Biologia Strutturale:
dai sincrotroni ai FEL
Francesco Stellato
I.N.F.N. – Sezione di Roma ‘Tor Vergata’
Roma, 22 aprile 2014
Luci di Sincrotrone
CNR – Roma, 22 Aprile 2014
Sommario
 Biologia
strutturale e radiazione X
Sincrotroni e FEL

Imaging con radiazione coerente

Cristallografia seriale:
dai sincrotroni ai FEL e viceversa

Prospettive future
Luci di Sincrotrone
CNR – Roma, 22 Aprile 2014
Source Peak Brilliance
Biologia strutturale e radiazione X
1E+36
MacKinnon
Perutz & Kendrew Potassium
Franklin,
1E+33
myoglobin
channel
Crick,
1E+30
Watson
Bragg & Bragg
DNA
1E+27 reflections Hodgkin
penicillin,
1E+24
B12
von Laue
1E+21 crystal diffraction
1E+18
1E+15 Röntgen
1E+12
Kornberg
1E+09
RNA
Kirz
&
1E+06
polymerase
Schmahl
Jacobsen
1E+03
Microscopy
Holography
1E+00
1880 1910 1940 1970 2000 2030
Year
Luci di Sincrotrone
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Sincrotroni e FEL
-Simile brillanza media, diversa brillanza di picco
1012 fotoni in ~0.05 μm2
Frequenza impulsi FEL: 100 Hz
-Diversa lunghezza degli impulsi:
10 -100 fs FEL
10-100 ps sincrotroni
-Piccola lunghezza d’onda:
Fino a 10 keV FELs
Fino a 100 keV sincrotroni
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Diffrazione prima della distruzione
Iniezione di particelle
Un impulso,
una misura
Impulso FEL
Pattern di diffrazione
E’ necessario ottenere
un segnale sufficiente
prima che il campione
si distrugga
R. Neutze et al, Nature 406 (2000)
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Imaging con radiazione coerente
Diffrazione prima della distruzione
1 micron
Pattern di diffrazione
Immagine SEM della struttura incisa
su una membrana di Si3N4
Pattern di diffrazione
Secondo Impulso
Immagine ricostruita
con risoluzione di 32 nm
FLASH
Primo impulso
Chapman et al. Nature Physics (2006)
1 micron
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Imaging con radiazione coerente
Ricostruzioni 2D – Campioni riproducibili e non
Mimivirus: uno dei virus più grandi
~500 nm diametro
200 nm
Ricostruzione 2D
Impulso LCLS:
10 to 300 fs,1.8 keV (0.68 nm)
Focalizzato a 7 μm 1016 W/cm2
Seibert et al. Nature 470 (2011)
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Imaging con radiazione coerente
Ricostruzioni 3D – Campioni riproducibili
Tomografia X al sincrotrone
Uno (o pochi) campioni
Misure da diverse angolazioni
Temperatura criogenica
Molti (106) campioni
Misure da angolazioni casuali
Temperatura ambiente
Larabell et al. Mol Biol Cell (2004)
J. Miao, Hodgson, Sayre, PNAS 98 (2001)
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Imaging con radiazione coerente
Misure analoghe possibili a
DiProI@FERMI
nel prossimo futuro
Yoon et al. Optics Express (2014)
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Cristallografia seriale
70000
60000
- Misura di pattern di diffrazione da
singoli cristalli (tipicamente >104)
50000
40000
30000
- Indicizzazione di ciascun pattern
- Media dei fattori di struttura
20000
Electron
NMR
1972 1976
X-ray
10000
1980
1984
1988
1992
1996
2000
Sono necessari cristalli
sufficientemente grandi
2004
2008
0
- Metodi standard (e non) per la
fasazione
Studio di cristalli piccoli.
Studi risolti in tempo.
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Cristallografia seriale al FEL
Setup sperimentale
Struttura del Fotosistema I con
risoluzione di 7Å
(limitata dalla lunghezza d’onda
del FEL)
Chapman et al. Nature 470, (2011)
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Cristallografia seriale al FEL
Catapsina B
Proteina coinvolta nelle tripanosomiasi
Struttura della forma glicosilata ignota
Comparsa di cristalli
aghiformi in cellule
di insetto che overesprimono la
proteina
10
μm
Immagine SEM di
alcuni cristalli
purificati
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Cristallografia seriale al FEL
Pattern di diffrazione di un singolo
microcristallo di catapsina B
Proiezione delle intensità misurate
su un piano dello spazio reciproco
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Cristallografia seriale al FEL
Redecke et al., Science
2013
Struttura tridimensionale della
forma glicosilata della proteina
Applicazioni di drug-design
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Cristallografia seriale – Sviluppi e Applicazioni
Misure pump-probe risolte in tempo
Aquila et al. Optics Express 470 (2011)
A breve Fotosistema I e II ad alta risoluzione
Lipidic Cubic Phase su GPCR
Liu et al. Science (2013)
Sponge phase su centri di
reazione fotosintetici
Johanssonn et al. Nature Methods (2012)
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Scattering & spettroscopie
Emissione di raggi X (XES)
Assorbimento di raggi X (XAS)
Scattering a piccolo angolo (SAXS)
Scattering a grande angolo (WAXS)
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Cristallografia seriale al sincrotrone
La metodologia seriale ‘spinta’ può essere re-importata ai sincrotroni
Riduzione del danno da radiazione
Misure a temperatura ambiente
Misure risolte in tempo
500 patterns da microcristalli di
catapsina B a temperatura
criogenica
Gati et al., IUCrJ 2014
40,000 patterns di microcristalli di lisozima
a temperatura ambiente
Stellato et al., to be published
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Prospettive future
FEL con repetition rates più elevate (XFEL)
Sincrotroni con brillanza più elevata (ESRF, PETRA III)
Migliori sistemi di iniezione del campione
FEL con brillanza di picco più elevata
Brillanze maggiori consentiranno di
spingersi verso l’imaging di singola
molecola ad alta risoluzione
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Prospettive future
avrà una
repetition rate
di 27 kHz
E’ necessario un hardware in grado
di archiviare tipicamente 8 Mb x 106
pattern/ dataset = 8 Tb / dataset
Sono necessari computer paralleli in
grado di processare in tempo breve
questa mole di dati.
I sistemi di iniezione del campione
devono essere ottimizzati in funzione
della repetition rate della sorgente
E’ necessario avere detector in
grado di registrare pattern di
diffrazione ad alta frequenza
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Grazie per l’attenzione
Contatti
Francesco Stellato
I.N.F.N. Sezione di Roma Tor Vergata
Via della Ricerca Scientifica, 1
Tel: 0039 06 7259 4284
[email protected]