PLATELIA™ Aspergillus IgG
96 TESTS
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DETERMINAZIONE DEGLI ANTICORPI IgG ANTIASPERGILLUS NEL SIERO O NEL PLASMA UMANO
MEDIANTE METODO IMMUNOENZIMATICO
1- SCOPO DEL TEST
Platelia™ Aspergillus IgG è test immunoenzimatico indiretto in micropiastra per l'individuazione degli anticorpi IgG anti-Aspergillus nel siero o
nel plasma umano.
2- INDICAZIONI PER L'USO
Platelia™Aspergillus IgG è un test che, interpretato congiuntamente ai dati
clinici e terapeutici del paziente ed eseguito in abbinamento ad altre
tecniche diagnostiche come esami radiologici, citologici, immunologici e
micologici diretti, può essere utilizzato come supporto alla diagnosi delle
patologie aspergillari.
3- INTERESSE CLINICO
Nei soggetti immunocompetenti è possibile riscontrare diverse patologie
aspergillari croniche, la cui diagnosi risulta spesso difficile.
Un processo di sensibilizzazione alle muffe è all'origine di manifestazioni
allergiche quali asma e aspergillosi broncopolmonare allergica (ABPA) che
rappresenta la forma clinica più grave 4, 8. I pazienti affetti da mucoviscidosi
rappresentano una popolazione a rischio di ABPA e vengono tenuti
regolarmente sotto controllo ai fini diagnostici 1, 2.
Nei soggetti esposti a un'inalazione massiva di spore, è possibile
riscontrare un'alveolite estrinseca, le cui forme più note sono la malattia
degli allevatori di uccelli e la malattia del polmone del contadino.
L'aspergilloma rappresenta la patologia cronica non allergica più tipica
derivante dalla colonizzazione di una cavità polmonare preesistente
(tubercolosi, enfisema, sarcoidosi, carcinoma polmonare) da parte del
micelio fungino che forma un vero e proprio "tartufo aspergillare" 4, 6, 10.
Tra le altre patologie non allergiche, l'aspergillosi cronica necrotizzante
rappresenta una forma molto grave, progressivamente mortale.
Nell'ambito di queste differenti manifestazioni cliniche, allergiche o non
allergiche, la formulazione della diagnosi dell'aspergillosi risulta spesso
difficile. I segni clinici, infatti, possono essere associati ad altre affezioni
micotiche, batteriche, virali e persino neoplastiche. L'efficacia dell'esame
radiologico, comunemente impiegato per l'aspergilloma, risulta di gran
lunga inferiore per il rilevamento di altre forme di aspergillosi in cui quadro
clinico ed esami radiologici costituiscono solo elementi di orientamento
diagnostico.
I parametri biologici, in particolare i test sierologici, sono indispensabili per
sostenere la diagnosi 5. Per tale ragione, è opportuno il monitoraggio
sierologico dei pazienti a rischio di aspergilloma, infezione grave spesso
clinicamente silenziosa. La diagnosi positiva dell'ABPA si basa su cinque
criteri, tra cui la determinazione serica di anticorpi anti-Aspergillus 13.
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Il test Platelia™Aspergillus IgG, che consente l'identificazione delle
immunoglobuline di classe G dirette contro un antigene ricombinante
purificato di Aspergillus, rappresenta uno strumento utile ai fini della
diagnosi delle forme croniche di aspergillosi osservate nei soggetti
immunocompetenti 3.
Recentemente nei pazienti oncoematologici è stata inoltre osservata la
presenza di anticorpi anti-aspergillo antecedente la somministrazione della
terapia immunosoppressiva per il trapianto di midollo osseo. Questi studi
suggeriscono il rilevamento di una colonizzazione da Aspergillus durante
gli esami per il ricovero in ospedale o precedenti al trapianto nei pazienti
che, dopo aver iniziato le terapie immunosoppressive, saranno a rischio di
aspergillosi invasiva.
4- PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
Platelia™ Aspergillus IgG è un test immunoenzimatico indiretto a 2 fasi
eseguita in micropiastra per l'individuazione degli anticorpi IgG antiAspergillus nel siero o nel plasma umano.
I campioni di sangue o di plasma diluiti vengono distribuiti nei pozzetti
della micropiastra sensibilizzati con antigene ricombinante purificato di
Aspergillus 7.
Al termine dell'incubazione a 37°C, le strip vengono lavate per rimuovere
eventuale materiale non fissato.
Il coniugato (anticorpo monoclonale di topo anti-IgG umane marcato con
perossidasi) viene aggiunto in ogni pozzetto della micropiastra e incubato
a 37°C.
In presenza di IgG anti-Aspergillus nel campione umano, si forma un
complesso
Ag Aspergillus - IgG umane anti Aspergillus - Ab di topo anti IgG umane/
perossidasi.
Le strip vengono lavate per rimuovere eventuale materiale non fissato.
L'aggiunta del cromogeno contenente il substrato della perossidasi
incubato a temperatura ambiente consente di rilevare l'eventuale presenza
dei complessi di nuova formazione.
La reazione enzimatica viene bloccata mediante l'aggiunta di acido
solforico 1N.
La lettura della densità ottica si ottiene con uno spettrofotometro
impostato su 450/620 nm.
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5- REAGENTI
I reagenti sono forniti in quantità sufficiente per realizzare 96 determinazioni in un massimo di 9 serie analitiche.
Per informazioni sulle condizioni di conservazione e sulla data di scadenza
dei reagenti, consultare le indicazioni riportate sulla confezione.
Prima dell'uso, i reagenti devono raggiungere la temperatura ambiente
(18-30°C). Dopo l'uso, riportare immediatamente tutti i reagenti a 2-8°C.
Riporre le strip inutilizzate nell'involucro protettivo e richiudere
accuratamente. Non rimuovere l'essiccante.
Etichettatura
R1
R2
Natura dei reagenti
Micropiastra:
- 96 pozzetti (12 strip da 8 pozzetti ciascuna)
Microplate
sensibilizzati con antigene Aspergillus
ricombinante purificato.
Soluzione di lavaggio concentrata (20x):
Concentrated
- tampone TRIS-NaCl (pH 7,4);
Washing
- 2% Tween® 20;
Solution (20x)
- conservante: < 1,5% ProClin™ 300.
Calibratore 0 UA/ml (pronto all'uso):
- tampone Tris-NaCl non contenente IgG
anti-Aspergillus;
- conservante: < 1,5% ProClin™ 300.
R3
Calibrator 0
R4a
Calibratore 10 UA/ml (pronto all'uso):
Calibrator 10 - siero umano contenente IgG anti-Aspergillus;
- conservante: < 1,5% ProClin™ 300.
R4b
R4c
R4d
R6
84
Calibratore 20 UA/ml (pronto all'uso):
- siero umano contenente anticorpi
Calibrator 20
anti-Aspergillus;
- conservante: < 1,5% ProClin™ 300.
Calibratore 40 UA/ml (pronto all'uso):
- siero umano contenente anticorpi
Calibrator 40
anti-Aspergillus;
- conservante: < 1,5% ProClin™ 300.
Calibratore 80 UA/ml (pronto all'uso):
- siero umano contenente anticorpi
Calibrator 80
anti-Aspergillus;
- conservante: < 1,5% ProClin™ 300.
Conjugate
Coniugato (pronto all'uso):
- anticorpo monoclonale di topo anti-IgG umane,
marcato con perossidasi;
- rosso fenolo;
- conservante: < 1,5% ProClin™ 300.
Presentazione
1
1 x 70 ml
1 x 2,5 ml
1 x 2,5 ml
1 x 2,5 ml
1 x 2,5 ml
1 x 2,5 ml
1 x 26 ml
Etichettatura
Natura dei reagenti
Presentazione
R7a
Sample
Diluent 1
Diluente campione 1 (pronto all'uso):
- tampone Tris-NaCl;
- 0,1% Tween® 20;
- rosso fenolo;
- conservante: 1,5% ProClin™ 300.
R7b
Sample
Diluent 2
Diluente campione 2 (pronto all'uso):
- tampone Tris-NaCl;
- 0,1% Tween® 20;
- porpora di bromocresolo;
- conservante: < 1,5% ProClin™ 300.
1 x 26 ml
R9
Chromogen
TMB
Soluzione del cromogeno TMB (pronta all'uso):
- soluzione di 3,3’,5,5’ -tetrametilbenzidina
(<0,1%), H2O2 (<1,0%)
1 x 28 ml
R10
Stopping
Solution
Soluzione bloccante (pronta all'uso):
- soluzione di acido solforico 1N.
1 x 28 ml
Pellicole adesive
1 x 28 ml
4
6- ISTRUZIONI PER LA SICUREZZA E IGIENE
1. Solo per uso diagnostico in vitro.
2. Solo per uso professionale.
3. Si sconsiglia l'uso di questo test con campioni diversi dal siero o dal
plasma umano.
4. I calibratori R4a, R4b, R4c e R4d vengono preparati a partire da siero
umano analizzato e risultato negativo per gli anticorpi anti-HIV-1, antiHIV-2, anti-HCV e per l'antigene HBs mediante test con marchio CE.
Tuttavia, tutti i reagenti devono essere manipolati come potenzialmente
infetti. Tutti i test devono essere realizzati conformemente alla norma
OSHA relativa agli agenti patogeni trasmessi per via ematica, livello di
biosicurezza 2 o conformemente ad altre pratiche di biosicurezza
appropriate.
5. Indossare indumenti protettivi, compreso il camice da laboratorio,
protezioni per gli occhi e il viso e guanti monouso (si raccomanda l'uso
di guanti in materiale sintetico senza lattice), e manipolare i reagenti del
kit, nonché i campioni dei pazienti, rispettando le buone pratiche di
laboratorio (BPL) necessarie. Al termine del test, lavarsi accuratamente
le mani.
6. Non pipettare con la bocca.
7. Non fumare, bere né mangiare nelle aree di manipolazione dei campioni
o dei reagenti del kit.
8. Evitare di schizzare campioni o soluzioni.
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9. Asciugare accuratamente eventuali fuoriuscite di liquido contaminante
non contenente acido con un disinfettante efficace. I disinfettanti che
possono essere utilizzati comprendono (in via non limitativa) una
soluzione di candeggina diluita al 10% (soluzione di ipoclorito di sodio
allo 0,5%), etanolo al 70% o Wescodyne Plus™ allo 0,5%. Il materiale
utilizzato per la pulizia dovrà essere gettato in un contenitore speciale
per i rifiuti contaminati.
ATTENZIONE: non introdurre mai soluzioni contenenti candeggina
nell'autoclave.
10. Se il liquido contaminante è un acido, assorbire o neutralizzare le
superfici con bicarbonato di sodio, quindi risciacquare e asciugare; in
presenza di materiale a rischio biologico, pulire l'area con un
disinfettante chimico.
11. Smaltire tutti i campioni e i reagenti utilizzati per il test come
potenzialmente infettivi. Per lo smaltimento dei rifiuti chimici e biologici
pericolosi attenersi alle direttive vigenti.
12. ATTENZIONE: di seguito viene fornito un elenco dei potenziali rischi
chimici associati ad alcuni componenti del kit (consultare il capitolo 5 REAGENTI).
Alcuni reagenti contengono ProClin™ 300 < 1,5%
R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle.
S23-24-37-60: Non respirare i vapori/aerosoli. Evitare il contatto
con la pelle. Usare guanti adatti. Questo materiale e il suo
Xi - Irritante contenitore devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi.
13. La scheda dei dati di sicurezza (SDS) è disponibile su richiesta.
7- PRECAUZIONI D'USO
1. I CAMPIONI CONGELATI, CONSERVATI IN CONDIZIONI NON
SPECIFICHE, POSSONO PRODURRE RISULTATI FALSI POSITIVI A
CAUSA DELLA CONTAMINAZIONE CON FUNGHI E/O BATTERI.
2. Non utilizzare il kit o qualsiasi reagente del kit dopo la data di scadenza.
3. Non mischiare, né combinare reagenti provenienti da lotti diversi in uno
stesso ciclo.
NOTA: oltre ai lotti forniti con il kit, è possibile utilizzare la soluzione di
lavaggio (R2, identificata* con 20x in verde), la soluzione del cromogeno
(R9, identificata* con TMB in azzurro) e la soluzione bloccante (R10,
identificata* con 1N in rosso), a condizione che vengano utilizzati reagenti
strettamente equivalenti di un solo e unico lotto nel corso di uno stesso
ciclo.
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NOTA: la soluzione di lavaggio (R2, identificata* con 20x in verde) non
può essere miscelata con la soluzione di lavaggio (R2, identificata*
con 10x in blu) fornita nei kit dei reagenti Bio-Rad.
* sull'etichetta del flacone
4. Prima dell'uso, attendere 30 minuti per consentire al reagente di
raggiungere la temperatura ambiente (da 18 a 30°C).
5. Utilizzare preferibilmente materiale monouso. Qualora non fosse
disponibile, utilizzare elementi in vetro perfettamente lavati e sciacquati
con acqua distillata.
6. Verificare l'accuratezza delle pipette e il buon funzionamento degli
strumenti utilizzati.
7. Ricostituire accuratamente il reagente R2, evitando contaminazioni.
8. La reazione enzimatica è particolarmente sensibile al metallo o agli ioni
metallici. Di conseguenza, evitare che gli elementi di metallo entrino in
contatto con le varie soluzioni contenenti il coniugato o la soluzione di
substrato.
9. Durante il pipettaggio dei calibratori e dei campioni, utilizzare un nuovo
puntale per ogni siero in modo da evitare qualsiasi contaminazione.
10. Per un lavaggio adeguato dei pozzetti, eseguire il numero di cicli di
lavaggio raccomandato e assicurarsi che i pozzetti, una volta riempiti,
vengano completamente svuotati. Il lavaggio deve essere effettuato con
un lavatore per micropiastre.
11. Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo di tempo compreso fra
la fine dell'operazione di lavaggio e l'aggiunta dei reagenti.
12. Non utilizzare mai lo stesso contenitore per il coniugato e la soluzione di
rivelazione.
13. Evitare l'esposizione della soluzione di cromogeno o della soluzione di
rivelazione alla luce intensa durante la conservazione o l'incubazione.
Evitare che le soluzioni contenenti il cromogeno entrino in contatto con
agenti ossidanti.
14. Il Cromogeno (R9) deve essere incolore. La colorazione blu indica che il
reagente non può essere utilizzato, pertanto dovrà essere sostituito.
15. Evitare che la soluzione bloccante entri in contatto con agenti ossidanti,
metallo o ioni metallici.
16. Non riversare eventuali quantità di coniugato non distribuite nel flacone
originale.
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8- PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI
Micropiastra (R1)
Ogni vassoio contenente 12 strip è confezionato in bustine. Tagliare la
bustina con le forbici, immediatamente sotto la chiusura. Aprire la bustina
ed estrarre il vassoio. Riporre il vassoio contenente le strip non utilizzate
nella bustina originale. Richiudere accuratamente la bustina e conservarla
a una temperatura compresa tra 2 e 8°C.
Dopo l'apertura della bustina sottovuoto, le strip conservate a +2-8°C nel
loro involucro originale e richiuse accuratamente mantengono la stabilità
per 8 settimane. Verificare la presenza di essiccante.
Soluzione di lavaggio (R2)
Preparare la soluzione di lavaggio diluendo 20 volte la soluzione di
lavaggio concentrata in acqua distillata: 50 ml di R2 in 950 ml di acqua
distillata (prevedere 650 ml di soluzione di lavaggio diluita per una piastra
intera da 12 strip, escluso il volume morto del lavatore utilizzato). Dopo la
diluizione, la soluzione di lavaggio può essere conservata per 14 giorni a
una temperatura compresa tra 2 e 30°C.
Dopo l'apertura, la soluzione di lavaggio concentrata conservata a 2-30°C,
in assenza di contaminazione, mantiene la stabilità fino alla data di
scadenza indicata sull'etichetta.
Calibratore 0 (R3), calibratore 10 (R4a), calibratore 20 (R4b),
calibratore 40 (R4c), calibratore 80 (R4d)
I calibratori sono pronti all'uso.
Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a
2-8°C mantengono la stabilità per 8 settimane.
Coniugato (R6), Diluente campione 1 (R7a), Diluente campione 2
(R7b), Soluzione del cromogeno TMB (R9)
Questi reagenti sono pronti all'uso.
Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a
2-8°C mantengono la stabilità per 8 settimane.
Soluzione bloccante (R10)
Questo reagente è pronto all'uso.
Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, il reagente conservato a
2-8°C mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata
sull'etichetta.
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9- CAMPIONI
1. I test sono effettuati su campioni di siero o di plasma raccolti in provette
contenenti anticoagulante di tipo EDTA, eparina o citrato.
2. Per il prelievo, il trattamento e la conservazione di questi campioni
ematici, attenersi alle seguenti raccomandazioni:
• prelevare i campioni ematici secondo le procedure standard;
• per il siero, consentire la completa coagulazione dei campioni prima
di procedere alla centrifugazione;
• conservare le provette ben chiuse;
• dopo la centrifugazione, estrarre il siero o il plasma e conservarlo in
una provetta ben chiusa;
• è possibile conservare i campioni a una temperatura compresa tra
2 e 8°C, a condizione che il test venga eseguito entro 4 giorni;
• se il test non viene eseguito entro 4 giorni, congelare i campioni a
una temperatura di -20°C (o -80°C);
• non utilizzare campioni scongelati più di cinque volte; i campioni
dovranno essere accuratamente omogeneizzati (Vortex) dopo lo
scongelamento e prima del test.
3. I campioni contenenti 90 g/l di albumina o 100 mg/l di bilirubina non
coniugata, i campioni lipemici contenenti l'equivalente di 36 g/l di
trioleina (trigliceride) o i campioni sottoposti ad emolisi contenenti 10 g/l
di emoglobina non influenzano i risultati.
4. Non riscaldare i campioni.
10- PROCEDURA
Materiale fornito
Consultare il capitolo REAGENTI.
Materiale necessario, ma non fornito
1. Acqua distillata o demineralizzata sterile per la diluizione della soluzione
di lavaggio concentrata.
2. Carta assorbente.
3. Guanti monouso.
4. Occhiali di protezione.
5. Ipoclorito di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio.
6. Pipette o multipipette, automatiche o semi-automatiche, regolabili o
fisse, per misurare e dispensare da 10 µl a 1.000 µl, 1 ml, 2 ml e 10 ml.
7. Provette graduate da 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1.000 ml.
8. Provette monouso.
9. Contenitore per rifiuti contaminati.
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10. Agitatore tipo "Vortex".
11. Incubatore di micropiastre con regolazione termostatica impostata su
37 ± 1°C (*).
12. Sistema di lavaggio automatico o semi-automatico per micropiastre (*).
13. Lettore di micropiastre dotato di filtri 450 e 620 nm (*).
(*) Per ulteriori informazioni sugli strumenti convalidati dai nostri servizi
tecnici, contattare Bio-Rad.
Procedura EIA
Conformarsi strettamente al protocollo fornito.
Conformarsi alle buone pratiche di laboratorio:
- prima dell'uso, attendere circa 30 minuti per consentire ai reagenti di
raggiungere la temperatura ambiente (18-30°C);
- utilizzare tutti i calibratori a ogni esecuzione del dosaggio per
convalidare la qualità del test.
Procedere nel seguente modo:
1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione dei
calibratori e dei campioni.
2. Prediluire estemporaneamente i campioni da analizzare: 1/20, ossia
10 µl di siero o di plasma + 190 µl di diluente campione 1 (R7a). La
prediluizione del campione assume una colorazione rossastra.
3. Estrarre il vassoio e le strip (R1) dall'involucro protettivo. Riporre le strip
inutilizzate nell'involucro e richiudere.
4. Distribuire 190 µl di diluente campione 2 (R7b) nei pozzetti destinati a
ricevere i campioni da analizzare e aggiungere 10 µl dei campioni
prediluiti 1/20, mescolando delicatamente con riaspirazione per 2 o
3 volte.
N.B.: la distribuzione dei campioni può essere controllata in questa fase
della manipolazione. Dopo l'aggiunta di 10 µl dei campioni prediluiti,
infatti, i pozzetti contenenti i campioni assumono una colorazione grigia. I
pozzetti che non contengono campioni, invece, assumono una colorazione blu-viola.
5. Distribuire i calibratori pronti all'uso nella misura di 200 µl per pozzetto,
secondo il piano seguente:
- A1: Calibratore 0
- B1: Calibratore 10 UA/ml
- C1: Calibratore 20 UA/ml
- D1: Calibratore 40 UA/ml
- E1: Calibratore 80 UA/ml
90
1
2
3
A
R3
S4
S12
B
R4a S5
C
R4b S6
D
R4c S7
E
R4d S8
F
S1
S9
G
S2
S10
H
S3
S11
4
5
6
7
8
9
10
11
12
6. Ricoprire la micropiastra con pellicola adesiva ed esercitare pressione
su tutta la superficie per assicurarne la tenuta.
7. Incubare immediatamente la micropiastra in un incubatore di
micropiastre a secco per 60 ± 5 minuti a 37°C (± 1°C).
8. Preparare la soluzione di lavaggio diluita (fare riferimento al capitolo 8).
9. Rimuovere la pellicola adesiva. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in
un contenitore per rifiuti contaminati (contenente ipoclorito di sodio).
10. Lavare la micropiastra 4 volte con un lavatore per micropiastre (con
800 µl di soluzione di lavaggio diluita). Dopo l'ultimo lavaggio,
capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente sulla carta
assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.
11. Prima dell'uso, mescolare il contenuto agitando il flacone R6. Se si
prevede di utilizzare una pipetta multicanale, prelevare solo il volume
necessario alla realizzazione del ciclo di analisi: prevedere 3,5 ml per
due strip da 8 pozzetti.
12. Distribuire 200 µl di coniugato R6 in ogni pozzetto.
13. Ricoprire la micropiastra con pellicola adesiva esercitando pressione
su tutta la superficie per assicurarne la tenuta.
14. Incubare la micropiastra in un incubatore di micropiastre a secco per
60 ± 5 minuti a 37°C (± 1°C).
15. Rimuovere la pellicola adesiva. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in
un contenitore per rifiuti contaminati (contenente ipoclorito di sodio).
16. Lavare la micropiastra 4 volte con un lavatore per micropiastre (con
800 µl di soluzione di lavaggio diluita). Dopo l'ultimo lavaggio,
capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente sulla carta
assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.
17. Distribuire rapidamente e al riparo dalla luce diretta 200 µl di
cromogeno TMB (R9) in ogni pozzetto.
91
18. Incubare la micropiastra al buio per 30 ± 5 minuti a temperatura
ambiente (+18-30°C). Non utilizzare la pellicola adesiva durante questa
fase di incubazione.
19. Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante (R10) in ogni pozzetto,
utilizzando la stessa sequenza e lo stesso ritmo utilizzati per l'aggiunta
della soluzione di rivelazione. Miscelare bene.
20. Asciugare accuratamente il fondo di ogni micropiastra.
21. Leggere la densità ottica di ogni pozzetto a 450 nm (filtro di riferimento
di 620 nm) nei 30 minuti successivi all'aggiunta della soluzione
bloccante (non esporre le strip alla luce prima della lettura).
22. Prima della trascrizione dei risultati, verificare la corrispondenza fra la
lettura e il piano di distribuzione delle micropiastre.
11- CONTROLLO DI QUALITÀ (CRITERI DI VALIDITÀ)
Utilizzare i calibratori su ogni micropiastra per tutti i test.
Per la convalida del test, è necessario soddisfare i seguenti criteri:
• Valore di densità ottica:
DO R4a > 0,200
• Rapporti:
DO R4a / DO R3 > 3,00
DO R4b / DO R4a > 1,20
DO R4c / DO R4b > 1,20
DO R4d / DO R4c > 1,00
12- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Tracciato della curva di calibrazione
La curva di calibrazione è realizzata con i 5 punti del range (calibratori) 0,
10, 20, 40 e 80 UA/ml.
Tracciare la curva di calibrazione [DO = funzione (UA/ml)] riportando
sull'asse verticale (asse delle Y) le DO dei calibratori R3, R4a, R4b, R4c e
R4d e sull'asse orizzontale (asse delle X) la rispettiva concentrazione in
UA/ml. Optare per un tracciato punto per punto per collegare i diversi
punti del range.
Determinazione della concentrazione di anticorpi IgG anti-Aspergillus
(UA/ml) dei campioni analizzati
A partire dalla curva precedentemente tracciata, è possibile determinare,
per ogni campione analizzato, la concentrazione di anticorpi IgG antiAspergillus espressa in UA/ml.
92
Interpretazione dei risultati
• I campioni con una concentrazione inferiore a 5 UA/ml (C < 5) sono
considerati "negativi" per la presenza dell'anticorpo IgG antiAspergillus.
• I campioni con una concentrazione compresa tra 5 e 10 UA/ml
(5 ≤ C < 10) sono considerati "intermedi" per la presenza
dell'anticorpo IgG anti-Aspergillus.
• I campioni con una concentrazione pari o superiore a 10 UA/ml (C ≥ 10)
sono considerati "positivi" per la presenza dell'anticorpo IgG antiAspergillus.
I punti del range utilizzati per tracciare la curva di calibrazione non
consentono la determinazione precisa della titolazione per concentrazioni
superiori a 80 UA/ml.
Per una più precisa determinazione del titolo dei campioni fortemente
positivi, ripetere il test effettuando un'ulteriore prediluizione del siero nel
diluente R7a
- per i campioni che presentano un titolo > 80 UA/ml con una
DO < 3,000: effettuare una prima prediluizione a 1/5 del siero in R7a;
- per i campioni che presentano un titolo > 80 UA/ml con una
DO ≥ 3,000: effettuare una prima prediluizione a 1/60 del siero in R7a.
Dopo questa prima prediluizione, seguire la procedura descritta nel
capitolo 10 (prediluizione a 1/20 in R7a seguita da una diluizione a 1/20 in
R7b).
Il titolo del campione fortemente positivo verrà calcolato moltiplicando il
titolo ottenuto per il fattore della prima prediluizione (5 o 60 a seconda
della prediluizione realizzata).
Un risultato "intermedio" potrà essere confermato analizzando un nuovo
campione prelevato dal paziente nel corso delle settimane successive alla
data del prelievo che ha dato come esito un titolo intermedio.
Durante un monitoraggio sierologico del paziente, si raccomanda di
analizzare tutti i campioni del paziente nel corso di uno stesso ciclo per
consentire il rilevamento di variazioni significative dei titoli anticorpali IgG
anti-Aspergillus.
13- LIMITI DI UTILIZZO
1. Un risultato negativo non può escludere la diagnosi dell'aspergillosi.
È possibile stabilire una diagnosi dell'aspergillosi solo dopo un
confronto dei risultati clinici, terapeutici, radiologici, citologici,
micologici diretti e sierologici interpretando ogni singolo elemento con
circospezione.
93
2. In un paziente immunocompetente sospetto di aspergillosi, un siero
prelevato precocemente durante il decorso dell'infezione aspergillare
può presentare un risultato negativo ai fini dell'identificazione dell'IgG
anti-Aspergillus. Pertanto, si raccomanda di eseguire un nuovo test su
un campione prelevato a distanza di due o tre settimane.
3. In caso di campioni analizzati per la presenza degli anticorpi IgG antiAspergillus, è necessario seguire attentamente la procedura e
l'interpretazione dei risultati descritte per il test Platelia™ Aspergillus
IgG. Si consiglia agli utilizzatori del kit di leggere attentamente l'inserto
all'interno della confezione prima di eseguire il test. In particolare, il
protocollo deve essere seguito con attenzione per il pipettaggio dei
campioni e dei reagenti, il lavaggio della micropiastra e la scelta dei
tempi delle fasi di incubazione.
4. Nel caso in cui il campione o il reagente non sia stato aggiunto
conformemente alle istruzioni, il test può produrre un risultato falso
negativo. In caso di errore procedurale, sarà necessario ripetere il test
su altri campioni dello stesso paziente.
5. La contaminazione di pozzetti contenenti campioni di pazienti negativi
con pozzetti contenenti controlli o campioni di pazienti positivi può
verificarsi nel caso in cui venga versato il contenuto di un pozzetto in un
altro pozzetto a causa di una manipolazione non accurata della
micropiastra o di una tecnica di pipettaggio non corretta durante la fase
di aggiunta dei reagenti.
6. L'efficacia del test Platelia™ Aspergillus IgG non è stata valutata su
campioni di siero o di plasma provenienti da neonati o pazienti
pediatrici.
7. L'efficacia del test Platelia™ Aspergillus IgG non è stata stabilita per
una lettura manuale e/o una determinazione visiva dei risultati.
14- VALORI ATTESI
La prevalenza di IgG anti-Aspergillus determinata per mezzo del test
Platelia™ Aspergillus IgG è stata valutata su un pannello di 129 campioni
prelevati da 64 pazienti francesi affetti da mucoviscidosi, a rischio di
infezione aspergillare. Dei 129 campioni, 53 sono risultati positivi e 12
intermedi, con una prevalenza di 53/129 = 41,1 % [IC 95%: 32,5-50,1%],
considerando i risultati intermedi come negativi e di 65/129 = 50,4 % [IC
95%: 41,4-59,3%], considerando i risultati intermedi come positivi. In termini
di pazienti, su 64 analizzati, 29 hanno presentato almeno un campione
positivo e 5 almeno uno intermedio e nessuno positivo, con una prevalenza
di 29/64 = 45,3 % [IC 95%: 32,8-58,3%], considerando i risultati intermedi
come negativi e di 34/64 = 53,1 % [IC 95%: 40,2-65,7%], considerando i
risultati intermedi come positivi.
94
15- EFFICACIA
A. Studi di riproducibilità
• Precisione intra-saggio (ripetibilità):
Al fine di valutare la ripetibilità intra-saggio, sono stati analizzati in una
stessa serie, a 32 riprese, un campione negativo e cinque positivi. Il titolo
in UA/ml è stato determinato per ciascun campione. La tabella riportata di
seguito fornisce la media dei titoli, la deviazione standard (DS) e il
coefficiente di variazione (%CV) per ogni campione:
Precisione intra-saggio (ripetibilità)
N=32
Campione Campione Campione
Campione Campione
Campione debolmente debolmente debolmente
mediamente fortemente
positivo
positivo
positivo
negativo
positivo
positivo
N. 1
N. 2
N. 3
Media
(UA/ml)
2,44
9,31
10,31
13,64
31,69
43,10
DS
0,067
0,320
0,218
0,387
0,939
1,546
CV%
2,7%
3,4%
2,1%
2,8%
3,0%
3,6%
• Precisione inter-saggio (riproducibilità):
Al fine di valutare la riproducibilità inter-saggio, i sei campioni (uno
negativo e cinque positivi) sono stati analizzati in duplicato in due cicli al
giorno per un periodo di 20 giorni. Il titolo in UA/ml è stato determinato per
ciascun campione positivo. Il campione negativo è espresso sotto forma
di rapporto. La tabella riportata di seguito fornisce la media delle
concentrazioni o dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente
di variazione (%CV) per ciascun campione:
Precisione inter-saggio (riproducibilità)
N=80
Campione Campione Campione
Campione Campione
Campione debolmente debolmente debolmente
mediamente fortemente
positivo
positivo
positivo
negativo
positivo
positivo
N. 1
N. 2
N. 3
Media
(UA/ml)
1,88
3,60
6,99
12,34
32,49
51,65
DS
0,26
0,46
0,92
1,49
5,25
7,65
CV%
13,8%
12,8%
13,1%
12,1%
16,2%
14,8%
95
B. Reazioni crociate
Numero di campioni
analizzati
Numero di
positivi
Anticorpi anti-Candida
54
2*
Anticorpi anti-ds-DNA
10
0
ANA positivi
10
0
Mieloma IgG
10
0
Toxoplasmosi IgG
10
0
Anticorpi umani anti-topo
12
0
HIV
10
0
Fattore reumatoide
10
0
Patologia
* I due sieri risultati positivi sono stati confermati con un kit commerciale
per la rivelazione di anticorpi IgG anti-Aspergillus.
C. Linearità
Il range di linearità del test Platelia™ Aspergillus IgG è stato stabilito tra 2
e 80 UA/ml, a partire da studi di diluizione realizzati su 5 campioni positivi.
D. Studi clinici
L'efficacia del test Platelia™ Aspergillus IgG è stata esaminata su 2 siti, su
un totale di 499 campioni provenienti da 329 pazienti.
SENSIBILITÀ
La sensibilità è stata determinata su un pannello di 277 campioni
provenienti da due siti francesi e ripartiti come specificato di seguito:
• 129 sieri derivati da 64 pazienti affetti da mucoviscidosi e con un
elevato rischio di aspergillosi broncopolmonare allergica (ABPA) sono
stati analizzati nel sito 1.
• 148 sieri derivati da 43 pazienti affetti da aspergillosi cronica grave sono
stati analizzati nel sito 2.
Risultati Sito 1
La tabella riportata di seguito riassume i risultati ottenuti nel sito 1 su una
popolazione di pazienti affetti da mucoviscidosi e la cui diagnosi di ABPA
è stata effettuata sulla base di: dati clinici, risultati ottenuti tramite IgE
totali, elettrosineresi aspergillare, individuazione di anticorpi aspergillari e
individuazione di anticorpi IgG anti-Aspergillus con un test EIA
commerciale diverso da Platelia™ Aspergillus IgG. I pazienti sono stati
classificati in 4 categorie: ABPA assente, ABPA anamnestica, ABPA
sospetta e ABPA confermata 9, 11. L'assenza di ABPA non esclude ad ogni
modo la presenza di un'altra patologia aspergillare 12.
96
Lo stato del paziente analizzato mediante elettrosineresi aspergillare o
PlateliaTM Aspergillus IgG è stato considerato positivo quando almeno uno
dei campioni del paziente è risultato positivo nel metodo corrispondente.
Lo stesso stato, altrimenti, è stato considerato intermedio se almeno uno
dei campioni del paziente è risultato intermedio e negativo quando tutti i
campioni del paziente sono risultati negativi.
Risultati
elettrosineresi
Categoria di
pazienti
Risultati PlateliaTM Aspergillus IgG
Stato del paziente
Positivi (%)
(Intermedi
considerati
negativi)
Positivi (%)
(Intermedi
considerati
positivi)
Numero di
pazienti
Positivo
Intermedio
Negativo
Negativo
40
7 (1)
4 (2)
29
Positivo
9
8
1
0
8/9
(88,9%)*
9/9
(100,0%)*
5
5 (3)
0
0
5/5
(100,0%)*
5/5
(100,0%)*
0
-
-
-
-
-
4
Negativo
pazienti con
ABPA
Positivo
sospetta
2
2 (4)
0
0
2/2
(100,0%)*
2/2
(100,0%)*
2
2
0
0
2/2
(100,0%)*
2/2
(100,0%)*
6
Negativo
pazienti con
ABPA
confermata Positivo
3
2 (5)
0
1
2/3
(66,7%)*
2/3
(66,7%)*
3
3
0
0
3/3
(100,0%)*
3/3
(100,0%)*
Stato
49
pazienti
senza ABPA
5
Negativo
pazienti con
ABPA
anamPositivo
nestica
7/40 (17,5%) 11/40 (27,5%)
95% IC [7,3-32,8%] 95% IC [14,6-43,9%]
: 57% (4/7) dei risultati positivi al test Platelia™ Aspergillus IgG sono risultati tali con un altro kit
EIA in commercio per l'individuazione degli IgG anti-Aspergillus.
(2)
: 100% (4/4) dei risultati intermedi al test Platelia™ Aspergillus IgG sono risultati negativi con un
altro kit EIA in commercio per l'individuazione degli IgG anti-Aspergillus.
(3)
: 100% (5/5) dei risultati positivi al test Platelia™ Aspergillus IgG sono risultati tali con un altro kit
EIA in commercio per l'individuazione degli IgG anti-Aspergillus.
(4)
: 100% (2/2) dei risultati positivi al test Platelia™ Aspergillus IgG sono risultati tali con un altro kit
EIA in commercio per l'individuazione degli IgG anti-Aspergillus.
(5)
: 100% (2/2) dei risultati positivi al test Platelia™ Aspergillus IgG sono risultati tali con un altro kit
EIA in commercio per l'individuazione degli IgG anti-Aspergillus.
* : non è stato possibile calcolare l’intervallo di confidenza del 95% a causa delle dimensioni
insufficienti del campione.
(1)
97
Risultati Sito 2
La tabella riportata di seguito riassume i risultati ottenuti su una
popolazione di campioni di pazienti affetti da aspergillosi cronica grave,
scelti sulla base di una diagnostica per immagini dell'area polmonare
compatibile, di colture di espettorazioni positive all'Aspergillus e di test
sierologici positivi ottenuti da immunoelettroforesi (IEP) aspergillare.
• Risultati per campione
Risultati IEP
Categoria di
pazienti
Stato
Positivo
aspergillosi
Intermedio
cronica
grave
Negativo
Risultati Platelia™ Aspergillus IgG
Numero di
campioni
Positivo
Intermedio
Negativo
109
105
3
1
22
15
4
3
17
6
5
6
Sensibilità
(intermedi
considerati
negativi)
Sensibilità
(intermedi
considerati
positivi)
96,3%
99,1 %
95% IC [90,8-99,0] 95% IC [95,0-100]
68,2 %
86,4 %
95% IC [45,1-86,1] 95% IC [65,1-97,1]
35,3 %
64,7 %
95% IC [14,2-61,7] 95% IC [38,3-85,8]
• Risultati per paziente
Lo stato del paziente analizzato mediante immunoelettroforesi aspergillare
o Platelia™ Aspergillus IgG è stato considerato positivo quando almeno
uno dei campioni del paziente è risultato positivo nel metodo
corrispondente. Lo stesso stato, altrimenti, è stato considerato intermedio
se almeno uno dei campioni del paziente è risultato intermedio e negativo
quando tutti i campioni del paziente sono risultati negativi.
Risultati IEP
Categoria di
pazienti
aspergillosi
cronica
grave
Risultati Platelia™ Aspergillus IgG
Stato
Numero di
paziente
Positivo
Intermedio
Negativo
Positivo
40
38
1
1
Negativo
3
1
1
1
Sensibilità
(intermedi
considerati
negativi)
Sensibilità
(intermedi
considerati
positivi)
95,0%
97,5 %
95% IC [83,1-99,4] 95% IC [86,8-99,9]
33,3 % *
66,7 % *
* : non è stato possibile calcolare l’intervallo di confidenza del 95% a causa delle dimensioni
insufficienti del campione.
98
SPECIFICITÀ
La specificità è stata determinata su un pannello di 222 campioni
provenienti da 222 pazienti ospedalieri del sito 1 (200 campioni) e del sito
2 (22 campioni) che non presentavano alcun sintomo di infezione
aspergillare.
Popolazione
analizzata
/sito
Numero di
campioni
Negativo
Intermedio
Positivo
Sito 1
200
199
1
0
Sito 2
22
22
0
0
Totale
222
221
1
0
Specificità
(intermedi
considerati
positivi)
Specificità
(intermedi
considerati
negativi)
99.5%
100%
IC 95% [97,2%-100,0%]
IC 95% [98,2-100,0%]
100%
100%
IC 95% [84,6%-100,0%]
IC 95% [84,6%-100,0%]
99.6%
100%
IC 95% [97,5-100,0%]
IC 95% [98,3-100,0%]
16. CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE
Tutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema di
qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione del
prodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può essere
commercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La
documentazione relativa alla produzione e ai controlli di ogni singolo lotto è
conservata presso Bio-Rad.
17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
Vedere la versione Inglese.
99
17. BIBLIOGRAPHY
1. Agarwal, R. 2009. Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Chest 135 (3):
p 805-826.
2. Agarwal, R., Nath, A., Aggarwal, A. N., Gupta, D., Chakrabarti, A. 2009.
Aspergillus hypersensitivity and allergic bronchopulmonary aspergillosis in
patients with acute severe asthma in a respiratory intensive care unit in
North India. Mycoses 24.
3. Centeno-Lima, S., de Lacerda, J. M., do Carmo, J. A., Abecasis,
M., Casimiro, C., Exposto, F. 2002. Follow-up of anti-Aspergillus IgG and
IgA antibodies in bone marrow transplated patients with invasive
aspergillosis. Journal of clinical laboratory analysis 16: p156-162.
4. Denning, D. W. 2001. Chronic forms of pulmonary aspergillosis. Clinical
microbiology and infection 7 (Suppl 2): p25-31.
5. Latzin, P., Hartl, D., Regamey, N., Frey, U., Schoeni, M. H., Casaulta,
C. 2008. Comparison of serum markers for allergic bronchopulmonary
aspergillosis in cystic fibrosis. Eur. Respiratory Journal 31: p36-42.
6. Pagella, F., Matti, E., De Bernardi, F., Semino, L., Cavanna, C., Marone,
P., Farina, C., Castelnuovo, P. 2007. Paranasal sinus fungus ball: diagnosis
and management. Mycoses 50: p451-456.
7. Sarfati, J., Monod, M., Recco, P., Sulahian, A., Pinel, C., Candolfi, E.,
Fontaine, T., Debeaupuis, J.P., Tabouret, M., Latgé, J.P. 2006.
Recombinant antigens as diagnostic markers for aspergillosis. Diagnostic
microbiology and infectious disease 55: p. 279-291.
8. Schubert, M. S. 2009. Allergic fungal sinusitis: pathophysiology, diagnosis
and management. Medical Mycology p1-7.
9. Shah, A. 2008. Aspergillus-associated hypersensitivity respiratory disorders.
Indian journal of Chest disease and allied sciences 50: p117-128
10. Shah, R., Vaideeswar, P., Pandit, S. P. 2008. Pathology of pulmonary
aspergillomas. Indian journal of pathology and microbiology 51 (3): p342345.
11. Thia, L. P., Balfour Lynn, I. M. 2009. Diagnosing allergic
bronchopulmonary aspergillosis in children with cystic fibrosis, Paediatric
Respiratory Reviews 10: p37–42
12. Tillie-Leblond, I., Tonnel, A. B. 2005. Allergic bronchopulmonary
aspergillosis. Allergy 60: p1004-1013.
13. Virnig, C., Bush, R. K. 2007. Allergic bronchopulmonary aspergillosis: a US
perspective. Current opinion in Pulmonary Medicine 13: p67-71.
100
101
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33
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