Trasporto degli elettroni e
fosforilazione ossidativa
1
LA RESPIRAZIONE CELLULARE
Le cellule respirano?
La respirazione cellulare è il meccanismo attraverso cui
la cellula, in presenza di ossigeno, è in grado di ricavare
energia utilizzabile nei processi vitali dai legami chimici
delle molecole assorbite nella digestione.
La respirazione cellulare consta di diverse reazioni, in cui
i prodotti di un passaggio sono utilizzati come reagenti
per il processo successivo.
I prodotti di scarto della respirazione cellulare (come
CO2 o H2O) vengono eliminati dalla cellula e, negli
organismi superiori, escreti attraverso la respirazione
polmonare e le urine.
2
Gli organismi aerobici durante il processo di ossidazione dei carburanti
metabolici consumano ossigeno e producono biossido di carbonio:
C6H12O6 + 6O2
6CO2 + 6 H2O
Glucosio
3
Le 12 coppie di e- rilasciate
durante l’ossidazione del glucosio
non sono trasferite direttamente
all’O2 ma ai coenzimi NAD+ e FAD
tramite i coenzimi, gli e- passano
alla catena di trasporto degli e-
4
Durante il processo di trasporto degli elettroni accadono i eguenti eventi:
1) NADH e FADH2 sono riossidati a NAD+ e FAD
2) il trasferimento degli e- partecipa all’ossidazione-riduzione di 10 centri
redox
3) durante il trasferimento degli e-, dal mitocondrio vengono espulsi dei
protoni con la generazione di un gradiente protonico attraverso la
membrana mitocondriale.
5
6
Struttura di un
mitocondrio
50% lipidi, 50% proteine
80% proteine
7
LA RESPIRAZIONE CELLULARE
Modello di mitocondrio e schema
generale della respirazione
cellulare
La respirazione aerobica ha luogo nella
matrice e nella membrana mitocondriale
interna e questo processo è incrementato
dalla grande superficie offerta dalle creste.
La matrice contiene la maggior parte degli
enzimi coinvolti nell’ossidazione degli acidi
grassi e gli enzimi degli acidi tricarbossilici
(ciclo di Krebs); sono inoltre presenti DNA
mitocondriale ed RNA.
La membrana mitocondriale interna
contiene i citocromi, le molecole di trasporto
della catena di trasporto degli elettroni e gli
enzimi coinvolti nella produzione di ATP.
I mitocondri sono considerati organuli
semiautonomi, perché riescono a
sintetizzare molte delle proteine di cui
necessitano; inoltre, vanno incontro ad
un’autoreplicazione mediante un processo
che è analogo alla divisione dei batteri.
8
9
10
La porina ha una struttura a foflietto β antiparallelo
che si arrotola a formare un barile.
Sono proteine che formano canali nella membrana dei
batteri gram-negativi
Le porine sono presenti anche negli eucarioti, nella
membrana esterna dei mitocondri e dei cloroplasti.
11
12
13
NAD+, NADH, NADP+, NADPH, FAD, FADH2
La membrana mitocondriale interna è priva di una proteina trasportatrice
del NADH
Nel mitocondrio vengono trasportati soltanto gli elettroni del NADH
citosolico mediante ingegnosi sistemi “ navetta”
14
Sistemi navetta di substrati:
si servono di isoforme citoplasmatiche e mitocondriali
dello stesso enzima
15
Shuttle malato – aspartato (fegato, muscolo cardiaco)
(e-)
GOT cit.
reaz. di transamminazione
4
1
malato deidrogenasi (citosolica)
(reaz. di riduzione)
mmi
3
2
reaz. di transamminazione
GOT mit.
malato deidrogenasi (ciclo di Krebs)
(reaz. di ossidazione)
16
Il sistema navetta del
Glicerofosfato del muscolo
alare degli insetti
trasferimento di una
coppia di e-
glicerolo 3-P deidrogenasi
isozima
FAD dip.
17
Meccanismo conformazionale del traslocatore ADP-ATP o adenina nucleotide traslocasi
che trasporta l’ATP fuori dalla matrice scambiandolo con l’ADP (dimero costituito da
due subunità identiche di 30 kD)
Il Pi che è necessario anche per la sintesi di ATP nella matrice, viene importato dal
citosol mediante un sistema di simporto Pi-H+ .
Il gradiente protonico transmembrana generato dalla catena di trasporto degli elettroni
presente sulla membrana mitocondriale interna non fornisce soltanto la forza
termodinamica necessaria per la sintesi di ATP ma promuove anche il trasporto dei suoi
materiali di partenza , ADP e Pi.
18
I due sistemi di trasporto
mitocondriale per il Ca 2+
I MT funzionano da tamponi per il calcio
citosolico.
Importanza della distribuzione
intracellulare del calcio:
contrazione muscolare
trasmissione neuronale
secrezione, azione degli ormoni
antiporto
con ioni Na+
L’entrata nella matrice
è promossa dal potenziale di membrana
negativo che attrae gli ioni positivi.
La velocità dipende dalla [Ca++] esterna
Se la [Ca++]cit
Se la [Ca++] cit
= aumenta l’entrata
= diminuisce
l’entrata
19
Quando la [Ca++] citoplasmatica aumenta per un lavoro
muscolare sostenuto
la [Ca++] aumenta anche nella matrice mitoc., attivando
gli enzimi del ciclo di Krebs che porta a un aumento dei
livelli di NADH, la cui riossidazione tramite il sistema
di trasporto degli elettroni genera l’ATP necessario per
la contrazione.
20
I trasportatori degli elettroni che portano gli elettroni dal
NADH e dal FADH all’O2 sono associati alla membrana
mitocondriale interna.
Alcuni di questi centri redox sono mobili, altri sono invece
componenti di complessi di proteine integrali di membrana.
La sequenza dei trasportatori degli elettroni riflette
grossolanamente i loro potenziali di riduzione relativi,
cosicchè il processo di trsporto degli elettroni è
complessivamente esoergonico.
21
La via più importante per la formazione di ATP, presente sia negli
organismi autotrofi che in quelli eterotrofi, è la fosforilazione ossidativa:
questo processo è fortemente endoergonico (cioè necessita di una grande
quantità di energia, DG > 0)
Il meccanismo più rilevante per la sintesi di ATP da ADP e Pi utilizza
energia derivante da gradienti elettrochimici.
Questa
energia
viene
liberata
grazie
alla
presenza
nella
cellula
(mitocondrio) di catene trasportatrici di elettroni (processo redox
fortemente esoergonico, DG < 0)
22
La catena respiratoria libera energia grazie alla differenza tra
i potenziali di riduzione tra il donatore (NADH + H+), complessi
della catena respiratoria e l’accettore (O2) di elettroni.
Gran parte di questa energia viene impiegata dall’ATP sintasi
per convertire l’ADP in ATP
23
Il flusso di elettroni può produrre un lavoro
biologico:
Nel “circuito che potenzia un motore”, la fonte di e- può essere
una batteria che contiene due specie chimiche che hanno una
diversa affinità per gli e- .
Il flusso elettronico procederà spontaneamente nel circuito
guidato da una forza proporzionale alla differenza tra le due
affinità detta forza elettromotrice (fem).
La fem può generare un lavoro se al circuito viene collegato un
trasduttore energetico.
24
In un analogo “circuito biologico” la fonte di elettroni è un
composto ridotto come per es. il glucosio.
Quando viene ossidato enzimaticamente sono rilasciati eche fluiscono spontaneamente attraverso una serie di
trasportatori intermedi fino a raggiungere una specie
chimica con un’elevata affinità per gli e- come l’ossigeno.
La forza motrice che si genera fornisce energia ad una
varietà di trasduttori molecolari (enzimi e proteine) che
compiono un lavoro biologico.
25
L’ossidazione biologica completa di sostanze organiche nutrienti
flusso di elettroni che procede verso l’ossigeno mediante una
trasportatori di elettroni intermedi che si comportano come un
cestelli:
crea un
serie di
ponte a
reazione redox esoergonica: gli elettroni passano spontaneamente da un
trasportatore a bassa affinità per gli elettroni ad un altro con affinità
maggiore e così via. La reazione complessiva è:
sostanza organica + O2 CO2 + H2O + energia
26
Il sistema mitocondriale di trasporto degli e- non è altro che una sequenza di
reazioni di ossido riduzione
Durante le reazioni redox, gli elettroni
direttamente dai donatori agli accettori:
trasferiti
possono
passare
Fe2+ + Cu2+ Fe3+ + Cu+
In alternativa, gli elettroni possono essere trasferiti da un donatore a un
accettore mediante un trasportatore di elettroni:
XH2 + Y X +Y H2
NADH + H+ + FAD
NAD+ + FADH2
27
Un atomo di idrogeno neutro è in grado di trasferire un singolo
elettrone:
H e- + H+
Lo ione negativo idruro (H-) è invece in grado di trasferire due
elettroni:
H- 2e- + H+
28
Le forme ossidate e ridotte dei composti sono dette coppie
redox.
donatore di e- (agente riducente)
accettore di e- (agente ossidante)
La facilità con la quale gli e- passano dal riducente
all’ossidante è espressa quantitativamente dal valore del
potenziale di ossido-riduzione del sistema.
29
In una coppia redox il riducente con un potenziale di ox-red
molto negativo cede facilmente i suoi e- a coppie con
potenziali redox meno negativi o più positivi
Viceversa un forte ossidante (caratterizzato da un
potenziale redox molto positivo) mostra una grande affinità
per gli e-.
30
Il potenziale di riduzione standard (E0) è una misura
quantitativa dell'affinità di un accettore per gli elettroni in una
semi-reazione.
Per convenzione internazionale, alla semi-reazione
H+ + e- 1/2H2
viene assegnato un potenziale di riduzione standard pari a zero,
quando la concentrazione di ioni H+ è 1 M e H2 è presente alla
pressione parziale di 101,3 kPa.
Questa semi-reazione viene usata come riferimento per la
determinazione dei potenziali delle altre semi-reazioni.
31
Il più forte agente
ossidante cioè ha elevata
affinità per gli elettroni
e-
32
La catena respiratoria comprende 3 complessi proteici inseriti nella
membrana mitocondriale interna (complessi I, III e IV) e molecole di
trasferimento mobili, quali il coenzima Q e il citocromo-c:
• complesso I: NADH deidrogenasi
• complesso III: citocromo-c reduttasi
• complesso IV: citocromo-c ossidasi
II
Il complesso II è la succinato deidrogenasi, è l’unico enzima presente del
ciclo dell’acido citrico presente nella membrana interna mitocondriale. Il
complesso V, l’ATP sintasi, non partecipa al trasferimento di elettroni
33
Tutti i complessi della catena respiratoria sono formati da numerose
subunità polipeptidiche e contengono una serie di coenzimi redox
legati alle proteine:
• Flavine: FMN e FAD nei complessi I e II
• Coenzima Q
• Centri Ferro-Zolfo: complessi I, II e III
• Gruppi eme: II, III e IV
I trasportatori flavinici e il CoQ sono trasportatori misti: trasportano
elettroni e H+
I centri Ferro-Zolfo e i gruppi eme dei citocromi sono trasportatori
puri: trasportano elettroni
34
Nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+)
e nicotinamide adenina dinucleotide fosfato
(NADP+).
R= H nel NAD+
R= PO3–- nel NADP
35
• L’FMN
e il FAD
subiscono delle reazioni di
ossido-riduzione
reversibili.
•L’FMN è saldamente
legato al complesso-I della
catena respiratoria e non si
comporta
come
un
substrato diffusibile.
•Il FAD è tenacemente
legato al complesso II, o
succinato deidrogenasi.
•Le flavine sono dei
derivati della vitavina
riboflavina
36
Flavina adenina dinucleotide (FAD)
Costituita da FMN + AMP
37
•Il CoQ, a differenza dei
nucleotidi flavinici è
diffusibile e può
spostarsi, durante il
trasporto elettronico, tra
molecole donatrici e
accettrici.
•Il coenzima Q è un
benzochinone con una
catena isoprenoide
insatura.
•Un valore numerico
riportato al pedice indica
il numero di unità
isoprenoidi (CoQ6,
CoQ10)
38
Forma ossidata
Flavin mononucleotide (FMN)
I tre stati di
ossidazione
dell’FMN e del
CoQ
CoenzimaQ (CoQ) o ubichinone
(forma ossidata o chinonica)
( forma ossidata o chinonica)
Forma radicalica
FMNH*(forma radicalica o semichinonica) CoenzimaQH*o ubisemichinone
(forma radicalica o semichinonica
Forma ridotta
FMNH 2 (forma ridotta o idrochinonica)
Coenzima QH2 o ubichinolo
(forma ridotta o idrochinonica)
39
Stati di ossidazione di Flavin mononuleotide (FMN) e
Coenzima Q (CoQ) o ubichinone
Il FMN (a) e il coenzimaQ (b) formano radicali liberi
semichinonici stabili.
IL FMN e il CoQ (che possono trasferire uno o due
elettroni per volta) sono quindi il punto di contatto tra
il donatore a due elettroni NADH e i citocromi
accettori ad un solo elettrone
40
• I centri Fe-S, come i nucleotidi flavinici, sono strettamente
legati alle proteine.
•Il ferro è legato allo zolfo elementare e ai gruppi tiolici di
cisteine messe a disposizione dalla proteina.
•Benchè in un centro possano essere presenti vari atomi di
ferro, i centri ferro-zolfo partecipano a reazioni di
trasferimento di un solo elettrone
Esempi di centri ferro-zolfo
41
33
• I citocromi rappresentano l’ultima classe di componenti che
partecipano al trasporto degli elettroni.
•I citocromi sono delle proteine contenenti eme.
•L’eme è la ferro-porfirina che si trova nelle emoglobine e nella
mioglobina. I citocromi del tipo a, b e c sono le principali varianti
di queste proteine presenti nelle cellule.
•Ciascun citocromo è costituito da una catena polipeptidica e da un
gruppo eme specifico.
•Il ferro presente nei citocromi, ma non quello nell’emoglobina,
subisce delle ossido-riduzioni fisiologiche passando dallo stato
ferroso (2+) a quello ferrico (3+) e viceversa
42
Esempi di gruppi eme
I gruppi eme sono composti
tetrapirrolici contenenti
ferro
(Fe-protoporfirina IX)
I singoli citocromi differiscono
l’uno dall’altro per la natura del
nucleo porfirinico
43
Sequenza del trasporto degli elettroni
L’ossidazione del NADH e del FADH2 viene compiuta dalla catena di
trasporto degli elettroni, un insieme di complessi proteici contenenti centri
redox caratterizzati da affinità per gli elettroni progressivamente
crescenti. Gli elettroni viaggiano lungo questa catena partendo da potenziali
di riduzione standard più bassi verso potenziali più alti.
Gli elettroni vengono trasportati dai Complessi I e II al Complesso III
mediante il CoQ, e dal complesso III al Complesso IV attraverso la proteina
periferica di membrana citocromo c
4 H+
Complesso I
Complesso II
Succinato
deidrogenasi-FAD
FeS, cit b560
44
Il complesso
I o NADH-coenzima Q ossidoreduttasi(NADH deidrogenasi)
catalizza l’ossidazione del NADH da parte del CoQ. E’ il più grosso, complesso contenente
43 catene polipeptidiche. Contiene una molecola di FMN e sei o sette centri ferro-zolfo
che partecipano al trasporto degli elettroni.
NAD+ + CoQ (ridotto)
NADH + CoQ (ossidato)
4 H+
(6-7)
Complesso I
Complesso II
Succinato
deidrogenasi-FAD
FeS, cit b560
45
37
Il NADH può trasferire soltanto due elettroni per volta, mentre i citocromi del
Complesso III a cui il CoQ passa i suoi elettroni, sono in grado di accettare solo un
elettrone per ogni passaggio.
Il FMN e CoQ che possono trasferire uno o due elettroni per volta, sono quindi il
punto di contatto tra il donatore a due elettroni NADH e i citocromi accettori a un
solo elettrone.
46
Modello che rappresenta il trasporto dei protoni (batteriodopsina,una proteina
integrale di membrana di Halobacterium halabium)
Nel momento in cui gli elettroni vengono trasportati tra i vari centri redox del
Complesso I, quattro protoni vengono trasferiti fuori dalla matrice nello spazio
inermembrana .
Il complesso I potrebbe esistere in due stadi conformazionali:
ossidato e ridotto.
47
Il complesso II (citocromo c-reduttasi)
catalizza l’ossidazione del FADH2 da parte del CoQ
FADH2 + CoQ (ossidato)
FAD + CoQ (ridotto)
I suoi centri redox comprendono il FAD legato covalentemente alla succinato
deidrogenasi, sul quale passano inizialmente gli elettroni , un centro 4Fe-4S, due
centri 2Fe-2S e un citocromo b560 .
4 H+
Complesso I
Complesso II
Succinato
deidrogenasi-FAD
FeS, cit b560
48
Quando il succinato è convertito in fumarato nel ciclo del TCA, nella succinico
deidrogenasi avviene una concomitante riduzione del FAD legato a FADH2. Questo
FADH2 trasferisce i suoi elettroni immediatamente ai centri Fe-S che li passano
al UQ.
UQ + 2H+ + 2e = UQH2
49
L’energia libera per il trasferimento degli elettroni dal succinato al CoQ è
insufficiente per promuovere la sintesi di ATP .
Il complesso II è però ugualmente importante perché consente ad elettroni con un
potenziale relativamente alto di entrare nelle catene di trasporto degli elettroni
saltando il Complesso I.
Il complesso I e II non operano in serie, anche se entrambi trasferiscono
elettroni da substrati ridotti, NADH o Succinato al CoQ.
Il CoQ che diffonde nel doppio strato lipidico tra i complessi respiratori, serve
come una sorta di punto di raccolta per gli elettroni.
Dalla prima tappa dell’ossidazione degli acidi grassi si generano gli elettroni che
entrano nella catena di trasporto degli elettroni a livello del CoQ.
Il CoQ raccoglie anche gli elettroni provenienti dal FADH2 prodotto dalla navetta del
glicerolfosfato.
50
Il complesso III
catalizza l’ossidazione del CoQ (ridotto) da parte del citocromo c . La UQ-
citocromo c riduttasi (UQ-cit c riduttasi, nome con cui è noto questo complesso)
Tale complesso funziona per consentire a una molecola di CoQH2 , un trasportatore a due
elettroni , di ridurre due molecole di citocromo c, un trasportatore a un elettrone.
Questo complesso contiene due citocromi b,un citocromo c1 e un centro 2Fe-2S (centro
di Rieske) al quale è legata la proteina ferro zolfo detta ISP.
CoQ (ridotto) + citocromo c (ossidato)
citocromo c (ridotto) + CoQ (ossidato)
4 H+
Complesso I
Complesso II
Succinato
deidrogenasi-FAD
FeS, cit b560
51
Il Complesso III è un dimero a forma di pera la cui parte più larga è immersa nella
matrice mitocondriale.
La porzione che attraversa la membrana è costituita da 13 eliche transmembrana
per ogni monomero la maggior parte delle quali sono inclinate rispetto al piano della
membrana.
Otto di queste eliche appartengono alle subunità del citocromo b che lega i gruppi
eme di entrambi i citocromi di tipo b, il citocromo b 562 ( detto anche citocromo H a
causa del suo alto potenziale e che si trova vicino allo spazio intermembrana ) e b 566
( chiamato anche b1 per il basso potenziale e che si trova nella matrice ).
La proteina ferro-zolfo (ISP) che lega il centro di Rieske, è ancorata nella
regione transmembrana mediante due eliche situate alla sua estremità N-terminale e
si estende nello spazio intermembrana.
Il citicromo c1 è ancorato nella regione transmembrana mediante la sua eleica Cterminale relativamente mobile contenente un gruppo eme di tipo c
52
53
Esempi di gruppi eme
I gruppi eme sono composti tetrapirrolici contenenti ferro
I cit a
contengono una catena isoprenoide di
15 carbonii uniti a un gruppo vinilico modificato
ed un gruppo formile al posto di uno dei metili.
I cit b contengono la ferroferro-protoporfirina IX
lo stesso eme che si trova nell’emoglobina e nella
mioglobina .
I cit c contengono l’eme c , derivato dalla
ferroferro-protoporfirina IX ma legata
covalentemente a residui di cisteina della
apoproteina.
54
La membrana mitocondriale interna contiene una grande concentrazione di CoQ e CoQH2
Il ciclo Q inizia quando una molecola di UQH2 diffonde dalla membrana ad un sito catalitico del complesso
III il sito QP.
L’ossidazione di QUH2 ha luogo in due fasi:
1.
Un primo elettrone proveniente dal UQH2 è trasferito alla proteina di Rieske e successivamente al cit
c1. Questa reazione rilascia due H+ nel citosol e produce UQ.-, un anione semichinonico del UQ nel sito
QP.
2.
Un secondo elettrone è successivamente trasferito a l’eme bL convertendo l’ UQ.- a UQ. L’elettrone
sull’eme bL vicino al lato citosolico della membrana è quindi trasferito ad una molecola di UQ su un
secondo legante chinoni QN convertendo questo UQ a
QN .
Si completa la prima metà del ciclo del CoQ
UQ.-. UQ.-
rimane saldamente legato al sito
55
La seconda metà del ciclo è simile alla prima.
1.
Una seconda molecola di UQH2 viene ossidata al sito QP ed en secondo elettrone è trasferito al cit
c1
2.
L‘ altro elettrone passa all’eme bL e successivamente all’eme bH.
3.
L’elettrone su bH è trasferito sul anione semichinonico UQ.-, al sito QN .
4.
Con l’apporto di due H+ provenienti dalla matrice mitocondriale questa reazione produce UQH2, che
viene rilasciato dal sito QN e torna nella membrana completando il ciclo del CoQ
56
L’essenza del ciclo Q è che il CoQH2 subisce una riossidazione che avviene in
due cicli, in cui il semichinone, CoQ.-, è un intermedio stabile.
Questo richiede che vi siano per il coenzima Q due siti di legame indipendenti:
1. QP che si lega a CoQH2 ed è localizzato tra il centro di Rieske [2Fe-2S] e il
gruppo eme bL in prossimità dello spazio intermembrana.
2.
QN che lega sia CoQ.- sia CoQ ed è localizzato vicino al gruppo eme bH in
prossimità della matrice.
57
58
Il citocromo c è un trasportatore mobile di elettroni
Gli elettroni che attraversano il Complesso III sono
trasferiti al citocromo C dal cit c1.
Il citocromo C è il solo citocromo nella catena di
trasporto degli elettroni che sia idrosolubile.
Il citocromo C come l’UQ è un trasportatore mobile
, è associato debolmente alla membrana interna
mitocondriale ( nello spazio intermembrana dalla parte
citosolica della membrana interna) .
In questa posizione è in grado di acquisire elettroni
dall’insieme Fe-S-cit1 del Complesso III e
successivamente migrare lungo la superfice della
membrana allo stato ridotto, per trasferire gli
elettroni alla citocromo c ossidasi , il IV complesso
della catena di trasporto degli elettroni.
59
IL CITOCROMO C E’ UN MEDIATORE DELLA APOPTOSI
morte cellulare programmata
Reagendo a segnali molecolari nel citosol, nella membrana mitocondriale si aprono i
canali di trasporto che rilasciano il citocromo c.
Il citocromo c a sua volta, attiva le caspasi, una famiglia di proteasi contenenti una
cisteina nel loro sito catalitico.
L’attivazione delle caspasi innesca una serie di reazioni proteolitiche che causano
in ultimo la morte della cellula
60
Il complesso IV (citocromo c-ossidasi)
catalizza l’ossidazione del citocromo c ridotto da parte dell’O2, l’accettore
terminale degli elettroni nel processo di trasporto degli elettroni
citocromo c (ossidato)
ossidato) + H2O
citocromo c (ridotto) + ½ O2
4 H+
Complesso I
Complesso II
Succinato
deidrogenasi-FAD
FeS, cit b560
citocromo c
ossidasi
61
Il complesso IV dei mammiferi è un
dimero i cui monomeri hanno un peso
molecolare di 200 KD e sono
costituiti da 13 subunità.
La parte centrale del ComplessoIV
è costituita dalle sue tre subunità
I,II,III, più grandi e più idrfobiche,
che sono codificate dal DNA
mitocondriale, le altre sono
codificate dal DNA nucleare e
devono essere trasportate dentro il
mit.
Struttura del dimero delle citocromo c ossidasi, l’enzima che catalizza le ossidazioni,
con l’acquisto di un elettrone, di quattro molecole consecutive di citocromo c ridotto e
la contemporanea riduzione di una molecola di O2 utilizzando quattro elettroni.
4 citocromoc (Fe2+) + 4H+ + O2
4 citocromo c(Fe3+) + 2H2O
62
Il complesso IV
Contiene quattro centri redox: il citocromo a, il citocromo a3, un atomo di rame chiamato
CuB e un paio di atomi di rame chiamato centro CuA, Sono anche presenti uno ione Mg2+ e
uno ione Zn2+ . Il Fe dell’eme a3 e il CuB formano un unico complesso binucleare
63
RIASSUMENDO
Reazione della citocromo c ossidasi e riduzione di O2 ad H2O. Per ridurre una
molecola di O2 a 2 di H2O a livello del complesso binucleare citocromo a3-CuB è
necessario un totale di 4 elettroni, donati dal citocromo c, e di 4 protoni che si
originano nella matrice mitocondriale.
Oltre ai 4 protoni utilizzati per ridurre l’O2, 4 protoni provenienti dalla matrice
vengono traslocati nello spazio intermembrana (ogni 2 e- che attraversano il
complesso IV, vengono traslocati 2 protoni).
64
65
Inibitori della catena respiratoria
Inibitore
Rotenone
e Amital
sito/tipo di azione
Si lega al complesso I e blocca il
trasferimento di elettroni dai gruppi Fe-S
all’ubichinone (Q)
Carbossina
Si lega al complesso II e blocca il
trasferimento di elettroni dal FADH2
all’ubichinone
Antimicina A
Si lega al complesso III e blocca il
trasferimento dall’ubichinolo ai gruppi
Fe-S
Cianuro
Blocca il flusso elettronico legandosi al
Fe3+ dei citocromi del complesso IV
Monossido di carbonio
Blocca il flusso elettronico legandosi al
Fe3+ dei citocromi del complesso IV
Oligomicina
Blocca il flusso di H+ attraverso l’ATP
sintasi
66
67
Inibitori sito-specifici del trasporto di elettroni
68
Inibitori della respirazione cellulare: il cianuro
Il cianuro è un anione che deriva dalla dissociazione dall'acido cianidrico (HCN)
HCN H+ + CNUna delle proprietà chimiche del cianuro, utile per capire la sua
tossicità è la capacità di combinazione con i metalli: Fe, Ag, Au
ecc.
Una delle molecole indispensabili per questa funzione è il
citocromo-c ossidasi, (o complesso IV) che è l'ultimo complesso
enzimatico coinvolto nella catena di trasporto degli elettroniche e
possiede al centro della sua complessa struttura un atomo di ferro
(Fe). Quando il cianuro entra nella cellula si lega al ferro e
l'enzima cessa la sua funzione. La conseguenza è che la cellula
cessa di respirare e muore.
Citocromo-c ossidasi
Per tale ragione il cianuro è un veleno, per tutti gli esseri viventi,
anche dosi molto piccole.
Zyklon B (o Zyclon B) era il nome commerciale dell'acido
cianidrico, un pesticida utilizzato come agente tossico nelle
camere a gas di alcuni campi di concentramento e sterminio
nazisti.
Cianuro di potassio
69
Modificatori della respirazione cellulare: l’etanolo
I forti bevitori vanno incontro a gravi e spesso letali malattie al fegato.
CH3CH2OH CH3CHO + 2H+
Gli enzimi del fegato ossidano inizialmente l’etanolo ad
acetaldeide eliminando due atomi di idrogeno, come da reazione
schematizzata.
Sebbene gli effetti intossicanti dell’alcol siano dovuti soprattutto
all’acetaldeide, i responsabili dell’insorgenza delle malattie
epatiche sono gli atomi di idrogeno (elettroni e protoni) eliminati
dall’etanolo.
Questi atomi di idrogeno “in più”, trasportati dalle molecole di
NADH, seguono due vie principali nella cellula.
La maggior parte di essi passa direttamente nella catena di
trasporto degli elettroni, così da saturare il processo e rallentare
la normale decomposizione di zuccheri, acidi grassi, amminoacidi,
che invece di essere scissi vengono convertiti in grassi che si
accumulano nel fegato.
Gli altri atomi di idrogeno sono utilizzati nella sintesi degli acidi
grassi a partire dagli zuccheri e dagli amminoacidi.
70
Il trasporto degli elettroni lungo la catena respiratoria
determina un passaggio di protoni
dalla matrice mitocondriale allo spazio intermembrana
Teoria Chemiosmotica di Peter Mitchell
L’energia libera prodotta durante il trasporto degli elettroni viene conservata pompando ioni
H+ dalla matrice mitocondriale nello spazio intermembrana, per creare attraverso la
membrana mitocondriale interna un gradiente elettrochimico di H+.
Il potenziale elettrochimico di questo gradiente viene sfruttato per sintetizzare ATP.
Il trasporto degli elettroni , promuove il trasferimento dei protoni da parte dei Complessi I,
III, e IV dalla matrice una regione contenente una bassa [H+], attraverso la membrana
mitocondriale interna, allo spazio intermembrana ( che è in contatto con il citosol),
caratterizzato da un’alta [H+].
71
72
Nel modello proposto da Mitchell, il pH della matrice
si innalza, e la matrice stessa acquista un potenziale
elettrico negativo rispetto al citosol come
conseguenza dell’uscita dei protoni,
Il pompaggio dei protoni cioè produce un gradiente di
pH ed una differenza di potenziale elettrico
attraverso la membrana mitocondriale interna,
condizioni che contribuiscono entrambe ad attrarre i
protoni di nuovo nella matrice del citoplasma.
Il flusso di protoni lungo questo gradiente
elettrochimico è un processo favorito
energeticamente, e può quindi promuovere la sintesi di
ATP.
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Fosforilazione ossidativa
l’energia libera prodotta durante il
trasporto degli e- deve essere
conservata in una forma utilizzabile
dall’ATP sintasi.
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Il trasporto degli elettroni , promuove il trasferimento dei protoni da parte del
complesso I, III, e IV dalla matrice una regione contenente una bassa concent. di H+,
attraverso la membrana mitocondriale interna, caratterizzata da un’alta concent. di H+
L’energia libera sequestrata dal risultante gradiente elettrochimico (forza motrice
protonica ) alimenta la sintesi di ATP.
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Il motore della respirazione cellulare: ATP-sintasi
La ATP-sintasi trasportante H+ tra due settori è un complesso
enzimatico che catalizza la seguente reazione:
ADP + fosfato + H+esterno ATP + H2O + H+interno
Quando la reazione è catalizzata verso destra, l'enzima è comunemente
chiamato ATP-sintasi ed è responsabile della sintesi di
adenosintrifosfato (ATP) utilizzando come substrati adenosindifosfato
(ADP) e fosfato inorganico, sfruttando il gradiente protonico generato
dalla catena di trasporto degli elettroni.
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L’ATP sintasi (F1Fo-ATPasi), è una
proteina transmembrana costituita da più
subunità con un peso complessivo di 450
KD.
Fo ( lega l’antibiotico oligomicina B) è
costituita nei mammiferi da 6 copie di una
proteina che attraversa la membrana che
formano un canale polare per il passaggio
di H+.
F1 è costituita da subunità α3β3γδε. Le
subunità α e β sono disposte in modo
alternato.
Lo stelo è costituito dalla subunità γ
associato alle subunità δ ed ε
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Il meccanismo per la sintesi di ATP può essere suddiviso in tre tappe:
1.
Traslocazione di protoni promossa da F0
2.
Formazione catalitica del legame fosfoanidrinico dell’ATP promossa da F1
3.
Accoppiamento della dissipazione del gradiente protonico con la sintesi di ATP,
che necessitano dell’interazione di F1 con F0
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Interconversione dei tre stati conformazionali
1 - L'ADP e il Pi si legano debolmente al sito di legame nella conformazione L.
2. Un cambiamento conformazionale promosso dal rilascio di energia libera
converte il sito L in sito di legame T (chiamato bTP) che catalizza la formazione
di ATP. Questa tappa implica anche cambiamenti conformazionali negli altri
due protomeri, che convertono il sito T a cui è legato l'ATP in sito aperto (O)
(detto bE), e che convertono il sito O in sito L.
3. L'ATP viene sintetizzato a livello del sito T di una subunità mentre si
dissocia dal sito O di un'altra subunità. L'energia libera fornita dal flusso dei
protoni facilita principalmente il rilascio dall'enzima dell'ATP appena
sintetizzato; cioè, promuove la transizione T
O, distruggendo così le
interazioni ATP-enzima che in precedenza avevano promosso la formazione
spontanea di ATP a partire da ADP e Pi, quando la subunità era nella
conformazione T.
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IL RAPPORTO P/O
E possibile esprimere la quantità di ATP sintetizzato in termini di molecole di
substrato ossidate.
Le ossidazioni di NADH e FADH2 sono associati rispettivamente con la sintesi di 3,
2 molecole di ATP.
Questa stechiometria chiamata rapporto P/O mette in relazione la quantità di ATP
sintetizzata con la quantità di ossigeno che viene ridotto.
80
Disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa
La presenza nella membrana interna di un agente che ne aumenta la
permeabilità agli ioni H+ disaccoppia la fosforilazione ossidativa dal trasporto
degli elettroni in quanto fornisce una strada per la dissipazione del gradiente
protonico elettrochimico che non necessita della sintesi di ATP. La
dissipazione di un gradiente elettrochimico di H+, che viene generato dal
trasporto degli elettroni ed è disaccoppiato dalla sintesi di ATP, produce
calore .
81
Meccanismo d’azione del 2,4-dinitrofenolo
Uno ionoforo trasportatore di protoni, come il DNP, disaccoppia la
fosforilazione ossidativa dalla catena di trasporto degli elettroni
dissipando il gradiente elettrochimico di protoni generato dal trasporto
degli elettroni.
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Nel tessuto adiposo bruno ( grasso bruno ) il disaccoppiamento della
fosforilazione ossidativa genera calore.
I mitocondri del grasso bruno contengono un canale per i protoni conosciuto con
il nome di proteina disaccoppiante ( UCP, chiamata Termogenina ).
Il flusso di protoni porta alla dissipazione del gradiente protonico presente
attraverso la membrana mitocondriale interna.
Questo processo consente all’ossidazione del substrato di procedere e di
generare calore senza sintesi diATP:
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Controllo coordinato della glicolisi e del
ciclo dell’acido citrico
Le fonti principali degli elettroni che entrano
nella catena di trasporto degli elettroni sono:
Glicolisi
Degradazioni degli ac. grassi
Ciclo dell’ac. citrico
Disegno schematico ,la sfera verde indica attivazione,
84
la sfera rossa indica inibizione
Specie reattive dell’ossigeno
Nella riduzione di O2 si cela un pericolo:
-il trasferimento di 4 elettroni dà origine a prodotti
innocui
- il trasferimento di un singolo elettrone forma un
anione superossido
-il trasferimento di 2 elettroni genera un perossido
O2 e-
.
O2 - e-
O2 285
I derivati tossici dell’ossigeno molecolare (ROS)
vengono rimossi da enzimi protettivi
.
2 O2 + 2H+
superossido
dismutasi
Catalasi
2H2 O2
2 GSH+H2O2
O2 + H2O2
.
2 H2O + O2
GSSG+ 2 H2O
glutatione perossidasi
Della superossido dismutasi (SOD) esistono due forma:
La SOD mitocondriale un tetramero contenente Mn
La SOD citosolica un dimero contenente Cu e Zn
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Alcune malattie degenerative sono associate a danni
ossidativi del mitocondrio:
Morbo di Parkinson
La malattia di Alzheimer
La Corea di Huntington
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Alcuni individui affetti dalla malattia ereditaria sclerosi laterale
amiotrofica (ALS; malattia di Lou Gehrig)
sono caratterizzati da una Cu,Zn-SOD mutata
Negli enzimi la magior parte delle mutazioni porta a una perdita
della funzione.
Nella ALS il difetto viene ereditato con un tratto dominante,
fattore che è compatibile con l’acquisizione di una attività tossica.
Infatti la SOD si comporta come una perossidasi e si pensa che
ossidi i lipidi, causando la degenerazione dei motoneuroni,
caratteristica della malattia.
88
Anemia da carenza di Ferro
Fabbisogno di ferro
in un uomo adulto: 1mg/die
in una donna in età fertile: 2mg/die
in una donna in gravidanza: 3mg/die
Il ferro è necessario per il mantenimento di una
quantità normale di
1. Hb,
2. di citocromi
3. di centri ferro-zolfo.
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Miopatie mitocondriali
-il lattato si accumula nel liquido cerebrospinale
-crampi, debolezza muscolare, encefalopatia
trattamento con CoQ10
-Carenza di CoQ10: forma rara che colpisce i bambini.
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Malattie mitocondriali
-Neuropatia ottica ereditaria di Leber (mutazione del
Complesso I)
- Miopatie mitocondriali
-I mitocondri svolgono un ruolo centrale nell’apoptosi
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CITOCROMO P450
Sono enzimi ossidativi detossificanti
Idrolizzano le molecole idrofobiche in modo da ottenere prodotti solubili
Molti dei substrati sono composti tossici come alcuni idrocarburi aromatici policiclici
alcuni dei quali cancerogeni: bifenili policlorurati(PCB)
L’idrossilazione catalizzata dal cit. 450 converte queste molecole in sostanze più
solubili per la successiva escrezione
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