UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI PAVIA
INTERFACOLTÀ
Dipartimento di Chimica
Direttore: Chiar.mo Prof L. Toma
_____________________________________
Studio della frazione flavonoidica di specie vegetali del
genere Huperzia
Relatore:
Chiar.mo Prof. Giovanni Vidari
Correlatore:
Dott. Davide Gozzini
Tesi Sperimentale di Laurea Magistrale
in Biotecnologie Mediche e Farmaceutiche di
Jorge Eduardo Ponce Zea
Anno Accademico 2011-2012
1
Prefazione
Lo studio effettuato per la realizzazione di questa tesi si inserisce
nell’ambito delle ricerche condotte nel Laboratorio di Sostanze Naturali del
Dipartimento di Chimica Organica dell’Università di Pavia. Qui si eseguono
lavori di isolamento e caratterizzazione di metaboliti secondari presenti in
piante e funghi.
Nel presente lavoro è stata effettuata un'analisi comparativa delle frazioni
contenenti flavonoidi di cinque specie del genere Huperzia.
2
Sommario
Prefazione ........................................................................................................................................... 2
Sommario ............................................................................................................................................ 3
Introduzione ........................................................................................................................................ 4
Importanza .......................................................................................................................................... 8
Metodologia ........................................................................................................................................ 9
Materiali ............................................................................................................................................ 14
Metaboliti secondari, Flavonoidi e Tricina ........................................................................................ 16
I flavonoidi ......................................................................................................................................... 17
Tricina ................................................................................................................................................ 22
Importanza biologica della Tricina ................................................................................................ 28
Il genere Huperzia ........................................................................................................................... 31
Procedura esperimentale ................................................................................................................ 37
Ottenimento delle frazione flavonoidiche ..................................................................................... 38
Estrazione acida e ottenimento delle torte.................................................................................... 39
SPE (Solid phase extraction)........................................................................................................... 42
TLC preparative (cromatografia su strato sottile) ........................................................................ 44
Analisi UPLC delle Frazioni Flavonoidiche ......................................................................................... 45
Elaborazione e comparazione dei profili metabolici delle diverse frazioni ...................................... 52
Quantificazione di Tricina nelle frazioni contenenti flavonoidi ........................................................ 64
Elaborazione della retta di taratura Standard di Tricina ................................................................... 64
Calcolo della quantità di Tricina presente negli estratti flavonoidici ................................................ 68
Isolamento e caratterizzazione di metaboliti di Huperzia espinosana. ............................................ 71
Discussione dei risultati e conclusioni............................................................................................... 79
3
Introduzione
Ad oggi il principale scopo delle ricerche nel campo dei prodotti naturali
continua ad essere quello di trovare molecole (metaboliti secondari) che
abbiano un impiego medico-farmaceutico. Poco più di 200 anni fa, nel 1804
Friedrich Sertürner isolò la prima molecola pura farmacologicamente attiva
derivante da una pianta: la morfina. Questo diede inizio ad un'era in cui i
farmaci potevano essere purificati, studiati, e somministrati in dosi precise.
Fino allo scorso secolo l’80% dei farmaci provenivano o erano derivati di
composti naturali. L'avvento della chimica combinatoriale, il modello più
attuale per la scoperta di farmaci, non ha favorito più per molto tempo le
ricerche sui prodotti naturali. Tuttavia la scoperta di nuove specie e le continue
innovazioni dei metodi di analisi chimica e di attività biologica, con strumenti e
tecnologie sofisticate, hanno ampliato il numero di composti che possono
essere oggetto di ricerca, rivelando nuove molecole interessanti che
potrebbero diventare delle sostanze con potenziale uso terapeutico. Rispetto
alla chimica combinatoriale, l'identificazione di prodotti naturali per la ricerca
di nuovi farmaci è più efficace nella scoperta di molecole di successo
terapeutico.
Certamente si può dire che la ricerca nel campo delle sostanze naturali è
ancora lontana dall’essere terminata e che i suoi benefici sono potenzialmente
elevati, nonostante gli eccezionali risultati ottenuti con l’isolamento di
centinaia di migliaia di composti; infatti, approssimativamente 170000
molecole di origine naturale sono state isolate.1
I metaboliti secondari sono importanti non solo in ambiti “commerciali”, come
quello medico-farmaceutico, cosmetico od alimentare. L’isolamento e
1
Successful, but often unconventional: the continued and long-term contribution of natural products to
healthcare, Lutz Mueller-Kuhrt, Expert Opin. Drug Discov., 2007 2(3):305-311
4
l’identificazione strutturale di nuove sostanze naturali rappresenta anche un
importante contributo per l’incremento delle conoscenze nel contesto chimico
e biologico. L’identificazione di particolari scheletri molecolari può essere utile
per studi chemo-tassonomici, ecologici, di biologia evolutiva e di biologia
molecolare.
In questo ampio scenario di ricerca fitochimica, è stato fondamentale il
contributo delle conoscenze tradizionali riguardo all’uso delle risorse vegetali:
conoscenze che hanno un uso ampio e diverso, dal ritualistico, a quello
medicinale e cosmetico. Al giorno d'oggi nel mondo circa 70.000 diverse piante
vengono utilizzate come medicamenti tradizionali, mentre il mercato mondiale
per la medicina a base di erbe ha un valore di circa 60 miliardi di dollari.2
Un approccio per la scoperta di sostanze provenienti da fonti naturali, con un
alto potenziale farmacologico, è quello di preselezionare sia piante che estratti
utilizzando dati etno-farmacologici. In paesi come l’Ecuador, queste nozioni
etnobotaniche sono parte della cultura tradizionale, e riguardano in molti casi
piante endemiche sulle quali l’informazione scientifica relativa ai composti
chimici ed ai loro meccanismi d’azione è scarsa.
La ricerca fitochimica delle piante ecuadoriane del genere Huperzia (famiglia
Lycopodiaceae) è iniziata con questa prospettiva. Nel 2010, sono stati effettuati
studi etnobotanici da parte di ricercatori dell’UTPL (Universidad Técnica
Particular de Loja) con il proposito di ottenere informazioni sull´uso tradizionale
delle piante medicinali del genere Huperzia all’interno della comunità Saraguro
nel sud dell’Ecuador. Questi studi hanno evidenziato che la ‘Waminga’, nome
con il quale sono identificati i diversi tipi di Huperzia nella comunità Saraguro,
viene usata ampiamente sia nei rituali, che a scopi medicinali.
2
Herbal Medicine: An Introduction to Its History, Usage, Regulation, Current Trends, and Research
Needs. Wachtel-Galor S, CRC Press, 2011.
5
Lo studio fitochimico delle più rilevanti specie di Huperzia usate dai Saraguro, è
stato realizzato nel laboratorio dei Prodotti Naturali del Dipartimento di
Chimica dell’Università di Pavia.
Già nel 1986 uno studio su una specie usata nella medicina tradizionale cinese,
l’Huperzia serrata, aveva documentato l’isolamento dell’ Uperzina A (HupA)3,
un alcaloide promettente nella terapia del morbo di Alzheimer, in quanto forte
inibitore dell'enzima acetilcolinesterasi (AChE). Dal genere Huperzia sono stati
isolati altri 141 alcaloidi oltre all'HupA.4
Con la speranza di trovare nuovi alcaloidi nelle specie ecuadoriane del genere
Huperzia, si è iniziato il percorso di isolamento e caratterizzazione, del quale si
è occupato il Ph.D Armijos. Il presente lavoro è complementare a quello citato
perché si occupa di altri metaboliti rilevanti, i flavonoidi, che sono contenuti
nelle frazioni non alcaloidee delle stesse piante.
Questo lavoro di tesi riguarda l’analisi delle frazioni contenenti i flavonoidi ed è
iniziato con l'estrazione e la separazione delle suddette frazioni. In seguito sono
stati determinati i fingerprint delle frazioni flavonoidiche degli estratti tramite
cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata ad uno spettrometro di
massa, che ha consentito di definire la distribuzione dei flavonoidi nelle specie:
-Huperzia compacta
-Huperzia crassa
-Huperzia espinosana
-Huperzia brevifolia
-Huperzia kuestery
3
.
Studies on the alkaloids of Huperzia serrate, Yao et al. Trev. Yuan SQ, Wei TT, 1988, 23(7):516-20
4
Huperzine A from Huperzia species—An ethnopharmacolgical review, Xiaoqiang Maa et Al, Journal of
Ethnopharmacology 2007, 113, 15–3.
6
È stata inoltre quantificata la quantità presente di tricina, il metabolita più
abbondante trovato nelle frazioni contenenti i flavonoidi delle Huperzie. Infine,
si è iniziato il lavoro d’isolamento, separazione e purificazione di alcuni
metaboliti secondari presenti in Huperzia espinosana.
7
Importanza
Gli studi precedenti di tipo fitochimico nel genere Huperzia hanno portato
all’isolamento di due molecole importanti: HupA e tricina5, composti che
hanno mostrato delle attività ampiamente documentate e di grande interesse
in ambito medicinale.
Ad oggi la bassa disponibilità della tricina da fonti naturali e i suoi elevati costi
di produzione non permettono il suo impiego come medicinale. Quindi è di
grande interesse identificare altre fonti dalle quali sia possibile isolarla.
Un normale processo d’isolamento, purificazione e caratterizzazione è lungo e
costoso, ragione per la quale si sono cercate altre strategie per indagare la
natura dei flavonoidi presenti nelle Huperzie.
Per ottenere informazioni sui metaboliti secondari presenti in un estratto in
forma rapida e affidabile, si possono usare metodi cromatografici accoppiati a
tecniche spettrometriche, dai quali si ottengono dati che successivamente si
comparano con i dati presenti in letteratura.
I motivi sopra indicati ben giustificano l’opportunità e l’importanza dello studio
sulla distribuzione e l’abbondanza della tricina e degli altri flavonoidi presenti
nelle 5 specie di Huperzie indicate, impiegando metodi cromatografici insieme
a tecniche spettrometriche.
5
The yellow colouring matter of khapli wheat, Triticum dicoccum. Anderson and Perkin,
J.Chem. Soc., 1931, 2624 -2625
8
Metodologia
In questo lavoro sono state utilizzate delle tecniche e delle metodologie
di tipo cromatografico e di spettrometria. Queste tecniche vengono utilizzate
per l’isolamento e la caratterizzazione strutturale di metaboliti secondari, e
sono utilizzate nella Chimica dei prodotti organici naturali. I metaboliti
secondari sono strutturalmente molto diversi, ma sono caratterizzati da comuni
origini biosintetiche e da proprietà chimico-fisiche che ci permettono di
separarli in frazioni che contengono composti di caratteristiche simili.
Generalmente il percorso dello studio dei metaboliti segue le seguenti tappe:
-
Estrazione delle sostanze naturali dalla massa biologica di partenza per
ottenere i cosiddetti estratti totali.
-
Separazione dei costituenti degli estratti totali.
-
Caratterizzazione dei costituenti puri tramite analisi fisico-chimiche e
spettroscopiche.
-
Eventuale sintesi totale o semi-sintesi a conferma della struttura
molecolare
La preparazione degli estratti è un passaggio determinante del lavoro. Le
condizioni dell’ estrazione devono essere non denaturanti, anche se spesso non
si conoscono a priori le caratteristiche dei metaboliti. Si possono stabilire
comunque delle regole generali che ci permettono di ridurre il rischio di
degradazione dei composti di interesse.
Nel caso delle piante il materiale vegetale, botanicamente identificato ed in
genere seccato all’aria all’ombra, viene separato fra semi, foglie, frutti,
corteccia, ecc., sminuzzato, ed omogeneizzato in un solvente opportuno. Si
9
opera talvolta a bassa temperatura in quanto durante il trattamento meccanico
della biomassa vengono rotti dei compartimenti cellulari che possono
contenere enzimi in grado di apportare modificazioni chimiche ai metaboliti
secondari, creando così artefatti; la bassa temperatura impedisce agli enzimi di
essere operativi. In seguito si filtra la biomassa solida, e si evapora il solvente; si
ottengono così estratti di consistenza oleosa o cerosa, che vengono conservati a
-20°C.
L’essiccamento della biomassa da utilizzare deve essere effettuata al riparo del
sole, in ambiente ventilato e a temperature relativamente basse (30°C).
L'essiccamento è utile quando si stanno cercando principi attivi che devono
essere attivi anche nella sua forma secca.
La diversità dei metaboliti secondari ci obbliga ad estrarre con più di un
solvente o miscela di solventi, aumentando la polarità ad ogni tappa di
estrazione; in seguito vengono elencati i solventi che possono essere usati, in
ordine crescente di polarità:
-Esano
-Cloruro di Metilene
-Acetato di Etile
-Metanolo
-Miscela di Acqua e metanolo
-Acqua
Spesso gli estratti più ricchi di composti di interesse sono quelli di polarità
medio-alta.
Talvolta si può semplificare l’estrazione che viene effettuata utilizzando un solo
10
solvente o una sola miscela di solventi, ad esempio etanolo/H2O; questo
estratto totale comunque dovrà essere sottoposto ad un processo di
ripartizione bifasica, che utilizza due solventi non miscibili di polarità diversa
messi in un imbuto separatore, dove viene messo l’estratto totale. In questo
sistema i metaboliti si ripartiranno secondo la loro affinità con i solventi
utilizzati. Ad esempio in un sistema a due fasi in cui sono stati utilizzati esano e
acqua, i metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase organica,
mentre quelli più polari si distribuiranno in acqua.
Le procedure finora descritte riguardano un’estrazione indiscriminata di tutti i
metaboliti secondari, e operando in questo modo negli estratti totali troveremo
più composti da separare e caratterizzare. Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva, in cui si estraggono composti che possiedono
determinate caratteristiche fisico-chimiche. In queste estrazioni si utilizzano
condizioni e solventi più selettivi, ad esempio l’uso di solventi acidi per separare
sostanze basiche, come nel caso dell’estrazione degli alcaloidi. Nello stesso
modo si usano solventi di natura basica per l’estrazione di acidi. Si può inoltre
far ricorso anche alla distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli
essenziali. Recentemente si è introdotta l’estrazione in presenza di micro-onde
e si è notato un notevole aumento della resa estrattiva.
Una volta ottenuti gli estratti totali, si procede alla separazione e purificazione
dei componenti. Attualmente la tecnica di separazione più usata è la
cromatografia su colonna per ripartizione, che si basa sulla diversa affinità che i
composti possono avere per una fase stazionaria e una fase mobile. La
cromatografia di ripartizione viene divisa principalmente i due grandi classi:
-cromatografia di ripartizione in fase diretta. Fase stazionaria polare (gel di
silice) utilizzando solventi di polarità media bassa (esano, acetato d’etile,
cloruro di metilene)
11
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa. Fase stazionaria apolare (gel di
silice ricoperto da catene idrocarburiche, solitamente C-18) eluita con solventi
di polarità alta come acqua, alcoli, acetonitrile.
Eventualmente quando si hanno a disposizione composti quasi puri e in
quantità sufficiente, si ricorre ai metodi di purificazione tradizionali quali la
distillazione frazionata (oli essenziali, nicotina), la ricristallizzazione e la
sublimazione (canfora, caffeina).
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati, cioè ne devono essere
identificate la struttura chimica, la stereochimica e le principali proprietà
chimico-fisiche. Per l’identificazione strutturale si ricorre a diverse tecniche
spettroscopiche, alcune basate sulla risonanza magnetica nucleare (NMR). Le
spettroscopie NMR del protone (1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono
tecniche di indagine a cui il composto puro è comunemente sottoposto.
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale che si affiancano a quelle
NMR sono: la spettroscopia di assorbimento nell’infrarosso (IR), che permette
di identificare i gruppi funzionali della molecola; la spettrometria di massa (MS),
che permette di risalire al peso molecolare, alla formula bruta, e ad alcune
informazioni strutturali, la spettrofotometria UV-visibile, che permette di
riconoscere la presenza nelle molecole di particolari cromofori grazie alle
rispettive bande di assorbimento.
Attualmente si dispone di procedure, basate sulle banche dati delle molecole,
che permettono l’identificazione dei metaboliti secondari in maniera più veloce
e affidabile rispetto a quella tradizionale,. Da queste banche si possono
consultare i dati riguardanti le caratteristiche chimico-fisiche dei composti. Dal
confronto con quanto presente in letteratura si può quindi giungere as una
successiva identificazione rapida e semplice dei composti naturali, isolati o da
12
specie nuove o
da
specie che non siano ancora state studiate
approfonditamente a livello fitochimico.
Strategie di ‘dereplication’ prevedono l’uso di tecniche cromatografiche
strumentali, come l’HPLC. Questa tecnica si è dimostrata utile sotto diversi
aspetti per la separazione di metaboliti secondari .
Infatti, i sistemi cromatografici moderni ad alta pressione sono in grado di
produrre picchi cromatografici con una migliore risoluzione; inoltre, il volume di
solvente con il quale vengono eluiti i composti viene ridotto e la separazione
può essere effettuata in un periodo di tempo molto più breve.
Esistono strumentazioni HPLC costituite da due o tre pompe. Il vantaggio di
avere più di una pompa è che i solventi che costituiscono la fase mobile
possono essere programmati secondo gradienti di polarità: ciò permette di
cambiare in modo continuo la composizione della fase mobile consentendo la
purificazione di una più ampia gamma di composti.
L’uso di sistemi con rivelatori a fotodiodo-array (PDA o DAD) permette la
scansione dell'intero campo UV-visibile (da 210 a 650 nm).
Per la separazione dei prodotti naturali, l'uso di questi rivelatori è di grande
vantaggio perché le molecole possono essere distinte a seconda dei differenti
spettri UV.
Inoltre, MS e NMR in combinazione con la rivelazione UV vengono utilizzati per
identificare i composti direttamente contenuti in una matrice complessa.
Parametri analitici utilizzati
I metaboliti secondari sono contenuti in matrici biologiche complesse, il che
introduce numerose difficoltà nella validazione dei metodi analitici utilizzati.
13
Per misurare in questo lavoro l’accuratezza delle misure quantitative abbiamo
previsto il controllo dei parametri in seguito descritti:
• Specificità: ossia la capacità di un metodo di distinguere tra l’analita che si
intende
misurare
e
le
altre
sostanze;
tale
caratteristica
dipende
prevalentemente dalla tecnica di misura, ma può variare in base alla classe dei
composti o della matrice.
• Accuratezza: concordanza tra il valore medio ottenuto da un’ampia serie di
risultati e un valore di riferimento accettato.
• Ripetibilità: si intende la precisione ottenuta in seguito a successive prove
indipendenti, ma utilizzando lo stesso metodo, nello stesso laboratorio, con lo
stesso operatore che utilizza la stessa apparecchiatura, su elementi di prova
identici.
• Riproducibilità intra-laboratorio: si intende la precisione ottenuta nello stesso
laboratorio in condizioni predeterminate, relative ad esempio al metodo, ai
materiali della prova, agli operatori, all’ambiente, nel corso di ampi intervalli di
tempo di durata giustificata.
• Linearità: è la capacità di un metodo all’interno di un intervallo di dare un
risultato che può mettersi in relazione lineare con la concentrazione dell’analita.
• Limite di rivelabilità: è la quantità minima di analita all’interno di un campione
che può essere rivelata ma non necessariamente quantificata come un valore
esatto. Al di sotto del limite di rivelabilità la probabilità di dichiarare
erroneamente l'assenza o presenza di un componente è maggiore.
• Limite di quantificazione: è il limite inferiore di concentrazione al quale è
possibile ottenere una misura quantitativa con precisione e accuratezza.
14
Materiali
Per le tecniche cromatografiche:
 Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su colonna;
 LiChrospher 100 RP-18 (12 µm) Merck per separazioni su colonna a fase
inversa
 lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka, dotate di indicatore di
fluorescenza a 254 nm;
 lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18, dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm;
 lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm;
 soluzione rivelatrice per TLC, costituita da vanillina 0,5 % in acido
solforico-etanolo 4:1;
 cartucce per SPE: SUPELCO DSC-18, 60 mL/10g
 Colonna per LC: LiChroCART® 250-4, Purosphere ®STAR RP-18e (5µm)
 Sistema UPLC: JASCO-X-LC-PAD
 Solventi: Acqua e metanolo. Optima® LC/MS, Fisher Chemical
Per la caratterizzazione spettroscopica
 spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
 spettrometro di massa Thermo scientific- LTQL hESI
15
Metaboliti secondari, Flavonoidi e Tricina
Vengono classificati come fitocomposti le entità chimiche che
conformano le piante. Possono essere di due tipi: metaboliti primari se sono
coinvolti in funzioni essenziali alla vita dell’organismo e metaboliti secondari
se il loro ruolo non è considerato direttamente necessario alla sopravvivenza6.
I metaboliti secondari non sono uniformemente prodotti nel regno vegetale,
ma anzi le diverse specie possono produrre metaboliti unici, che non si
riscontrano in alcun altro organismo. Queste molecole presentano una
notevole diversità chimica e nella pianta che li produce possono essere
coinvolti in una complessa rete di pathway metabolici7. La produzione di
metaboliti secondari nelle piante avviene sotto determinate condizione
fisiologiche; spesso può essere indotta da fattori ambientali che provocano
stress nella pianta, come ad esempio le radiazioni UV, o come parte di un
meccanismo di difesa contro i nemici naturali.
I metaboliti secondari possono essere coinvolti nella pigmentazione cellulare
di fiori e semi attraendo insetti impollinatori, entrando così a far parte, seppur
indirettamente, del processo di riproduzione della pianta. La maggior parte dei
metaboliti secondari delle piante che vengono usati come farmaci o come
composti guida per la loro produzione, appartengono alle famiglie delle
acetogenine, dei polichetidi, dei terpenoidi, degli alcaloidi e dei flavonoidi.
La biosintesi dei metaboliti secondari avviene in diversi compartimenti
cellulari. I composti idrofili sono prodotti principalmente nel citosol. I
terpenoidi e alcuni alcaloidi vengono sintetizzati all’interno dei cloroplasti.
Altri alcaloidi sono sintetizzati nei mitocondri insieme ad alcuni tipi di ammine.
Infine i metaboliti lipofili si trovano nel reticolo endoplasmatico liscio.
6
7
Natural products from plants / Leland J. Cseke ... [et al.].-- 2nd ed., 2006, capitolo 1.
rd
Medicinal Natural Products A biosynthetic approach, Dewick, 3 ed, 2009, p. 7-38
16
17
I flavonoidi
Struttura base dei flavonoidi
I flavonoidi sono derivati del flavone (2-fenil-γ-benzopirone) e vengono
sintetizzati nelle piante attraverso una combinazione di due vie metaboliche: la
via dell’acilpolimalonato e la via dell’acido shikimico.
Il precursore comune a tutti i flavonoidi è la naringenina calcone, sintetizzata
dalla calcone sintasi (CHS: E1 in figura) che catalizza una serie di
decarbossilazioni e condensazioni, a partire da una molecola di cumaril CoA
(che deriva dalla via dell’acido shikimico) alla quale vengono addizionate 3
molecole di malonil CoA (provenienti dal ciclo di Krebs); si forma un intermedio
polichetidico che subisce una serie di ciclizzazioni ed aromatizzazioni, formando
la struttura del calcone che verrà poi isomerizzata dalla calcone isomerasi (CHI:
E2 in figura) per formare la naringenina flavanone. Quest’ultima molecola può
essere modificata da diversi enzimi per originare le diverse classi di flavonoidi7.
18
Biosintesi e suddivisione dei flavonoidi in famiglie
19
Ci sono circa 8000 flavonoidi distribuiti in briofite e piante vascolari.
Attualmente sono conosciute solo alcune delle loro funzioni all’interno della
pianta8:
-protezione dai raggi UV,
-protezione contro ossidanti o radicali liberi,
-modulazione dell’attività enzimatica,
-attrazione o repulsione degli insetti,
-nodulazione nelle piante leguminose,
-germinazione del polline.
Sembra che i flavonoidi siano stati durante l’evoluzione componenti vitali delle
piante, permettendo a queste di svilupparsi nelle terre emerse primigenie
fornendo loro protezione dai raggi UV in assenza dello strato di ozono.
La variabilità strutturale all’interno della classe dei flavonoidi si manifesta
principalmente in due aspetti:
-nei suoi sostituenti, che possono essere gruppi ossidrilici, metossilici o
glicosidici, sugli anelli benzenici o su quello piranico
-nelle variazioni dell’anello piranico.
Nelle piante i flavonoidi sono frequentemente legati a zuccheri, formando OGlicosidi e C-glicosidi.
8
Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications, Ferreyra et Al.,
Frontiers in Plant Science, 2012, Volume 3, Article 222.
20
I flavonoidi sono una classe piuttosto diffusa nel regno vegetale, e sono parte
integrante della nostra dieta: si trovano nelle foglie. nella frutta, e nei semi;
abbondano nel te, nel vino ed in molti altri alimenti. Si stima che il consumo
giornaliero di flavonoidi sia di 1-2 g9.
Sono state riportate per i flavonoidi diverse benefiche attività biologiche8; tra
queste abbiamo:
 antiinfiammatoria
 antibatterica
 antivirale
 antiallergica
 citotossica
 antitumorale
 stimolante le funzione cognitive
 vasodilatatoria
 inibitoria dell’ossidazione delle LDL (low density lipoprotein)
 inibitoria dell’aggregazione piastrinica
 inibitoria degli enzimi ciclo-ossigenasi e lipo-ossigenasi
9
A Review of Phytochemistry and Pharmacology of Flavonoids, Bimlesh Kumar et al., Internationale
Pharmaceutica Sciencia, 2011, Vol 1, Issue 1.
21
Tricina
La tricina è un flavone di-metilato. Studi recenti sembrano indicare che la
tricina sia presente in natura più frequentemente di quanto si pensasse10: si
trova generalmente nel grano e nei cereali. Ha un ampio spettro di attività
biologiche, superiore a quello riportato per altri flavonoidi in alcuni aspetti;
per questo motivo si sta cercando di capirne con maggiori dettagli la
biosintesi,11 e si spera di potere in futuro, tramite ingegnerizzazione del
pathway metabolico biosintetico, ottenerne maggiori quantità. Un’altra
strategia è focalizzata ad incrementare il suo accumulo nel grano che
potrebbe pertanto essere utilizzato in futuro come nutraceutico (alimento che
offre benefici di tipo preventivo o di trattamento nei confronti di una
determinata malattia).
La tricina è stata isolata per la prima volta nella specie di grano Triticum
dicoccum,12 ed è prodotta come risposta a stress ambientali o a patogeni.11
10
Occurrence and distribution of the flavone Tricetin and its methyl derivatives as free aglycones,
Wollenweber et al, Natural Product Communications, 2008, 3 (8), 1293-1298.
11
Tricin biosynthesis during growth of wheat under different abiotic stresses, Amira Moheb et al, Plant
Science, 2013, 201–202, 115-120.
12
The yellow coloring matter of Khapli wheat, Triticum dicoccum. Anderson JA II. The constitution of
tricetin. Can. J. Res., 1932, 7, 285–292.
22
Rivelazione tramite fluorescenza dell'accumulo di tricina in semi sotto stress ambientale
11
È stato riportato che anche la tricetina (figura sottostante), precursore della
tricina, sia distribuita in natura più ampiamente di quanto si credesse in
passato;13 inoltre questi flavonoidi sono stati isolati in specie non correlate fra
di loro e quindi la loro presenza non ha un grande significato tassonomico.
Tricetina
23
In letteratura sono presenti diverse pubblicazioni che documentano la
presenza della tricina nel regno vegetale13, questa molecola può essere
trovata sia in forma glicosilata o come aglicone. Nelle prossime tabelle
vengono elencate alcune specie nelle quali è indicata la presenza di questo
flavone13.
Specie vegetale
Autori
erba, Carex spp e palme
Harborne and Hall 1964;
Harborne 1975;
Riso, mais, orzo e avena
Harborne and Williams 1976
Phoenix formosana
Lin et al. 2009
Ficus sp
Zhang et al. 2008a, b
Bamboo foglie
Jiao et al. 2007
Saccharum officinarum
Duarte-Almeida et al. 2007;
Colombo et al. 2006
Sasa borealis (Poaceae)
Par et al. 2007
Sorghum bicolor
Kwon and Kim 2003
Japanese millet
Watanabe 1999
Medicago sativa
Stochmal et al. 2001
Trigonella foenum-graecum
Shang et al. 1998
Orobanche ramosa
Melek et al. 1992
Pyrethrum tatsienense
Yang et al. 2006
Lycopodium japonicum
Yan et al. 2005
La tricina libera o glicosilata è presente nelle piante in associazione con altri Cglicosilflavoni e di derivati dei flavonoli,14 tutti immagazzinati nei vacuoli.15
13
Tricin—a potential multifunctional nutraceutical, Jin Min Zhou et Al., Phytochem Rev, 2010, 9:413–
424.
14
Occurrence of tricin and of glycoflavones in grasses , Harborne JB, Hall E) Phytochemistry Plant
polyphenols. XII, 1964, 3, 421–428
24
In seguito sono elencate le forme glicosilate di cui si ha registro13.
Forma
glicosilata
Autori
della tricina
7-O-b-D-glucopiranoside
Mabry et al. 1984; Lin et al.
2009; Park et al. 2007; Wang et
al. 2004; Zhang et al. 2008a
5-glucoside
Wallace 1974; Adjei-Afriyie et al.
2000a, b
5-glucoside
Polyakova 1992
5-diglucoside
5,7-glucoside
4’-glucoside
Hasegawa et al. 2008
4’-apioside
Syrchina et al. 1992
7-glucuronide
Harborne and Hall 1964;
Markham and Porter 1973
7-diglucuronide
Timoteo et al. 2008
7-glucuronide solfato
Williams et al. 1983
Glicosidi di tricina legata
ad un gruppo solfato
Harborne and Williams 1976
7-(2’’-ramnosil)-agalacturonide
Mabry et al. 1984
7-glucuronide-4’glucoside
Stochmal et al. 2001; Kowalska
et al. 2007
7-diglucuronide
Timoteo et al. 2008
7-neoesperidoside
Colombo et al. 2006, 2008
Derivati
di
flavolignani
15
The biology and structural distribution of surface flavonoids, Joseph CO, Grotewold E , Rec Res
Develop Plant, 2004,Sci 2:1–19
25
7-b-(6’’-metossi
cinnamoil)-glucoside
Duarte-Almeida et al. 2007
4’-b-guaiacil-gliceril
Bouaziz et al. 2002; Lei et al.
2007
4’-(b-guaiacil-gliceril)-7-bglucoside
Yang et al. 2006
7-[20-p-cumaril]-btriglucuronide
Nakajima et al. 2003
feruloil diglcuronide
Kowalska et al. 2007
Tricina C-glicosidi e
metil eteri
6-C-xiloside-8-C-esoside
Theodor et al. 1980; 1981
6,8-di-C-glicoside
Theodor et al. 1980; 1981
6,8-di-C-glucoside
Theodor et al. 1980; 1981
7- O-metil etere
Shao et al. 2008; Yamazaki et al.
2007; Zhao et al. 2007
4’-O-metil etere
Yang et al. 2006; Shao et al. 2008
La glicosilazione ed alcuni tipi di derivatizzazione della tricina la rendono più
solubile in acqua, nonostante essa venga accumulata come aglicone nelle
foglie, fiori ed altri tessuti vegetali.10
La lipofilia dell’aglicone permette alla tricina di passare più facilmente
attraverso le membrane cellulari e di agire in modo più efficace contro
erbivori e patogeni.
Il precursore della tricina, la tricetina, è stata riportata in letteratura come
glicoside nel 1986, e come aglicone nel 1997.10 La scarsa distribuzione della
tricetina nelle piante può essere attribuita alla sua citotossicità: si rende
necessaria la derivatizzazione dei suoi gruppi ossidrilici e quindi la
trasformazione in tricina, composto meno tossico, come verrà discusso in
seguito.
26
Resa dell’isolamento di tricina da altre piante
Ad oggi la quantità maggiore di tricina isolata, pari a 1.93 mg/g, è stata
riportata da una varietà medicinale di riso (Oryza sativa) del Kerala, una
regione dell’India. Nella seguente tabella vengono riportati le quantità e le
specie dalle quali la tricina era stata isolata precedentemente a partire di
materiale essiccato.16
Specie
Quantità
Autori
Triticum spp
1.3 g da 5.8 kg
0.224 mg/g
Anderson e Perkin
1931
Triticum aestivum
0.77 g/kg
0.77 mg/g
Sarhan et al 2013
Spartina cinosuroides
45 mg da 9 kg
5 µg/g
Miles et al 1983
canna da zucchero
13 µg in 100 g
0.13 µg /g
Duarte-Almeida et al
2007
germoglio di bambù
3.09 g da 5 kg
0,618 mg/g
Jiao et al 2007
Desmostachia bipinnata
100 mg/kg
0,1 mg/g
Awaad et al. 2008
A differenza di molti composti flavonoidici, la tricina non è disponibile
commercialmente e l'isolamento è spesso limitato dalla sua bassa
abbondanza; inoltre non è prodotta in maniera uniforme dalle specie note che
la sintetizzano. In alternativa vi è la sintesi chimica,17 sicuramente utile per
effettuare ulteriori sperimentazioni18 e test farmacologici. Tuttavia, uno studio
16
Isolation, Characterization and Quantification of Tricin and Flavonolignans in the Medicinal Rice
Njavara (Oryza sativa L.), as Compared to Staple Varieties, Smitha et al, Plant Foods Hum Nutr., 2011, 66, 91–96
17
Synthetical experiments in the chromone group. IX. A synthesis of 5,7,4’-trihydroxy-3’,5’dimethoxyflavone, believed to be identical to tricin, Gulati et al., J Chem Soc, 1933, 942–943
18
Synthesis of tricin, the vir-gene inducing expression factor , Shong X-H et al., Zhongshan Daxue
Zueban, 1999, 38:127–128
27
recente propone il Triticum aestivum, una specie di grano, coltivato in
condizioni controllate, come fonte poco costosa di tricina.19
Importanza biologica della Tricina
Alcune delle attività biologiche determinate per la tricina13 sono riportate nella
seguente tabella:
Attività
Autori
Attività fungicida nei confronti di 34 specie
fungine diverse
Weidenborner e Iha 1997
Inibizione della crescita del micelio di
Oryzae pyricularia e Rhyzoctinia solani e
battericida
Lakse Pruner 1989; Zhang et al. 1996;
Padmavati et al. 1997; Almada-Ruiz e
Martinez-Tellez 2003; Pretorius 2003;
Kong et al. 2004
Attività di difesa contro piante infestanti,
batteri e funghi
Bylka et al 2004;. Kong et al. 2004;
Tsuchida 2008
Erbicida
Chung et al. 2005
Inibizione della germinazione
Cooper et al. 1977
Fattore di trascrizione del gene vir nel riso
Cummins et al. 2006
Interazioni pianta-insetto
Adjei-Afriyie et al 2000a, b;. Simmonds
2003; Ling et al. 2007
Anti-feedant contro Anthonomus grandis
Miles et al. 1993
Boh
19
Winter wheat hull (husk) is a valuable source for tricin, a potential selective cytotoxic agent, A. Moheb
et al. / Food Chemistry, 2013, 138, 931–937
28
Forse ancora più interessanti sono le attività della tricina sull’uomo. Esse sono
correlate a quelle dei flavonoidi che sono coinvolti nella cardioprotezione,
neuro-protezione e chemoprevenzione. Tradizionalmente le attività benefiche
dei flavonoidi sono state attribuite alle loro proprietà antiossidanti e di
scavenging dei radicali liberi. Tuttavia, studi recenti indicano che la tricina e
altri flavonoidi influenzano fortemente il signaling intracellulare e
l'espressione genica attraverso interazioni con proteine specifiche. I flavoni
metossilati, come la tricina, hanno una migliore biodisponibilità rispetto ad
altri flavonoidi. Inoltre è stata indicata una migliorata biodisponibilità della
tricina dopo derivatizzazione con aminoacidi.20
Studi recenti conferiscono alla tricina un’ importante attività antivirale nel
confronto del citomegalovirus,21 una potenziale attività inibitoria dell’enzima
tirosinasi nella produzione di melanina22 ed una protezione cellulare nell’
ischemia cerebrale tramite l’inibizione della reazione infiammatoria che
coinvolge l’attivazione di NF-ĸB.23 La tricina inoltre inibisce la proliferazione di
cellule epatiche indotta da PDGF in malattie croniche del fegato.24 In un altro
lavoro è stata dimostrata una potente attività di inibizione della crescita di
linee cellulari di un tumore epatico (HepG2) e del pancreas (INS832/13).13
20
Increased Bioavailability of Tricin-Amino Acid Derivatives via a Prodrug Approach, Masayuki et al., J.
Med. Chem. 2011, 54, 1529–1536
21
Anti-cytomegalovirus effects of tricin are dependent on CXCL11, T. Murayama et al. / Microbes and
Infection, 2012, 14, 1086-1092
22
Molecular inhibitory mechanism of tricin on tyrosinase, Y. Mu et al. / Spectrochimica Acta Part A:
Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2013, 107, 235–240
23
Tricin 7-glucoside protects against experimental cerebral ischemia by reduction of NF-ĸB and HMGB1
expression, W.-L. Jiang et al. / European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2012, 45, 50–57
24
Tricin Inhibits Proliferation of Human Hepatic Stellate Cells In Vitro by Blocking Tyrosine
Phosphorylation of PDGF Receptor and its Signaling Pathways, Seki N., Journal of Cellular Biochemistry, 2012,
113, 2346–2355
29
Nella tabella seguente sono elencate le principali attività sull’uomo13.
Attività
Autori
Antiossidante
Watanabe 1999; Kwon et al. 2002, Kwon e
Kim 2003; Lu et al. 2006; Maurıcio DuarteAlmeida et al. 2006; Hasegawa et al. 2008;
Mu et al. 2008
Potente inibizione della lipoperossidazione
Rice-Evans et al. 1997;
Effetto di risparmio sulla vitamina E
(sinergismo)
Pietta 2000
Antivirale
Li et al 2005;. Sakai et al 2008
Antistaminico
Kuwabara et al. 2003
Immunomodulatore
Liang et al 1997;. Wang et al 2004.
Antitubercolare
Gu et al. 2004
Rilassamento della muscolatura liscia
Bichoff et al. 1964
Antitumorale
Lee et al 1981;. Miles et al 1983;. Hudson et
al. 2000, 2004, Cai et al. 2004, 2005, 2009;
Yanet al. 2005
Inibizione della proliferazione di cellule
tumorali umane del colon, del fegato e del
pancreas
Hudson et al 2000;. Cai et al.2004; Serhan et
al. 2013
Inibizione della proliferazione linfocitaria
Xiong et al. 2006
Agente chemio-preventivo del cancro
Verschoyle et al. 2006; Serhan et al. 2013
Citotossico selettivo contro cellule resistente
nel cancro alla mammella
Duarte-Almeida et al. 2007
Inibizione competitiva dell'enzima
sulfotransferasi
Harris e Waring2008
30
Il genere Huperzia
Huperzia è un genere di piante vascolari che
appartiene alla divisione delle Lycophyte nella famiglia
delle Lycopodaceae. Il genere Huperzia è stato
originariamente incluso nel genere Lycopodium, dal
quale differisce perché non ha foglie sporangiali
differenziate, e perché gli sporangi non producono
strobili. Studi di metaboliti secondari sono stati
effettuati per chiarire la loro classificazione tassonomica,25 e una diversità nei
profili dei flavonoidi è stata evidenziata tra il genere Huperzia e altre
Lycopodiaceae.26 Questi studi hanno evidenziato la presenza di tricina in
elevate quantità. Il genere Huperzia è molto importante dal punto di vista
evolutivo: i suoi esemplari sono considerati dei fossili viventi perché sono
discendenti delle prime piante vascolari esistenti e tra le prime a produrre
tracheidi,27 le cellule specializzate nel trasporto di acqua e nutrienti. Queste
specie hanno subito importanti cambiamenti genetici che hanno permesso loro
di adattarsi e colonizzare le
terre emerse nel periodo
Devoniano inferiore (circa
400 milioni di anni fa)
rivoluzionando la vita sulla
Terra.
25
Phenolics acids in the genus Lycopodium, Pedersen et al., Biochemical Systematics and Ecology, 1982,
10, 3-9
26
Etude Chimiosystematique des Lycopodiales, Isoetales, Selaginellales et Psilotales, Voirin et al.,
Biochemical Systematics and Ecology, 1978, 6, 99-102
27
The origin and early evolution of tracheids in vascular plants: integration of palaeobotanical and
neobotanical data, W. Friedman et al. Phil.Trans. R. Soc. Lond. B, 2000, 355, 857-868
31
Il genere Huperzia si trova a metà strada tra le briofite e le angiosperme nella
linea evolutiva.28
Studi filogenetici hanno analizzato il loro
condroma (materiale genetico mitocondriale) e
hanno evidenziato che queste primitive piante
vascolari sono state molto attive dal punto di
vista
genetico:19
duplicazione
e
cambiamenti
mutazione
casuali,
genetici,
hanno
prodotto nuovi enzimi a partire dai geni del
metabolismo primario,29 creando nuove vie
metaboliche, come la via biosintetica ai
flavonoidi,30
che
ebbe,
filogeneticamente
parlando, inizio nelle briofite.
La produzione di flavonoidi e di altri composti
fenolici ha fornito un vantaggio evolutivo nella
colonizzazione della superficie terrestre. È da
ricordare che durante i primi stadi evolutivi del pianeta, quando non si era
ancora formato lo strato di ozono nell'atmosfera, i flavonoidi si sono dimostrati
essere efficaci agenti protettivi contro i danni causati ai tessuti fotosintetici e al
DNA da parte delle radiazioni UV.31
Ad oggi, esistono circa 400 specie note di Huperzia distribuite nel mondo,
suddivise in due gruppi secondo l’ambiente in cui si trovano: Huperzia in senso
28
The Mitochondrial Genome of the Lycophyte Huperzia squarrosa: The Most Archaic Form in Vascular
Plants, Yang et al., PLoS ONE, 2012, 7, e35168
29
The evolution of flavonoids and their genes, MARK D. RAUSHER, Department of Biology, Box 90338,
Duke University, Durham, NC 27708 USA.
30
Flavonoid Evolution: An Enzymic Approach, Helen A. Stafford, Plant Physiol. 1991, 96, 680-685
31
The role of UV-B radiation in aquatic and terrestrial ecosystems—an experimental and functional
analysis of the evolution of UV-absorbing compounds, Rozema et al, Journal of Photochemistry and
Photobiology B: Biology, 2002, 66, 2–12
32
stretto, che abitano climi temperati e freddi e Phlegmarius, che si ritrovano
soprattutto in ecosistemi tropicali e subtropicali32.
Hughes et Al. hanno messo in evidenza che le specie vegetali che si trovano
sulle Ande33 hanno subito la più spettacolare diversificazione in specie finora
documentata; questo fenomeno si è verificato anche per il genere Huperzia,
specialmente per le specie ecuadoriane.
Gli ecosistemi del pàramo dell' Ecuador sono l´habitat di crescita di una grande
varietà di specie della famiglia delle Lycopodiaceae, che comprendono diverse
specie del genere Huperzia; nella provincia di Loja, nella parte meridionale
dell'Ecuador, sono presenti 33 specie della famiglia Lycopodiaceae e tra queste,
sono ben 28 le specie che appartengono al genere Huperzia.
Dal punto di vista etnobotanico l’uso di queste piante è parte delle conoscenze
tradizionali della popolazione dei Saraguro,
nella provincia di Loja in Ecuador. Secondo
Jørgensen & León, sono state registrate 11
diverse
specie
appartenenti
al
genere
Huperzia34 impiegate dagli indigeni Saraguro
come piante medicinali.
I Saraguro hanno una visione magico-religiosa
del mondo: considerano le malattie come un
disequilibrio
energetico
all’interno
dell’individuo e una mancanza di armonia con
la realtà che lo circonda. Anche il trattamento
32
Warren H. Wagner Jr. & Joseph M. Beitel, Lycopodiaceae, Flora of North America Editorial Committee,
Flora of North America North of Mexico. New York and Oxford. Vol. 2
33
Island radiation on a continental scale: Exceptional rates of plant diversification after uplift of the
Andes, Hughes and Eastwood, PNAS, 2006, 103, 10334–10339
34
Catalogue of the vascular plants of Ecuador, Jørgensen, P.M. & S. León-Yánez (eds.), Monogr. Syst.
Bot. Missouri Bot. Gard. 1999, 75: i–viii, 148-152
33
e la cura delle malattie hanno una connotazione magica e vengono utilizzate
alcune piante nei rituali di guarigione. Le persone specializzate nella pratica
medicinale e ritualistica dentro la comunità vengono chiamati Yachak o
guaritori. Nella tabella seguente vengono descritte le principali malattie di tipo
soprannaturale trattate dai yachak35.
Malattia
Definizione
ESPANTO
E 'prodotto da esperienze spiacevoli, incidente che generano un forte impatto
emotivo.
VAHO DE
AGUA
Si verifica quando la persona è esposta al vapore acqueo, attraversando un
ponte, le persone con contusioni, fratture, ferite, lesioni; le donne dopo il parto
sono le più esposte.
MAL
D’ARIA
E 'causata da esposizione a forti venti, mentre la persona cammina ad altitudine
elevata o si trova a contatto con l'aria fredda all’uscita da un luogo caldo.
MAL
HECHO
Il MAL HECHO può essere tanto una malattia organica come psicologica; è
provocata intenzionalmente da una persona su un altra. La gelosia, rivalità,
invidia sarebbero i motivi per cui alcune persone causano male agli altri.
SHUKA
È simile al MAL DELL´OCCHIO e per i Saraguro esistono persone che hanno una
forte “energia” nei propri occhi; se questi individui con lo sguardo forte o
“energizzante” osservano un’altra persona con mala intenzione le provocano la
shuka; i bambini piccoli hanno la maggiore probabilità di ammalarsi per la SHUK
e secondo i Saraguro la malattia si verifica anche negli animali.
Le Huperzie vengono usati dai yachak principalmente per ‘visionare’,
inducendo o potenziando l’effetto allucinogeno in preparazione che
contengono anche il ‘San Pedro’ Echinopsis pachanoi. In altri casi vengono
usate come purgante intestinale.
In seguito sono elencate le piante
appartenenti alla famiglia Lycopodiaceae che vengono usate dai yachak.31
35
Etnobotanica, ecologia e isolamento dei metaboliti secondari dalle specie psicoattive della famiglia
lycopodiaceae utilizzate dai Saraguro nel sud dell’Ecuador, Armijos Chabaco, 2012
34
Uso tradizionale
Applicazione
Espanto, shuka, mal aire. Purgante, vaho
de agua.
Topica.
Espanto, vaho de agua.
Topica.
Espanto, mal aire , purgante.
Topica,
orale.
Espanto. Shuka, mal´aira , purgante,
visionar, vaho de agua.
Topica,
orale.
Espanto, shuka, mal aire.
Topica.
Shuka, mal aire , vaho de agua, purgante,
mal hecho, espanto.
Topica,
orale.
Espanto, shuka , mal aire, purgante ,
visionar, vaho de agua, mal hecho.
Orale.
Shuka, purgante, visionar, espanto, vaho
de agua.
Topica,
orale.
Shuka, purgante, espanto, vaho de agua.
Topica,
orale.
Specie / Nome indigena
Huperzia brevifolia (Grew. &
Hook.) Holub
WAMINGA VERDE
Huperzia columnaris B. Øllg.
WAMINGA OSO
Huperzia espinosana B. Øllg..
WAMINGA OSO WARMI
Huperzia weberbaueri (Nessel)
Holub
WAMINGA SUCA
Huperzia crassa (Humb. &
Bonpl. ex Willd.) Rothm.
WAMINGA AMARILLA
Huperzia compacta (Hook.)
Trevisan
WAMINGA ROJA O WAMINGA
VERDE
Huperzia tetragona (Grew. &
Hook.) Trevisan
TRENCILLA VERDE
Huperzia tetragona (Grew. &
Hook.) Trevisan
TRENCILLA ROJA
Huperzia tetragona (Grew. &
Hook.) Trevisan
TRENCILLA AMARILLA
Le specie di Huperzia analizzate in
questo lavoro di tesi, sono tutte
utilizzate come rimedi naturali dai
Saraguro; inoltre due di esse,
Huperzia espinosana (B. Øllg)36 e
Huperzia compacta (Hook)
sono
36
37
endemiche.
La
37
,
tabella
Huperzia espinosana B. Øllg.; Harling & Andersson, Fl. Ecuador 1988, 33: 47, f. 7A
Huperzia compacta (Hook.) Trevis.; Atti Soc. Ital. Sci. Nat., 1874 17: 249
35
seguente indica le piante studiate in questa tesi, le coordinate geografiche del
luogo di ritrovamento e l'altitudine del punto di raccolta.
Specie:
Coordinate geografiche
nome scientifico / nome indigena
UTM ed Altitudine
Huperzia compacta (Hook.)
Trevisan
WAMINGA ROJA
Huperzia espinosana
B. Øllg.
WAMINGA OSO WARMI
(17)694877E-954739N
3128 m s.l.m.
Huperzia brevifolia (Grew. &
Hook.) Holub
WAMINGA VERDE
Huperzia kuestery
B. Øllg
Huperzia crassa (Humb. & Bonpl.
ex Willd.) Rothm.
WAMINGA AMARILLA
(17)686161E-9589043N
3621 m s.l.m.
36
Procedura esperimentale
In questo capitolo saranno trattati:
- il processo di ottenimento delle frazione flavonoidiche
- l’analisi delle frazioni in LC-UV-MS
- la preparazione della curva di taratura
- la quantificazione della Tricina negli estratti
- separazione di fitocomposti di Huperzia espinosana
37
Ottenimento delle frazione flavonoidiche
Il seguente schema rappresenta i processi a cui è stata sottoposta ogni pianta; i
processi, esaminati singolarmente, verranno spiegati nelle pagine successive.
In seguito vengono elencati i nomi delle specie prese in esame ed i relativi
quantitativi di pianta secca che hanno costituito la biomassa di partenza.
 Huperzia kuesteri
(HK) (38,68g)
 Huperzia brevifolia
(HB) (21,95g)
 Huperzia espinosana
(HE)
 Huperzia crassa
(HCS) (200g)
 Huperzia compacta
(HCT) (200g)
(48,12g)
38
Estrazione acida e ottenimento delle torte
La parte aerea di tutte le piante è stata essiccata da due a tre settimane a
temperatura ambiente. Il materiale essiccato è stato macinato fino a ottenere
una polvere. Successivamente, la polvere è stata macerata utilizzando come
solvente di estrazione una miscela idroalcolica (metanolo: acqua in rapporto
90:10), per ottenere l'estratto totale di ogni pianta. La macerazione è stata
eseguita ripetutamente ed esaustivamente rinnovando ogni volta la miscela
idroalcolica. È stato usato un test specifico per gli alcaloidi, il test di
Dragendorff, per verificare l’ assenza di alcaloidi nell’ ultimo estratto.
Il macerato è stato filtrato e concentrato sotto pressione ridotta per ottenere
un estratto di aspetto sciropposo (A) che è stato trattato nuovamente con una
soluzione di acido solforico (H2SO4) al 2%.
Per ulteriore filtrazione sono state ottenute due frazioni: una soluzione acida
(B) (pH 2-3) contenente gli alcaloidi come sali solfato, ed una parte solida che
non contiene alcaloidi (C). Per estrarre gli alcaloidi dalla soluzione acida è stata
eseguita la seguente procedura.
La soluzione acida (B) è stata inizialmente ripartita con cloroformio per
rimuovere le sostanze organiche non salificate che ostacolerebbero le
successive fasi di purificazione. Successivamente, la soluzione acida è stata
neutralizzata a pH 7 con una soluzione acquosa di ammoniaca ed è stata
nuovamente estratta con cloroformio. Finalmente la soluzione è stata
alcalinizzata fino a pH 12 con ammoniaca acquosa cosi da estrarre gli alcaloidi
con cloroformio. L'estrazione liquido-liquido è stata ripetuta fino a quando il
test di Dragendorff è risultato negativo. Le frazione organica contenente gli
alcaloidi è stata svaporata in una camera di estrazione con circolazione
continua dell'aria durante 72 ore; i residui secchi contenenti gli alcaloidi sono
39
stati poi pesati ed etichettati per essere sottoposti alle successive analisi
chimiche.
Nel processo di estrazione degli alcaloidi, dopo trattamento con acidi
dell’estratto A per ottenere la frazione alcaloidea B, il solido trattenuto sul filtro
C è stato raccolto, neutralizzato con NH3 e poi essiccato; da questa frazione non
alcaloidea è stata isolata la tricina e gli altri flavonoidi delle specie del genere
Huperzia prese in esame.
Processo di estrazione acida degli alcaloidi
I lavoro descritto successivamente riguarderà le frazioni non alcaloidee (FNA) o
residuo C. Nella seguente tabella sono riportati, per ciascuna Huperzia, il peso
della frazione non alcaloidea e la sua resa percentuale rispetto alla pianta secca
analizzata.
40
Pianta
Pianta secca (g)
FNA (g)
%
HK
38,68
4,69
12,12
HB
21,95
5,87
27,71
HE
48,12
4,65
9,66
HCS
200
15,6
7,80
HCT
200
18,08
9,04
Come si può notare dall’analisi in TLC sotto riportata, le frazioni non alcaloidee
contengono principalmente due classi di metaboliti secondari potenzialmente
interessanti per la nostra ricerca: flavonoidi e terpenoidi. I due gruppi risultano
cromatograficamente ben separabili.
TLC-Frazione non alcaloidea. (MeOH:H2O-9:1)
In ordine da sinistra:, H.kue, H. bre, H.cta, H. esp, H. css
41
SPE (Solid phase extraction)
Per ottenere delle frazioni arricchite in flavonoidi (FAF) sono state utlizzate due
differenti tecniche cromatografiche: la SPE (solid phase extraction) e la TLC
(thin layer chromatography) preparativa.
La SPE è una tecnica di estrazione che utilizza l'affinità di una fase solida,
impaccata in una cartuccia, per una o più sostanze presenti in una matrice più o
meno complessa.
Il campione sciolto in un solvente appropriato viene adsorbito sulla fase solida,
e viene quindi eluito tramite un’ opportuna fase mobile.
Flavonoidi vengono eluiti, mentre terpeni e clorofille vengono trattenuti dalla fase stazionaria
La tecnica SPE con cartucce di RP-18 è stata utilizzata sia per rimuovere
l’abbondante clorofilla presente negli estratti che per separare il gruppo dei
42
flavonoidi da quello dei terpeni. A tale scopo è stato prelevato un grammo da
ogni residuo non alcaloideo (C) cercando di solubilizzarlo in una miscela di
solventi adatta (MeOH / H2O, 4 : 1) per eseguire le separazioni in SPE, su
cartucce contenenti 10 g di fase stazionaria. Tuttavia si è notata la presenza di
una parte non solubile, probabilmente di natura molto lipofila. I campioni sono
stati pertanto centrifugati e i surnatanti sono stati recuperati per aspirazione
con una pipetta e sottoposti alla separazione SPE. Tramite questo processo si
sono ottenute frazioni arricchite in flavonoidi, separate da terpeni e clorofilla,
più trattenuti sulla fase stazionaria; più in dettaglio:
- una prima frazione costituita principalmente da flavonoidi, eluita con una
soluzione MeOH /H2O,4: 1.
- una seconda frazione costituita da terpeni e clorofilla, eluita con 100% MeOH.
- una terza frazione con le clorofille eluita con 100% acetone.
Nella seguente tabella sono riportati pesi e % delle diverse frazioni arricchite in
flavonoidi.
FNA (1g)
FAF (mg)
%
HK
169
16,9
HB
395
39,5
HE
280
28,0
HCS
170
17,0
HCT
692
69,2
Residuo C
43
TLC preparative (cromatografia su strato sottile)
Da ogni frazione costituita principalmente da flavonoidi ottenuta con la tecnica
SPE, sono stati prelevati 20 mg che sono stati sottoposti ad un'ulteriore
purificazione mediante TLC preparative.
La TLC preparativa non è altro che una cromatografia su strato sottile dalla
quale si recuperano selettivamente gli eventuali analiti separati.
Lo scopo di questo processo è stato quello di ottenere frazioni costituite solo
da molecole di natura flavonoidica, atte ad una successiva analisi mediante LC.
I campioni, solubilizzati in MeOH, sono stati adsorbiti su lastre di vetro per TLC
in fase inversa RP-18. La miscela eluente utilizzata era costituita da (MeOH /
H2O, 4 : 1). La fase stazionaria è stata asportata dal supporto in vetro in
corrispondenza
unicamente
dei
composti
flavonoidici,
rivelati
dalla
caratteristica fluorescenza alla luce UV e dalla colorazione giallo intenso con il
reattivo alla vanillina. Le polveri così ottenute sono state quindi eluite con
MeOH puro, consentendo di calcolare la resa percentuale del processo
(mostrata in tabella).
FAF
Flavonoidi
(20 mg)
(mg)
HK
6
30
HB
9
45
HE
10
50
HCS
13
65
HCT
11
55
Percentuale %
44
Nome
Pianta
Torte (g) % F in FNA % F in Pianta seca
secca (g)
HK
38,68
4,69
5,07
0,614484
HB
21,95
5,87
17,775
4,925453
HE
48,12
4,65
14
1,3524
HCS
200
15,6
11,05
0,8619
HCT
200
18,08
38,06
3,440624
Dalle rese ottenute nei processi di purificazione, la percentuale di flavonoidi più
alta trovata è stata nelle piante H. brevifolia e H. compacta. Mentre H. kuestery
sembra produrre poche quantità di flavonoidi.
45
Analisi UPLC delle Frazioni Flavonoidiche
Le frazioni composte dai soli flavonoidi, ottenute dalle TLC preparative, sono
state analizzate (alla concentrazione di 1mg/mL ed iniettando un volume di 5µL
di MeOH per HPLC) mediante UPLC con colonna di fase inversa (ved. sezione:
materiali), secondo un gradiente crescente di polarità, con un flusso di 1
mL/min. Il rivelatore UV è stato impostato sulla lunghezza d'onda di 350nm.
Gli ultimi 10 minuti dell’eluizione sono serviti a riportare la colonna
cromatografica nelle condizioni iniziali della corsa, prima di proseguire con
l'analisi successiva. Nelle seguenti pagine si mostrano i profili cromatografici di
ogni frazioneNelle pagine successive sono riportati i cromatogrammi delle analisi delle
frazioni flavonoidiche delle diverse piante. Le aree dei diversi picchi danno solo
una stima qualitativa della concentrazione relativa dei diversi flavonoidi, dato
che il coefficiente di estinzione a 350 nm può evidentemente variare da
composto a composto.
46
Huperzia crassa
Peak Name
tR
Area
1
7,330
296228 44737 23,868
35,565
2
7,447
433618 50466 34,939
40,119
3
9,207
11811
1579
0,952
1,255
4
9,827
70225
7196
5,658
5,720
5
10,153 220654 10760 17,779
8,554
7
10,897 178337
9108
14,369
7,240
8
14,380
1404
2,120
1,116
26315
Height Area% Height%
Nota: Il picco 6 che si osserva nel grafico non è stato considerato nella tabella.
47
Huperzia espinosana
Peak Name
tR
Area
Height Area% Height%
1
7,313
2
9,190
1318
216
0,102
0,302
3
9,793
46783
5057
3,627
7,073
4
10,130
25891
1448
2,007
2,025
5
10,883
43286
2229
3,356
3,117
6
12,677
18791
1170
1,457
1,636
7
13,007
5943
418
0,461
0,585
8
14,290 809089 34837 62,732
48,722
338660 26127 26,258
36,540
48
Huperzia compacta
Peak Name
tR
Area
Height
Area%
Height%
1
15,560
1082491
37383
77,307
67,458
2
21,507
32277
921
2,305
1,661
3
23,137
57378
3243
4,098
5,852
4
23,600
228111
13869
16,291
25,028
49
Huperzia brevifolia
Peak Name
tR
Area
Height Area% Height%
1
13,410
10516
658
0,268
0,512
2
14,167
4730
247
0,120
0,192
3
15,553 3114912 83689 79,280
65,019
4
20,963
109604
2035
2,790
1,581
5
22,907
99456
3997
2,531
3,106
6
23,437
359824 25395
9,158
19,730
7
23,653
229970 12694
5,853
9,862
50
Huperzia kuestery
Peak Name
tR
Area
Height Area% Height%
1
7,523
22897
1850
0,680
1,769
2
10,127
4616
512
0,137
0,490
3
13,337
9575
609
0,284
0,582
4
13,953
17543
1039
0,521
0,994
5
15,530 2622234 64858 77,887
62,013
6
20,673
209793
3741
6,231
3,577
7
22,660
42376
1947
1,259
1,862
8
23,290
277949 19997
8,256
19,120
9
23,543
159728 10033
4,744
9,593
51
Elaborazione e comparazione dei profili metabolici delle diverse frazioni
Dai tempi di ritenzione nei profili cromatografici è stata ipotizzata l’esistenza di
16 composti distribuiti diversamente tra le piante. È stato utilizzato la media
del tempo di ritenzione della tricina (picco 11) come referente per normalizzare
i tempi di ritenzione tra i diversi analisi.
H
H
H
H
H
crassa
espinosana
compacta
brevifolia
kuestery
1
6,954
7,984
dv.st
CV%
0
0
2
7,911
0,051 0,652
3
8,028
4
9,788
9,861
9,558 0,158 1,626
5
10,408
10,464
0,040 0,384
6
10,734
10,801
0,047 0,438
7
11,478
11,554
0,054 0,471
0
8
12,818
9
13,348
10
13,678
11 14,961
14,961
12,768 0,035 0,278
0 0,000
14,961
12
13
0
13,575
13,384 0,148 1,099
14,961
14,961
20,371
20,104 0,188 0,933
20,908
14
0
0
0
0
22,315
22,091 0,158 0,712
15
22,538
22,845
22,721 0,155 0,680
16
23,001
23,061
22,974 0,045 0,194
52
In chimica analitica, verificare la specificità del metodo per un analita, cioè che i
picchi all’interno di un cromatogramma non siano una somma di più composti,
è molto rilevante. Inizialmente bisognerebbe valutare la purezza di ogni
componente (picco); inoltre è necessario considerare la variabilità interna della
matrice biologica analizzata: è possibile che lo stesso composto, all'interno di
due matrici diverse presenti tempi di ritenzione leggermente differenti. Ciò può
essere correlato, non tanto ad un'inadeguatezza del metodo d'analisi scelto,
quanto alla variabilità del campione.
Per risolvere questi inconvenienti sono stati utilizzati, in accoppiamento alla
separazione cromatografica, un rivelatore Photodiode Array ed uno
spettrometro di massa: in questa maniera è stato possibile identificare
univocamente ciascun picco mediante il profilo di assorbimento UV e la massa
dello ione.
In seguito è riportata una tabella riassuntiva dei composti e la massa dello ione
rilevato in MS. Nelle seguenti pagine si riportano il profilo di assorbimento UV
per ogni picco di ogni frazione.
53
cssa
esp
brev
cta
1
kue
491
2
491.13 491.20
3
461.16
4
354.99 355.04
5
207.03 207.05
6
607.37 607.39
7
637.36 637.38
385
8
637.28
637.2
9
607.25
10
607.20 269.06
315
11 328.97 329.10 329.14 329.2
329
12
961
385.
13
783.42
783
14
813.21
813
15
783.22 783.22
783
16
753.26 753.20
753
54
Pianta
1
2
3
4
5
0.100118
H.
0.100146
6
0.196341
7
0.0254672
0.0198706
0.102905
0.02
0.01
0.05
Abs
Abs
0.01
0.1
0.05
0.05
Abs
Abs
Abs
Abs
0
0
crassa
0
0
-0.0174666
200.469
0
0
250
300
350
400
-0.0214159
200
250
300
350
400
-0.0165704
200
Wavelength [nm]
Wavelength [nm]
-0.01
250
300
350
400
-0.0323171
200
250
H.
300
350
-0.01
-0.0124291
200
400
-0.0150192
200.128
250
Wavelength [nm]
Wavelength [nm]
0.00346568
350
250
400
300
350
400
Wavelength [nm]
0.0297419
0.199469
0.100109
300
Wavelength [nm]
0
0.0200227
0.02
0.01
0.05
espinosan
Abs
Abs
0.1
-0.005
0.01
Abs
Abs
Abs
0
0
-0.01
0
-0.0129263
200
a
-0.01
0
250
300
350
-0.0138656
227.773 250
400
Wavelength [nm]
300
350
400
Wavelength [nm]
-0.0224779
200
250
300
Wavelength [nm]
350
400
-0.0120639
200.125
250
300
Wavelength [nm]
350
400
-0.0153574
200
250
300
350
400
Wavelength [nm]
H.
compacta
H.
brevifolia
0.00524307
H.
0.00160351
0
0
-0.005
Abs
Abs
-0.005
-0.01
kuestery
-0.01
-0.0153128
225.399 250
300
Wavelength [nm]
350
400
-0.0137085
200
250
300
350
400
Wavelength [nm]
55
Pianta
8
9
10
H.
11
12
0.00980777
0
Abs
-0.01
crassa
-0.0154458
200.139
250
300
350
400
Wavelength [nm]
0.009893
H.
0.00996086
0.149941
0.1
0
0
Abs
Abs
Abs
-0.01
espinosana
-0.0151428
200
0
-0.01
250
300
350
-0.0151079
200
400
250
Wavelength [nm]
300
350
-0.0506486
200
400
250
Wavelength [nm]
300
350
400
350
400
Wavelength [nm]
0.0974359
H.
0.05
Abs
0
Compacta
-0.0401709
200
250
300
Wavelength [nm]
0.00079139
0.000460074
H.
0.00978245
0.0988166
-0.005
0
0.05
-0.01
Abs
Abs
Abs
Abs
-0.01
-0.01
0
brevifolia
-0.0204032
200
250
300
350
-0.015
-0.0158876
200
400
250
Wavelength [nm]
350
-0.0182336
200.229
400
250
300
350
400
Wavelength [nm]
Wavelength [nm]
0.00725765
1.92168E-005
H.
300
-0.0143083
200
250
300
350
400
Wavelength [nm]
0.0974359
0.005
-0.005
0.05
0
Abs
Abs
Abs
-0.005
-0.01
0
-0.01
kuestery
-0.0154121
225.323 250
300
350
Wavelength [nm]
400
-0.0125696
216.097
250
300
Wavelength [nm]
350
400
-0.0401709
200
250
300
350
400
Wavelength [nm]
56
Pianta
13
14
15
16
H.
crassa
H.
espinosana
0.0195347
-0.0049764
H.
0.01
Abs
-0.01
Abs
0
compacta
-0.0153872
231.514 250
300
350
-0.0104942
237.743
399.3
300
350
388.582
Wavelength [nm]
Wavelength [nm]
H.
0.0398501
0.00980834
0.00422074
0.02
0
Abs
0
Abs
Abs
brevifolia
0
-0.01
-0.0117888
200.128
250
300
350
400
-0.01
Wavelength [nm]
-0.0164041
200
250
300
350
-0.0126269
200
400
250
0
400
350
400
0.04
0.05
0
Abs
350
0.0500139
0.0986412
0.00992097
0.00201304
H.
300
Wavelength [nm]
Wavelength [nm]
-0.005
Abs
Abs
Abs
0.02
0
kuestery
0
-0.01
-0.0113599
230.292 250
300
350
Wavelength [nm]
399.743
-0.01
-0.011673
200.721
250
300
Wavelength [nm]
350
400
-0.0136533
200.229
250
300
Wavelength [nm]
350
400
-0.0112176
200.698
250
300
Wavelength [nm]
57
Dai profili si può osservare che la maggior parte di composti presentano il
profilo di assorbimento UV tipico dei flavoni, tranne per alcuni composti nei
quali la bassa quantità e la presenza di eventuale impurezza ha alterato il
normale assorbimento.
Curva di assorbimento UV tipico dei flavoni
La seguente tabella mostra i massimi delle curve di assorbimento UV.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
H css
max
H esp
max
250-260-355
250-260-355
300
225-310
250-280-330
250-280-330
250-260-355
250-280-330
310
250-280-330
250-280-330
H cta
max
H bre
max
H kue
max
250-280-350
250-280-330
250-280-330 250-340
250-260-355
250-260-355
250-280-330 250-340
250-280-330 250-280-330 250-280-330 250-280-330 250-280-330
250-280-330 280-330
230-270-330
250-280-330 250-280-330
280-330
320
320
320 250-280-330 250-325
58
La complessità delle frazioni ha reso difficile un’identificazione univoca dei
picchi cromatografici e potrebbe essere causata da due fattori:
1. La differente quantità di ogni componente ha influenzato i tempi di
ritenzione, i profili di assorbimento UV e gli spettri di massa.
2. L’elevata quantità di tricina in ogni campione ha reso difficile le analisi
degli altri composti minoritari: non è stato possibile, pertanto, iniettare
quantità adeguate per la loro identificazione senza mandare la colonna in
saturazione.
Tuttavia è stata ideata una strategia per ridurre la variabilità tra le frazioni
riducendo il numero di composti idonei per l’identificazione. È stato preparato
un campione formato da un’aliquota di tutte le frazioni flavonoidiche delle
specie ed è stata analizzata con lo stesso metodo in UPLC–UV-MS.
9
MIX - CH7
10000
Intensity [µV]
2
1
0
12
4
-10000
5
13
6
10
7
3
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
8
14.0
16.0
Retention Time [min]
18.0
20.0
11
22.0
24.0
Cromatogramma della miscella delle frazione flavonoidiche
In questo modo sono stati identificati 13 picchi principali che si possono
osservare nel cromatogramma sopra riportato.
Dai tempi di ritenzione, i profili di assorbimento UV e gli spettri di massa a ioni
negativi, è stato possibile elaborare una matrice con i componenti maggioritari.
59
Una ricerca bibliografica nella letteratura scientifica (che comprende sia gli
spettri UV38 che i pesi molecolari ricavati dalla massa dello ione [M-H-]) dei
flavonoidi presenti nelle piante del genere Huperzia39, incrociata con i dati
provenienti dalle nostre analisi, ci ha permesso di identificare, con ragionevole
certezza, la maggior parte dei composti. Due picchi identificati solo nei
cromatogrammi di Huperzia compacta e Huperzia espinosana non si sono
trovati nella miscela, però sono stati aggiunti, nella tabella in seguito riportata,
con i numeri 3 e 9. Inoltre, il picco 1 di Huperzia kuestery, inizialmente
classificato come entità separata, corrisponde in realtà al picco 2 dell’ Huperzia
crassa e Huperzia espinosana. Pertanto, nella tabella seguente, i composti sono
stati rinumerati da 1 a 15, così che la tricina corrisponde ora al picco 10 e non
più 11 della tabella precedente; a scalare anche la numerazione di tutti gli altri
composti.
1
491.20
Tricina-C-glucoside
2
461.18
Crisoeriolo-C-glucoside
3
401.03
Apigenin-C-arabinoside
4
207.05
Calcone
5
607.38
Crisoeriolo-C-glu-C-rha
6
637.37
Tricin-C-glu-C-rham
7
637.23
Metil crisoeriolo-C-di-glu
8
607.25
Selgina-C-rham-C-rha
9
315.11
Selgina
10
329.11
Tricina
11
783.70
Tricina-C-glu-C-rha-C-rha
12
384.99
Crisina-C-arabinoside
13
813.30
Trimetiltricetina-C-glu-C-glu—C-rha
14
783.22
Selgina-C-glu-C-glu-C-rha
15
753.26
Crisoeriolo-C-glu-C-rha-C-rha
38
The Systematic Identification of Flavonoids, Mabry T., Markham K., Thomas M., Springer-Verlag, 1970.
Apport de la Biochimie Flavonique & la Systematique du Genre Lycopodium, Voirin et al., Biochemical
Systematics and Ecology, 1978, 6, 95-97
39
60
Dall’ esame dei dati spettroscopici si evinceva la presenza di flavonoidi
glicosilati. Per questo motivo si è provata una reazione di idrolisi acida che
permettesse di
scindere gli
agliconi dagli zuccheri,
per indagarne
successivamente la loro natura chimica.
Si è quindi preparata una miscela delle frazioni contenenti i flavonoidi di ogni
pianta. Questa miscela di 10 mg è stata sottoposta ad idrolisi in 20 mL di una
soluzione contenenti 10 mL di HCl (2N) e 10 mL di H2O:MeOH (1:1) a 80 °C per 2
h. Al termine è stata verificata l’andamento della reazione in TLC e si è notata
l’assenza di macchie corrispondenti ai possibili zuccheri presenti. La reazione è
stata quindi ripetuta per 12h utilizzando HCl a concentrazione più elevata,
senza tuttavia ottenere alcuna significativa formazione di zuccheri liberi.
Da questo risultato si è concluso che i flavonoidi glicosilati hanno un legame Cglicosidico; infatti, gli O-glicosidi avrebbero dovuto dare, in queste condizioni,
una veloce reazione d’idrolisi.
61
Struttura degli agliconi trovati
Nome
Molecola
Nome
Calcone
Methyl chrysoeriol
Crisina
Selgina
Apigenina
Tricina
Crisoeriolo
Trimetil tricetina
Molecola
62
In conclusione, dai profili cromatografici, dai dati degli spettri di massa e dagli
spettri di assorbimento UV possiamo riassumere la distribuzione dei flavonoidi
nella seguente tabella.
CSS ESP
1
X
2
X
3
CTA
BRE
KUE
X
X
X
X
X
4
X
X
5
X
X
6
X
X
7
8
X
9
X
10
X
X
X
11
12
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
13
14
X
X
X
15
X
X
X
Dal confronto della distribuzione dei flavonoidi si può dedurre che ogni
Huperzia
mostra
un
pattern
caratteristico,
anche
se
c’è,
almeno
qualitativamente, una certa somiglianza fra H.crassa e H. espinosana, e fra H.
brevifolia e H. kuestery; la H. compacta è più vicina alle ultime che alle prime
due specie. Gli agliconi sono tutti dei favoni e la tricina è comune a tutte le
specie; anche il crisoeriolo, sotto forma di diversi C-glicosidi, è presente in tutte
le specie.
63
Quantificazione di Tricina nelle frazioni contenenti flavonoidi
Data l’uniforme presenza di tricina in tutte le frazioni flavonoidiche di Huperzia,
così da costituire un possibile caratteristico marker chemotassonomico, almeno
per le specie ecuadoriane, abbiamo ritenuto interessante quantificare questo
flavone nelle diverse frazioni. Per questo scopo abbiamo ricavato innanzitutto
una retta di taratura usando soluzioni a diversa concentrazione di tricina pura,
ottenuta per separazione e cristallizzazione da processi estrattivi di H.
compacta.
Elaborazione della retta di taratura Standard di Tricina
Da una soluzione madre di tricina di 300mg/mL sono state preparate 5
soluzioni standard a 10 ppm, 50 ppm, 100ppm, 500ppm e 1000ppm.
Precisione
Ogni soluzione è stata analizzata tre volte in cromatografia liquida in modo da
ottenere dati per analizzare la precisione del metodo e ripetibilità (inter-assay
precision) .
tR
Tricina10ppm1
Tricina10ppm2
Tricina10ppm3
Tricina50ppm1
Tricina50ppm2
Tricina50ppm3
Tricina100ppm1
Tricina100ppm2
Tricina100ppm3
Tricina500ppm1
Tricina500ppm2
Tricina500ppm3
Tricina1000ppm1
Tricina1000ppm2
Tricina1000ppm3
15,7
15,857
15,75
15,853
15,877
15,817
15,72
15,68
15,807
15,63
15,647
15,72
15,673
15,603
15,487
media
dev.standard
coef. Variazione
media
dev.standard
coef. Variazione
media
dev.standard
coef. Variazione
media
dev.standard
coef. Variazione
media
dev.standard
coef. Variazione
15,769
0,080023
0,51
15,85
0,030246
0,19
15,736
0,06475
0,41
15,666
0,047881
0,31
15,588
0,094301
0,00605
64
Precissione nei tR
Grafico della linea di tendenza e regressione lineare
Area
Tricina10ppm2
28159
media
27935
Tricina10ppm3
22097
dev.standard
5729,299
Tricina10ppm3
33549
coef. Variazione
20,51
Tricina50ppm1
133458
media
140524
Tricina50ppm2
144263
dev.standard
6123,034
Tricina50ppm3
143851
coef. Variazione
4,36
Tricina100ppm1
314361
media
320881
Tricina100ppm2
302547
dev.standard
22319,27
Tricina100ppm3
345734
coef. Variazione
6,96
Tricina500ppm1
1628136
media
1665846
Tricina500ppm2
1697943
dev.standard
35240,27
Tricina500ppm3
1671458
coef. Variazione
2,12
Tricina1000ppm1
3361965
media
3372218
Tricina1000ppm2
3378774
dev.standard
8993,697
Tricina1000ppm3
3375914
coef. Variazione
0,002667
65
Accuratezza e precisione nel calcolo delle concentrazioni
66
Linearità, sensibilità, limiti di rivelabilità e di quantificazione
Statistica della regressione
R multiplo
0,999900624
R al quadrato
0,999801258
R
quadrato
0,999785971
standard
19346,86194
al
Coefficienti
Intercetta
-18841,7737
Pendenza
3386,513101
corretto
Errore
(RSD)
Osservazioni
15
Il coefficiente di correlazione R2=0,9998 indica la linearità della procedura
analitica nell’intervallo di concentrazioni analizzati.
La sensibilità del metodo corrisponde alla pendenza della retta, s=3386.513
Per il calcolo dei limiti di rilevabilità e di quantificazione è stato eseguito
l’approccio raccomandato dall’ICH
basato sull’errore standard della
regressione lineare. Per cui il:
Da cui si ottengono:
DL=18,853ppm
QL=57,129ppm
67
Calcolo della quantità di Tricina presente negli estratti flavonoidi
Viene effettuata l’interpolazione delle aree ottenute nelle precedenti analisi
UPLC delle frazione contenenti flavonoidi alla retta di taratura effettuata.
(Nota: il segnale ricavato da
Huperzia crassa non è entro i limiti di
quantificazione ricavato dalla curva di calibrazione, ma la sua ipotetica
concentrazione viene comunque calcolata.)
68
Interpolazione dati
Campione
Area
Concentrazione(ppm)
HK
1338341
402,83±10,48
HB
1118111
337,32±10,48
HE
809089
245,40±10,48
HCS
26315
Non quantificabile (12,55812)
HCT
1082491
326,73±10,48
69
Rese delle frazioni ottenute nei diversi processi e calcolo della quantità di
Tricina presente nel materiale di partenza
Pianta
Estrazione acida
Pianta
secca (g)
42
pianta secca
FNA (g)
FAF41 % in
(mg) FNA
38,68
4,69
12,12
1
169
16,9
HB
21,95
5,87
27,71
1
395
39,5
HE
48,12
4,65
9,66
1
280
28
HCS
200
15,6
7,8
1
170
17
HCT
200
18,08
9,04
1
692
69,2
TLC
FAF
41
% in
HK
Pianta
40
FNA40 (g)
SPE
F42
Quantità totale
UPLC
in pianta secca
% in
F
µg
% in
(mg) (mg) FAF
µg
tricina
F
mg/g % totale
HK
20
6
30
2500 402,833 16,11 0,990
0,099
HB
20
9
45
2000 337,323 16,87 8,307
0,830
HE
20
10
50
2390 245,402 10,27 1,388
0,138
HCS
20
13
65
1910
HCT
20
11
55
1880 326,728 17,38 5,979
12,558
0,657
NQ
NQ
0,597
FNA: frazione non alcaloidea
FAF: frazione arricchita di flavonoidi
F: Flavonoidi
70
Quantità di tricina presente nelle piante
Isolamento e caratterizzazione di metaboliti di Huperzia espinosana.
Per avere delle informazioni ulteriori sulle strutture dei diversi flavonoidi si è
deciso di procedere alla separazione cromatografia della frazione flavonoidica
dell’ H. espinosana. 2.34 g della frazione non alcaloidea di questa pianta sono
stati frazionati con la tecnica SPE, seguendo la stessa procedura
precedentemente descritta per la preparazione delle frazioni analizzate in UPLC
(v. sopra). Si sono ottenuti 1,09 g della frazione arricchita in flavonoidi.
Quest’ultima è stata sottoposta ad una separazione cromatografia preparativa
sotto media pressione, utilizzando un cromatografo Isolera. È stata utilizzata
una colonna cromatografica con 120 g di silice di fase inversa RP-18 (25-40 µm)
ed una fase mobile iniziale contenente MeOH-H2O, 6:4, al 1% di acido
trifluroacetico, incrementando quindi il MeOH secondo un gradiente fino al
100%. Il cromatogramma registrato a 350 nm è mostrato nella figura seguente.
71
Dalla separazione sono state ottenute 26 frazioni e tra queste la frazione 11
(6,56mg) è stata considerata pura abbastanza da poter essere sottoposta ad
un’analisi 1H-NMR e ad un’analisi in spettrometria di massa a ioni negativi.
TLC delle frazioni ottenute dalla separazione cromatografica della frazione flavonoidica
di H. espinosana tramite Isolera
72
Spettro 1H NMR della frazione 11
73
Spettro di massa a ioni negativi della frazione 11
74
Da queste analisi abbiamo identificato la frazione 11 come il flavone selgina.43
I segnali dell’analisi 1H NMR sono stati confrontati con quelli della tricina44, dal
quale differisce solo per l’intensità del segnale dei gruppi metossilici (-OCH3
3.94ppm)
Uno standard di selgina è stato iniettato in UPLC ed eluito con lo stesso metodo
utilizzato per le analisi degli estratti flavonoidici; in questa maniera siamo
riusciti ad identificare nei cromatogrammi il picco corrispondente alla selgina.
Selgina : picco in magenta, corrisponde al #6 in Huperzia espinosana
43
Structure-function relationships of wheat flavone O-methyltransferase: Homology modeling and sitedirected mutagenesis, Zhou JM et al., BMC Plant Biol. 2010, 29,10:156
44
Alfalfa (Medicago sativa L.) Flavonoids. 2. Tricin and Chrysoeriol Glycosides from Aerial Parts, Stochmal
et al. , J. Agric. Food Chem., 2001, 49 (11), pp 5310–5314
75
Le frazioni 23 e 24 sono state riunite (45mg) e si è cercato di frazionarle
ulteriormente. Per questo motivo è stata effettuata una seconda separazione
cromatografica su fase inversa con l’eluente MeOH:H2O in proporzione 4:1. Le
14 frazioni così ottenute sono però risultate essere ancora miscele di composti.
Tramite analisi TLC sono state selezionate quelle che sembravano essere più
pure (F5 e F7) che sono state successivamente analizzate in UPLC per trovare la
corrispondenza con i composti presenti negli estratti totali.
Frazione 5 - CH7
0
Intensity [µV]
7
-5000
6
2
-10000
1
5
3
4
8
0.0
5.0
9
10.0
10
15.0
20.0
25.0
Retention Time [min]
30.0
35.0
40.0
Cromatogramma Frazione 5
76
Frazione 7 - CH7
7
5000
0
Intensity [µV]
1
-5000
2
3
4
8
56
-10000
0.0
5.0
11
9
10
10.0
12
15.0
20.0
25.0
Retention Time [min]
30.0
35.0
40.0
Cromatogramma frazione 7
In magenta la frazione 7, si nota la presenza di tricina picco 11
77
Dai cromatogrammi UPLC si è potuto osservare che le frazioni erano ancora
delle complesse miscele, ciò che ha reso impossibile stabilire una
corrispondenza univoca con i composti della miscela totale di flavonoidi.
Il nostro lavoro di isolamento e caratterizzazione dei flavonoidi di Huperzia
espinosana si è fermato a questo punto.
Per maggiore chiarezza il lavoro di separazione è stato riassunto nello schema
seguente.
78
Discussione dei risultati e conclusioni.
Dalle analisi effettuate è stato possibile individuare la presenza di almeno 15
composti presenti nelle frazioni flavonoidiche. Questi composti, distribuiti
diversamente tra le specie di Huperzia, sono correlati strutturalmente in
quanto sono tutti derivati o precursori della tricina, che è il componente
maggioritario in tutte le piante ad eccezione della Huperzia crassa.
Alcuni composti sono stati trovati nella forma glicosilata e dalla nostra indagine
possiamo concludere che sono tutti C-glicosidi.
1
491.20
Tricina-C-glucoside
2
461.18
Crisoeriolo-C-glucoside
3
401.03
Apigenin-C-arabinoside
4
207.05
Calcone
5
607.38
Crisoeriolo-C-glu-C-rha
6
637.37
Tricin-C-glu-C-rham
7
637.23
Metil crisoeriolo-C-di-glu
8
607.25
Selgina-C-rham-C-rha
9
315.11
Selgina
10 329.11
Tricina
11 783.70
Tricina-C-glu-C-rha-C-rha
12 384.99
Crisina-C-arabinoside
13 813.30 Trimetiltricetina-C-glu-C-glu—C-rha
14 783.22
Selgina-C-glu-C-glu-C-rha
15 753.26
Crisoeriolo-C-glu-C-rha-C-rha
79
Struttura degli agliconi flavonoidici identificati
Nome
Molecola
Nome
Calcone
Methyl chrysoeriol
Crisina
Selgina
Apigenina
Tricina
Crisoeriolo
Trimetil tricetina
Molecola
La quantità abbondante di tricina nelle frazioni isolate ci ha portato ad
analizzare la sua quantità percentuale negli estratti delle diverse Huperzie (v.
tabella sottostante). Le quantità trovate in Huperzia brevifolia e in H- compacta
superano di gran lunga le quantità finora documentate in letteratura per altri
vegetali (v. tabella sottostante). È noto che la tricina mostra proprietà molto
interessanti dal punto di vista terapeutico e nutrizionale; per questa ragione la
comunità scientifica sta tentando di incrementarne la resa ottenibile da fonti
80
naturali al fine di poter effettuare ulteriori esperimenti e per renderla
disponibile commercialmente.
Specie
Quantità Tricina
Specie
Quantità
totale
Huperzia:
mg/g
Triticum spp
0,224 mg/g
Kuestery
0,990138
Triticum aestivum
0,77 mg/g
Brevifolia
8,307357
Spartina cinosuroides
5 µg/g
Espinosana
1,388626
canna da zucchero
0,13 µg /g
Crassa
0,056669
germoglio di bambù
0,618 mg/g
Compacta
5,.979514
Desmostachia bipinnata
0,1 mg/g
Oryza sativa
1,93 mg/g
L’elevata produzione di flavonoidi nelle specie di Huperzia ecuadoregne può
essere spiegata dal fatto che queste piante sono state selezionate dai fattori
ambientali: è noto che i flavonoidi proteggono le piante dalle radiazioni UV e le
Huperzie ecuadoregne, a causa della loro ubicazione geografica, sono
sottoposte ad un’elevata quantità di radiazioni UV; per questo motivo, solo le
piante che sono riuscite a produrre quantità elevate di questi composti
fotoprotettivi sono riuscite a crescere ed a riprodursi.
Purtroppo non è possibile pensare ad una coltivazione o ad uno sfruttamento
intensivo di queste piante in quanto sono considerate specie minacciate dalla
continua perdita del proprio habitat; inoltre il loro ciclo vitale è troppo lungo:
esse impiegano fino ad un decennio per raggiungere la loro maturità.
Tuttavia un approccio biotecnologico potrebbe andare a modificare il
“macchinario” enzimatico delle Huperzie per la produzione di tricina, già molto
attivo, analogamente a quello che già avviene per il riso o l’orzo.
81
Riassunto
Questo lavoro di tesi comprende lo studio fitochimico delle frazione flavonoidiche di 5 specie
vegetali del genere Huperzia.
Il genere Huperzia appartiene alla divisione Lycopodiophyta, sono piante vascolari inferiori ,
le più antiche ancora in vita e le prime ad avere cellule specializzate nel trasporto di acqua e
nutrienti (tracheidi). Specie di questo genere vengono utilizzate come medicinali in distinte
parti del mondo. In Ecuador vengono utilizzate dalla comunità indigena dei Saraguro nella
provincia di Loja.
Studi precedenti sui metaboliti delle Huperzie, hanno isolato diversi tipi di alcaloidi,
flavonoidi e acidi fenolici. Tra questi, l’uperzina A, alcaloide attivo nella inibizione
dell’acetilcolinestarasi.
In questo lavoro sono stati identificati 15 composti appartenenti alla classe dei flavoni, alcuni
di questi si sono trovati nella forma glicosilata. La strategia di identificazione è stata quella di
“dereplication” che è consistita in un metodo cromatografico accoppiato a tecniche
spettroscopiche di PAD e massa. Dei composti identificati, il più abbondante è il flavone
Tricina, del quale in letteratura sono documentate importante attività, tra le più importante
ci sono l’attività anti-infiammatoria, antiossidante, antitumorale, e chemo-preventiva; per le
quale è suscitato enorme interesse per ulteriori studi e il suo impiego terapeutico.
È stata quantificata anche la quantità di Tricina presente nelle diverse frazioni, tramite
l’elaborazione di una retta di taratura. Da questa indagine, in Huperzia brevifolia è stata
riscontrata la maggior quantità di Tricina, circa 8 g per kg, che è la resa maggiore finora
documentata nell’isolamento di questa molecola. Ipotizziamo che queste quantità
riscontrate sono dovute al fatto che queste piante sono state selezionate dai fattori
ambientali: è noto che i flavonoidi proteggono la pianta dalle radiazioni UV e le Huperzie
ecuadoregne, a causa della loro ubicazione geografica, sono sottoposte ad un’elevata
quantità di radiazioni UV; per questo motivo, solo le piante che sono riuscite a produrre
quantità elevate di questi composti protettivi sono riuscite a crescere ed a riprodursi.
82
Abstract
This is an phytochemical study of 5 species of Huperzia genus that grow in Ecuador paramo.
It was analyzed the composition of flavonoid fractions.
Huperzia are lower vascular plants, they are ancient species that aroused on late Devonian
and are the first who produced tracheids. Some Huperzia spp are used in traditional
medicine. In Ecuador, Saraguro indigenous community used Huperzia in preparations for
rituals and illness treatment. Previous phytochemical studies had isolated alkaloids,
flavonoids and phenolic acids.
In this study flavonoid fractions were analyzed by LC-UV-MS. We identified 15 compounds,
some of them were C-glycosylated. Structures of these natural products were deduced by
the registered UV absorption profile, mass spectra and literature data. The analyses
conducted represent an overview of flavonoids and their conjugates in different Huperzia
species. Tricin, the most abundant compound contained in analyzed fractions, was
quantified. Quantification required a calibration curve elaboration. We found that Huperzia
brevifolia produces the highest quantity of tricin documented until now, 8 mg in 1 g of dried
plant. Recent studies seem to indicate that tricin commands several biological properties
that are superior to other flavonoids and polyphenols in terms of nutraceutical and
pharmaceutical values.
Unlike most flavonoid compounds, tricin is not readily available commercially and until now
its isolation from native plants is often limited by its low abundance and unstable resources.
The only alternative to making it available in suitable quantities for experimentation and
pharmacological testing is through chemical synthetic methods. Our findings are important
since it provides a new important source to get available tricin in higher quantities.
83
Ringraziamenti
Desidero innanzitutto ringraziare il Professore Giovanni Vidari,
per
la sua
disponibilità, per i consigli e per l’importante aiuto fornito nella elaborazione di
questa tesi. Inoltre, ringrazio il Dottore Davide Gozzini, per essere stato sempre
disponibile a provvedere aiuto e consigli . Ringrazio anche a Matteo Valli,
Chabaco Armijos, Gianluca Gilarodoni, Vladimir Morocho e Jorge Ramirez che
mi hanno aiutato, guidato e consigliato durante i miei lavori sperimentali .
Ringrazio il SENESCYT per la concessione della borsa di studio che mi ha
permesso di finire il mio percorso universitario.
Ringrazio i miei genitori Marlon e Consuelo e mia sorella Diana, per il sostegno
dato in questi anni. Voglio ringraziare anche a tutti quelli che mi hanno
sostenuto e aiutato in diversi modi in questi anni di università; ai miei compagni
di classe, ai professori, a miei amici, a tutte le persone che conformano il
Laboratorio B2. Voglio ringraziare al mio zio Pedro e alla sua famiglia. Un
particolare ringraziamento a tutti i componenti
della famiglia Marinoni
Donoso. Ringrazio in modo speciale i miei amici Carlos, Danner, Eduardo, David,
Amelia, Yamile, Luis, Max, Francesca, Valentina, Floriana, Cascio, Laurent,
Adriana, Roberta, Pol, Pamela, Paola e tutte le altre persone con cui ho avuto
opportunità di compartire momenti e dalle quali ho imparato tanto.
Ringrazio soprattutto alla mia famiglia; zii, cugini, nonni e amici in Ecuador,
che hanno fatto arrivare le loro parole di sostegno anche a mille km di distanza.
84