociate con
anticorpi anti-nucleari, anticorpi eterofili e anticorpi antiC. psittaci e anti-C. trachomatis.
432-TMB-VPI/010512
10
6.C. INTERPRETATIONE SPECIFICA delle IgM/IgA/IgG
Risultati possibili
IgM
IgA
IgG
COI*
COI
COI
Interpretazione
>1,1
+
<0,9
-
<0,9
-
1. Indicazione sierologica di uno stadio
precoce d’infezione o di stimolazione
policlinale delle cellule B. Ritestare
gli anticorpi IgM, IgA e IgG dopo 14
giorni.
>1,1
+
>1,1
+
<0,9
-
2. Indicazione sierologica di un’infezione acuta. Ritestare le IgG dopo 14
giorni.
>1,1
+
<0,9
-
>1,1
+
3. Indicazione sierologica
zione acuta.
di
un’infe-
>1,1
+
>1,1
+
>1,1
+
4. Indicazione sierologica
zione acuta.
di
un’infe-
<0,9
-
>1,1
+
>1,1
+
5. Indicazione
sierologica
un’infezione corrente1. Ritestare
IgA e IgG dopo 14 giorni.
<0,9
-
<0,9
-
>1,1
+
6. Indicazione
sierologica
di
un’infezione
passata.
In
caso
di
sospetto clinico ritestare dopo 14
giorni l’andamento degli anticorpi IgG
e IgA.
<0,9
-
>1,1
+
<0,9
-
5. Indicazione sierologica di uno stadio
precoce
d’infezione
o
di
IgA2
persistenti. Ritestare gli anticorpi
IgM, IgA e IgG dopo 14 giorni.
<0,9
-
<0,9
-
<0,9
-
8. Nessuna indicazione sierologica di
infezione corrente o passata3. In caso
di sospetto clinico ritestare gli
anticorpi IgM, IgA e IgG dopo 14
giorni.
di
le
* Indece Cut-off
Commento:
I risultati borderline possono indicare un inizio o una regressione
dell’infezione. Si consiglia di rieseguire l’analisi dopo 14 giorni.
432-TMB-VPI/010512
11
1
Un’infezione corrente potrebbe indicare:
- un’infezione cronica con persistenza del patogeno: i valori COI
degli anticorpi rimangono costanti per diverse settimane.
- un’infezione cronica: i valori COI degli anticorpi aumentano
significatamente.
- concentrazione
elevata
di
IgG:
non
può
essere
esclusa
un’infezione acuta. In accordo con Grayston et al. (1989), titoli
di IgG MIF ≥ 1:512 indicano un’infezione acuta.
2
Si possono osservare singoli casi in cui si rileva la persistenza
di anticorpi IgA. Questo fenomeno immunologico appare in diverse
infezioni batteriche. Una rilevanza clinica non è apprezzabile.
3
In casi di infezioni acute da C. pneumoniae i risultati sierologici
anticorpali possono essere negativi nonostante la presenza di
sintomi clinici e di positività antigenica. Se è richiesto una
conferma sierologica di un risultato positivo per l’antigene o un
follow-up, si raccomanda di eseguire il test dopo 14 giorni per
verificare la siero-conversione.
432-TMB-VPI/010512
12
7.
PRESTAZIONI METODOLOGICHE DEL KIT
Le prestazioni metodologiche del kit sono state valutate nel corso
della valutazione diagnostica.
7.A. SPECIFICITÀ E SENSIBILITÀ
Per la determinazione della specificità sono stati valutati 121 sieri
risultati negativi mediante MIF per IgM anti-C. pneumoniae (31
pazienti con sospetto clinico di infezione da Chlamydia (1) e 90
pazienti con malattie veneree, positivi alla coltura per C.
trachomatis (2) e 159 sieri negativi per IgM (ELISA di riferimento)
provenienti da donatori di sangue (3) (uomini e donne di età compresa
tra 20 e 60 anni).
Per la determinazione della sensibilità sono stati valutati 38 sieri
di pazienti con infezioni respiratorie (4). Mediante MIF si sono
rilevate IgM anti-C. pneumoniae in tutti i sieri.
Gruppo di pazienti
Specificità
IgM
Sieri senza anticorpi IgM anti-C.
pneumoniae mediante MIF:
(1) Pazienti con sospetto di
infezione da Chlamydia (n = 31)
(2) Pazienti con malattie veneree
(n = 90)
Sieri
negativi
per
IgM
anti-C.
pneumoniae all’ ELISA di riferimento:
(3) Donatori di sangue (n = 159)
Gruppo di pazienti
90 %
(28/31)
98 %
(88/90)
99 %
(157/159)
Sensibilità
IgM
Sieri contenenti anticorpi IgM
anti-C. pneumoniae mediante MIF:
(4) Pazienti con infezioni
respiratorie (n = 38)
432-TMB-VPI/010512
97 %
(37/38)
13
7.B. PRECISIONE
Campione
NC
BC
PC
N° 1
N° 2
Variazione intra-saggio
Assorbanza
media
0,036
0,503
1,216
0,844
0,719
SD
CV
(%)
n
0,003
0,027
0,047
0,063
0,042
8
5
4
7
6
21
21
21
21
21
Campione
NC
BC
PC
N° 3
N° 4
Variazione intersaggio (n = 11)
AssorSD
CV
banza
(%)
media
0,035
0,003
9
0,521
0,027
5
1,225
0,063
5
0,051
0,004
8
0,848
0,061
7
NC = controllo negativo; BC = controllo basso positivo (non incluso nel kit);
PC = controllo positivo
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
 Al fine di evitare la
flaconi e i loro tappi.
contaminazione
crociata
non
scambiare
i
 I reattivi devono essere richiusi immediatamente dopo l’uso al fine
di evitare l’evaporazione e la contaminazione microbica.
 Dopo l’uso i reattivi devono essere conservati come indicato, al
fine di garantire la loro conservazione.
 Dopo l’uso tutti i componenti del kit devono essere conservati nella
confezione originale al fine di evitare di mescolare i reattivi di
altri test o lotti (vedi anche 3).
REGOLE DI SICUREZZA
 Devono essere rispettate le norme locali di sicurezza.
 I reattivi di origine umana sono stati sottoposti a test e
riscontrati negativi per HBsAg, per anticorpi anti-HIV-1/2 e antiHCV. Ciò nonostante, si raccomanda vivamente che tali materiali,
così come quelli di origine animale (vedi contenuto del kit),
vengano considerati come potenzialmente infettivi e pertanto
manipolati con tutte le necessarie precauzioni.
SMALTIMENTO
I residui di sostanze chimiche e di preparati sono generalmente
considerati come rifiuti a rischio. L’eliminazione di questo tipo di
rifiuti è regolata dalle leggi e dalle norme nazionali e regionali.
Contattare le autorità locali o le Compagnie di smaltimento rifiuti al
fine di ottenere informazioni relative allo smaltimento dei rifiuti a
rischio.
Data della revisione: 01.05.2012
432-TMB-VPI/010512
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BIBLIOGRAFIA
Balin, B.J., Gérard, H.C., Arking, E.J., Appelt, D.M., Branigan, P.J.,
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localization of Chlamydia pneumoniae in the Alzheimer’s brain. Med.
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Christiansen, G., Boesen, T., Hjerno, K., Daugaard, L., Mygind, P.,
Madsen, A.S., Knudsen, K., Falk, E., Birkelund, S.: Molecular biology
of
Chlamydia
pneumoniae
surface
proteins
and
their
role
in
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