Centro
Interdipartimentale per la
Ricerca in Viticoltura ed
Enologia
Progetto ValViVe
Valorizzazione della tipicità dei vitigni autoctoni e dei
vini veneti
Legge regionale 4 aprile 2003. N. 8 e s.m.i Dgr n. 2111 del 10 luglio 2007 (Bando 2007).
CIRVE – Distretto Veneto del Vino – mis. 2a “Progetti di innovazione e ricerca rivolti allo sviluppo di prodotto o
processo” – Progetto: “Valorizzazione delle tipicità dei vitigni autoctoni e dei vini veneti (ValViVe)”.
Rettifica Ddse n. 181 del 16 settembre 2010.
1
INDICE
1. Premessa
di Vasco Boatto
pag. 5
2. Proposte competitive e pre-competitive
»
6
»
7
1.1 Strategia 1: diradamento degli acini
»
8
1.2 Risultati
»
9
1.3 Conclusioni
» 10
1.4 Strategia 2: allungamento del rachide
» 10
1.5 Risultati
» 10
1.6 Conclusioni
» 11
1.7 Conclusioni generali
» 12
3. Attività competitive (breve periodo)
1. Modificazione dell’architettura del grappolo per il miglioramento della qualità, sanità e
appassimento delle bacche della Cultival Raboso Piave
di Claudio Bonghi, Angelo Ramina e Fiorenza Ziliotto
2. La selezione in vigneto di lieviti per l’enologia: un ceppo ecotipo dal terroir del Raboso
Piave
di Viviana Corich, Raul Baldin, Barbara Bovo, Milena Carlot, Fabio Zilio, Angiolella Lombardi,
Tiziana Nardi, Alberto Marangon e Alessio Giacomini
2.1 Introduzione
» 18
2.2 Isolamento di lieviti ecotipici e distribuzione nel territorio della DOC Piave
» 19
2.3 Prima prova di microvinificazione
» 22
2.4 Seconda prova di micro vinificazione
» 25
2.5 Considerazioni conclusive
» 32
2.6 Ringraziamenti
» 32
3. I funghi fitopatogeni: un mezzo da sfruttare per la stabilizzazione dei vini bianchi
di Andrea Curioni , M. Lucchetta e Simone Vincenzi
» 34
3.1 Un enzima proteolitico fungino per la stabilizzazione dei vini bianchi
» 35
3.2 Un polisaccaride fungino che rimuove le proteine instabili
» 38
3.3 Conclusioni
» 42
2
4. Attività pre-competitive (medio-lungo periodo)
1. Caratterizzazione varietale di cultivar di vitis vinifera mediante DNA barcoding di regioni
cloroplastiche e genotyping di geni nucleari singola copia
di Nicolè S., Barcaccia G., Lucchin M.
» 44
1.1 Individuazione e frequenza degli snp nelle sequenze target
» 45
1.2 Costruzione di aplotipi e genotipi cultivar specifici
» 46
1.3 Caso di studio: le cultivar locali
» 47
1.4 Conclusioni
» 48
2. Identificazione di variazione genetiche in Vitis vinifera attraverso il ri-sequenziamento di
cultivar di Merlot e Prosecco
di C. Rigobello, A. Vezzi, R. Schiavon, A. Albiero, C. Forcato e G. Valle
» 53
3. La plasticità fenotipica in Vitis vinifera cv Corvina
di Silvia Dal Santo, Sara Zenoni, Giovanni Battista Tornielli, Marianna Fasoli, Flavia Guzzo,
Massimo Delledonne, Mario Pezzotti
3.1 Introduzione
» 57
3.2 Risultati
» 59
3.3 Conclusione
» 61
3.4 Legenda
» 62
4. La famiglia multi genica delle stilbeni sintetasi in vite: organizzazione genomica e analisi di
espressione in condizioni di stress biotico e abiotico
di Alessandro Vannozzi, Ian B. Dry, Margherita Lucchin
4.1 Abstract
» 66
4.2 Introduzioni
» 66
4.3 Risultati
» 68
4.4 Analisi filogenetica della famiglia delle VvSTS
» 69
4.5 Analisi di espressione delle famiglia VvSTS in condizioni di stress biotici e abiotici
» 69
4.6 Discussione
» 71
5. Un approccio trascrittomico per lo studio dello stress nutrizionale in piante di Glera
di Elisabetta Barizza, Michela Zottini
5.1 Riassunto
» 83
5.2 Introduzione
» 83
5.3 Metodologia
» 84
5.4 Risultati
» 85
5.5 Conclusioni
» 89
3
5. Valutazione economica delle tecniche proposte e loro valorizzazione in termini di strategie di
marketing
di Vasco Boatto
1. Modalità di valutazione economica dei risultati conseguiti
» 90
2. Risultati delle attività di ricerca
» 93
2.1 A – Unità di ricerca n. 1
» 93
2.2 B – Unità di ricerca n. 2
» 94
2.3 C – Unità di ricerca n. 3
» 95
2.4 D – Unità di ricerca n. 4
» 96
2.5 E – Unità di ricerca n. 5
» 98
2.5 F – Unità di ricerca n. 6
» 98
2.6 G – Unità di ricerca n. 7
» 99
3. Valutazione economica delle ricadute
» 100
4. Azioni di marketing
» 106
5. Considerazioni conclusive
» 111
4
1. PREMESSA
di Vasco Boatto *
Nell’attuale fase di mercato favorevole ai vini nazionali ed in particolare a quelli veneti, il comparto
vitivinicolo si trova ad affrontare importanti questioni tecnico-produttive ed organizzative,
finalizzate ad accrescerne la competitività. In tale contesto, assumono particolare rilevanza per il
sistema vitivinicolo veneto l’ulteriore miglioramento della qualità, la riduzione dei costi e la
stabilizzazione dei redditi.
In quest’ottica si è mosso il progetto ValViVe (Valorizzazione della tipicità dei vitigni autoctoni e
dei vini veneti), terminato il 31 dicembre 2010. Esso è stato realizzato in attuazione del secondo
Patto di sviluppo 2007-20101 del “Distretto Veneto del Vino”, concentrandosi sulla ricerca e
l’innovazione (obiettivo 1  asse di intervento 1). In sostanza il progetto si è sviluppato seguendo
una strategia basata su due indirizzi: il primo era rappresentato dal miglioramento del vigneto che
assume grande rilevanza nella determinazione del vantaggio competitivo, il secondo era costituito
dall’attivazione di un sistema di relazioni a rete finalizzato a concentrare le attività di ricerca e
sperimentazione.
Le finalità del progetto erano:
1) la caratterizzazione molecolare del germoplasma viticolo veneto mediante la rilevazione di
polimorfismi di sequenza per una rapida identificazione dei vitigni;
2) l’applicazione della genomica funzionale allo studio dell’interazione vitigno-ambiente e
caratterizzazione di geni coinvolti in vie metaboliche correlate alla qualità della bacca;
3) il miglioramento del processo di vinificazione con particolare riferimento alla stabilizzazione dei
vini bianchi e alle performance di lieviti e batteri nella fermentazione;
4) l’economicità delle tecnologie proposte e loro valorizzazione in termini di strategie di
marketing.
In generale i benefici attesi per il Distretto Veneto del Vino erano:
 l’avanzamento della ricerca e l’acquisizione di nuove conoscenze;
 un maggiore incentivo alla ricerca e allo sviluppo precompetitivo sui processi e sui prodotti già
esistenti tramite l’acquisizione di nuove conoscenze utili;
 l’innalzamento del valore qualitativo dei vini veneti.
* CIRVE - Centro Interdipartimentale per la Ricerca in Viticoltura ed Enologia
1
DGR n. 1576 del 29 maggio 2007.
2
AA.VV.: Guida all’analisi costi- benefici dei progetti di investimento (Fondi Strutturali, Fondo di Coesione e ISPA);
1
DGR n. 1576 del 29 maggio 2007.
5
2. PROPOSTE COMPETITIVE E PRE-COMPETITIVE
Le attività sono finalizzate ad individuare soluzioni innovative per il miglioramento della
competitività dei vini prodotti nella regione Veneto e, in riferimento alle diverse tipologie di
innovazione, si possono suddividere in due differenti classi:
1) Competitive, appartengono a questa categoria le attività che hanno riguardato lo studio di
innovazioni che danno un beneficio riscontrabile già nel breve periodo. Rientrano in questo
ambito, in particolare, quelle azioni che attraverso nuove tecniche colturali e una selezione
di nuovi biotipi di lievito e di trattamenti dei vini con coadiuvanti per la chiarifica,
determinano miglioramenti della qualità organolettico sensoriale dei vini presi in
considerazione rispetto alle tecniche tradizionali.
2) Pre-competitive, a questa classe, fanno parte quelle attività di ricerca che, pur non
determinando una chiara valutazione dei benefici economici da essi derivanti, si potranno
mettere in pratica nel medio o nel lungo periodo. Rientrano In questa tipologia lo studio del
genoma della vite di varietà tipiche della regione Veneto e come quest’ultime si comportano
in relazione a agli stress indotti dall’uomo.
Mentre per il primo tipo di attività i benefici sono riscontrabili nell’anno in cui si attua la nuova
tecnica e possono derivare dal confronto con i risultati raccolti dalle produzioni precedenti, per
quelle pre-competitive invece, il processo di valutazione è più complesso. In particolare, i benefici
derivanti dalle innovazioni, richiedono l’acquisizione di dati relativi all’impatto che queste hanno
sul consumatore in termini di preferenza. Pertanto, nell’ambito del progetto, le ricadute di queste
attività possono essere valutate solo in parte.
I risultati delle ricerche avranno riflessi, innanzitutto, in termini di avanzamento delle conoscenze e
di stimolo per ulteriori progressi nel campo della ricerca vitivinicola, secondariamente, per gli
imprenditori vitivinicoli del territorio coinvolto e per gli altri operatori del settore come, ad
esempio, i consorzi e le imprese di marketing, di comunicazione e di promozione.
6
3. PROPOSTE COMPETITIVE (BREVE PERIODO)
1. Modificazione dell’architettura del grappolo per il miglioramento della
qualità, sanità e appassimento delle bacche della Cultivar Raboso Piave
Referenti scientifici: prof. Angelo Ramina, dott. Claudio Bonghi e dott.ssa Fiorenza Ziliotto
L’architettura del grappolo può essere, come indicato da numerose ricerche, uno dei fattori
predisponenti gli attacchi di patogeni fungini (Vail et al., 1998), ma può avere degli effetti
sostanziali sulla qualità globale della bacca nonché sulla applicabilità della tecnica di appassimento.
Su grappoli eccessivamente compatti, infatti, si sviluppano più facilmente gli attacchi di patogeni
quali Botrytis poichè l’asciugatura, dopo eventi piovosi e la deposizione di cere epicuticolari, sono
sfavorite dall’ampia area di contatto tra le bacche (Marois et al. 1986; Percival et al. 1993). Tali
caratteristiche influiscono negativamente anche sul processo di appassimento in quanto la perdita di
acqua è rallentata. Per ovviare a questi problemi le strategie per ridurre la compattezza del grappolo
possono essere:
-
Il diradamento degli acini;
-
La modifica della lunghezza del rachide.
Il diradamento degli acini è stato adottato con successo per il Pinot grigio e il Pinot bianco
(Margoni e Mattedi, 2004), mentre nelle cv pigmentate esso può portare anche a conseguenze
negative (Ough et al., 1984). Il diradamento degli acini si basa principalmente sull’impiego di
formulati aventi come principio attivo l’acido gibberellico (GA), applicati per la prima volta a metà
degli anni sessanta per aumentare la dimensione delle bacche di uve apirene (Lynn e Jensen,
1966). Recentemente, oltre al GA, per tale scopo sono stati proposti dei prodotti auxinici. Tuttavia,
mentre sono stati condotti numerosi studi sull’effetto diradante dell’auxina o di suoi analoghi
sintetici sui frutticini (Westwood, 1993), le informazioni sull’utilizzo degli stessi come diradanti
fiorali sono ancora scarse. Tra gli analoghi sintetici delle auxine applicati come diradanti fiorali il
più promettente sembra essere il 3,5,6-tricloro-2-piridilossiacetico (3, 5, 6 TPA) che, in melo,
7
impedisce in maniera selettiva lo sviluppo dei frutti dai fiori laterali del corimbo (Knight et al.,
1987).
Per quanto attiene alla lunghezza del rachide è noto che esso dipende principalmente dal numero di
fiori per infiorescenza e di ramificazioni laterali. Da studi condotti su pisello (Nomura et al., 1997)
patata (Garcia-Maroto et al. 2000) e Arabidopsis (Altamura et al. 2001) è emerso che la
lunghezza del rachide è il risultato di differenti velocità di crescita per divisione e/o distensione
cellulare. L’alterazione di questi processi di crescita può essere ottenuta attraverso l’impiego di
formulati a base ormonale in grado di stimolare i processi di crescita del rachide. In tal senso le più
promettenti sembrano essere miscele di auxine e GA.
Il presente progetto si propone di utilizzare entrambe le strategie per modificare la compattezza del
grappolo del Raboso Piave, caratteristica che rappresenta uno dei limiti maggiori nell’utilizzo di
questo vitigno, utilizzando rispettivamente il 3, 5, 6 TPA e una miscela di GA e auxina nota con il
nome di LG257.
1.1 STRATEGIA 1: DIRADAMENTO DEGLI ACINI
Questo attività ha riguardato la valutazione della capacità di un prodotto auxinico-analogo (3,5,6tricloro-2-piridilossiacetico, 3, 5, 6 TPA) di ridurre la compattezza del grappolo della cv Raboso
Piave. Al fine di valutare l’efficacia del prodotto si è condotta anche una prova sulla cv Pinot grigio,
per la quale esistevano già prove sperimentali con prodotti analoghi. Per tale scopo sono state scelti
nell’area di produzione del Piave vigneti in piena produzione allevati a Sylvoz di Raboso Piave e
Pinot grigio con sesti di impianto di 2,2 x 1,1 m. Il disegno sperimentale ha previsto la
somministrazione, in corrispondenza della fascia dei grappoli, in due differenti epoche (Ei=BBCH
65 e Eii=BBCH 73, corrispondenti rispettivamente a 50% della fioritura ed alla dimensione
dell’acino di un grano di pepe) dell’3,5,6 TPA alla concentrazione di 125 (CI), 250 (CII), 375 (CIII)
ml/ha. Per ogni tesi sono stati irrorati blocchi randomizzati di 30 viti distribuiti su due filari. Dal
momento del trattamento fino all’invaiatura ogni dieci giorni sono stati prelevati 10 grappoli per tesi
e determinato il loro peso e quello di cento acini. I medesimi rilievi sono stati fatti con cadenza
quindicinale dall’invaiatura fino alla raccolta. Alla vendemmia su un campione di 20 viti per tesi
sono stati rilevati la compattezza del grappolo, il numero di grappoli e la produzione totale per
ceppo. Su campioni di succo derivati da 30 grappoli per tesi sono stati determinati i solidi solubili
totali (°Brix), l’acidità titolabile (g/L), il pH e il rapporto buccia/polpa. I dati raccolti sono stati
sottoposti all’analisi della varianza (ANOVA e test di Newman-Keuls, Statsoft, vs 7.1).
8
1.2 RISULTATI
Le osservazioni condotte durante lo sviluppo del grappolo hanno messo in evidenza che del 3,5,6
TPA è risultato efficace solamente sulla cv Pinot grigio, mentre sul Raboso Piave gli effetti non
sono stati significativi. Nel Pinot grigio, si sono osservate riduzioni significative del numero di acini
(con valori compresi tra il 40-50% rispetto il controllo), con una relazione inversa rispetto alla
concentrazione impiegata solo per l’applicazione allo stadio BBCH 65 (Fig. 1A). La maggiore
efficienza del principio diradante dell’applicazione in piena fioritura potrebbe essere associata ad
una diminuzione della disponibilità di fotosintetati, dovuta ad una ridotta capacità fotosintetica delle
foglie, piuttosto che ad un‘azione caustica (Stopar et al., 1997). Tale ipotesi va verificata con
misure dell’assimilazione fogliare, ma è interessante notare che, pur con differenze legate al
genotipo, la maggiore espansione fogliare si registra tra l’allegagione e l’invaiatura (Gomez-delCampo et al., 2000), epoca in cui è stata effettuata la seconda applicazione del diradante.
La riduzione del numero di acini ha comportato una diminuzione del peso complessivo del
grappolo, ma solo fino a 45 giorni dalla raccolta (Fig. 1B). Dopo questa data si è verificato un
recupero del peso dovuto ad una maggiore crescita dell’acino, come dimostrato dagli incrementi
volumetrici delle bacche rilevati fino alla vendemmia (raddoppio del volume contro un aumento del
10% nel controllo). Gli effetti osservati nel corso dello sviluppo della bacca sono stati confermati
alla raccolta calcolando l’indice di compattezza del grappolo (Fig. 2) e la produzione per ceppo
(Fig. 3) che sono risultati staticamente differenti solo per l’applicazione effettuata allo stadio
BBCH65. In particolare, la distribuzione dell’indice di compattezza si è attestata sulle classi
spargolo e medio e la produzione per ceppo è risultata mediamente più bassa rispetto al testimone
del 40%.
I minori livelli produttivi hanno comportato un incremento dell’accumulo degli zuccheri nella
bacche delle tesi trattate in prima epoca con le concentrazioni più alte (250 e 375 ml/ha), in cui il
formulato ha determinato differenze di oltre 1,5 °Brix, mentre nel caso della concentrazione più
bassa è stata osservata una diminuzione non significativa del °Brix. Per quanto riguarda il pH sono
stati registrati lievi incrementi, mentre i valori di acidità titolabile sono risultati sensibilmente più
bassi rispetto al testimone. Il rapporto tra i solidi solubili totali e l’acidità totale è risultato più
elevato nella tesi trattata con la concentrazione di 250 ml/Ha indicando una migliore palatabilità
9
delle uve. Il rapporto tra buccia e polpa invece è risultato più basso nelle tesi trattate a conferma del
maggiore accrescimento finale delle bacche delle tesi trattate in confronto al controllo (Tab. 1).
1.3 CONCLUSIONI
I risultati delle osservazioni preliminari dell’impiego del 3, 5, 6-TPA come diradante fiorale sulla cv
Pinot grigio indicano che il suo effetto è principalmente condizionato dall’epoca di
somministrazione ed in misura minore dalle dosi impiegate. Il diradante si è dimostrato in grado di
ridurre sensibilmente l’indice di compattezza del grappolo a fronte però, di una maggiore
dimensione finale della bacca. Dati simili erano stati ottenuti impiegando GA la cui applicazione
però, è fortemente dipendente anche dalla concentrazione. In considerazione di ciò, il 3,5,6 TPA
può essere una valida alternativa all’acido gibberellico per il diradamento della vite.
1.4 STRATEGIA 2: ALLUNGAMENTO DEL RACHIDE
A fronte della mancata efficacia del TPA nel ridurre la compattezza del grappolo di Raboso è stato
testato un prodotto a base di una miscela tra GA e auxine. Come per la strategia precedente sono
state condotte delle prove anche sulla cv Pinot grigio. I vigneti utilizzati sono stati i medesimi e il
disegno sperimentale ha previsto la somministrazione, in corrispondenza della fascia dei grappoli,
in due differenti epoche (EI=BBCH 55 e EII=BBCH 60), corrispondenti rispettivamente a
infiorescenza distese,con i fiori ancora chiusi e raggruppati tra loro ed all’inizio della fioritura del
prodotto LG 257 (della ditta Gobbi) alla concentrazione di 250 (CI) e 375 (CII) ml/ha. Per ogni tesi
sono stati irrorati blocchi randomizzati di 20 viti distribuiti su due filari. Dal momento del
trattamento fino all’invaiatura ogni dieci giorni è stata misurata la lunghezza del rachide principale
di 10 grappoli per tesi. Il medesimo rilievo è stato fatto con cadenza quindicinale dall’invaiatura
fino alla raccolta. Alla vendemmia, su un campione di 10 viti per tesi, sono stati rilevati il peso e il
numero di grappoli e la produzione totale per ceppo. Su campioni di succo derivati da 30 grappoli
per tesi sono stati determinati i solidi solubili totali (°Brix), l’acidità titolabile (g/L), il pH e il
rapporto buccia/polpa e solo per il Raboso il livello di antociani totali. I dati raccolti sono stati
sottoposti all’analisi della varianza (ANOVA e test di Newman-Keuls, Statsoft, vs 7.1).
1.5 RISULTATI
10
LG257 è stato in grado di allungare il rachide solo con l’applicazione allo stadio 55, mentre nello
stadio 60 si osservata una riduzione della lunghezza. Tale effetto è risultato significativo,
indipendentemente dalla concentrazione utilizzata solo nella cv Raboso (Fig. 4A), mentre per la cv
Pinot Grigio le lunghezze rilevate, pur mostrando misure tendenzialmente superiori nei grappoli
trattati (in particolar modo per la concentrazione CII), non sono risultate significative (Fig. 4B).
Questo dato conferma che il momento di applicazione e la suscettibilità varietale sono fattori che
condizionano in modo rilevante la risposta al trattamento. L’effetto di allungamento sul rachide dei
grappoli della cv Raboso Piave è visibile sin dal primo rilievo dopo il trattamento ed è mantenuto
sino alla raccolta.
La presenza di un effetto prolungato sulla riduzione della compattezza è confermata dalla relazione
tra lunghezza del rachide, osservata al primo rilievo dopo il trattamento, e il peso del grappolo alla
raccolta. (Fig. 5).
I risultati, infatti, mettono in evidenza che tendenzialmente i grappoli del
controllo si collocano nel quadrante con grappoli corti e di peso elevato (A), mentre quelli dei
trattati (in particolare quelli con la CI) si collocano nel quadrante con grappoli lunghi e peso ridotto
(D). Poiché le auxine e le GA controllano la divisione e la distensione cellulare ed è nota la loro
capacità di modulare l’attività per idrolasi di parete, è stato valutato il loro effetto sulla trascrizione
di geni codificanti per espansina (EXP), β-1-3 (B1.3G) e β-1-4 (B1.4G) endogluconasi, cellulasi
acida
(CA)
e
basica
(BA),
pectinesterasi
(PE),
pectinacetilesterasi
(PAE),
e
xyloglucangalattosiltransferasi (XGT) a 14 giorni dal trattamento, in corrispondenza della massima
differenza di lunghezza tra i rachidi di controllo e trattati (Fig. 6). L’effetto della miscela LG257 è
stato significativamente stimolante per le EXP e, in misura minore, per PE, B1.4G, AC e BC,
mentre sull’espressione degli altri geni è stato trascurabile (B1.3G, PAE) o depressorio (XGT).
Quest’ultimo risultato è particolarmente interessante se si considera che il ruolo di XGT è quello di
assicurare la resistenza meccanica della parete cellulare durante la crescita, promuovendo i legami
tra le fibrille di cellulosa (Peña et al., 2004). Questa considerazione induce a supporre che la
repressione di XGT coordinata alla stimolazione di EXT e EG potrebbe essere responsabili
dell’allungamento del rachide.
In termini di qualità globale il trattamento ha determinato, in particolar modo per la concentrazione
CI, un innalzamento significativo del grado brix del livello di antociani totali e dei polifenoli
estraibili nonché del rapporto buccia/polpa. Quest’ultimo dato indica che le bacche nei grappoli
trattati sono tendenzialmente più piccole e di conseguenza i grappoli sono meno compatti (Tab. 2).
1.6 CONCLUSIONI
11
Sulla base dei risultati ottenuti il trattamento con la miscela di GA e auxine sembra in grado di
indurre un allungamento del rachide (dovuto ad una maggiore deformabilità delle pareti delle
cellule del rachide) e quindi, una minore compattezza del grappolo. Il trattamento è accompagnato
da un leggero miglioramento della qualità globale della bacca. A questo punto è possibile avviare
delle analisi molecolari avendo a disposizione un protocollo sperimentale in grado di indurre
modificazioni sostanziali della conformazione del grappolo con riflessi positivi, seppur non
eclatanti, sulla qualità della bacca. Recentemente è stato osservato che l’ortologo di vite del gene
TFL1 (Terminal FLower) di Arabidopsis è coinvolto nella determinazione della conformazione del
grappolo (Fernandez et al., 2010). L’espressione di questo gene ed altri ad esso associati (alcuni
MADS-box) potranno essere valutati a livello del rachide dei grappoli trattati per mettere in
evidenza se la miscela utilizzata è un regolatore di espressione del set di geni coinvolti nella
conformazione del grappolo.
1.7 CONCLUSIONI GENERALI
La presente ricerca ha avuto ricadute a breve e medio termine. Le prime riguardano la messa a
punto di un protocollo per ridurre la compattezza dei grappoli della cv Raboso Piave che si basa
sull’allungamento del rachide e non sul diradamento degli acini. Le seconde riguardano un
protocollo sperimentale per ottenere grappoli con lunghezza del rachide diverse su cui valutare i
meccanismi molecolari alle base della conformazione del grappolo.
12
FIGURE
Fig. 1. Effetto del trattamento con 3,5,6 TPA sul numero di acini per grappolo (A) e sul peso del grappolo (B) durante
il loro ciclo di sviluppo. L’applicazione del 3,5,6 TPA è stata fatta in due epoche EI (BBCH 65) e EII (BBCH 73) con
tre concentrazioni diverse pari a 125 (CI), 250 (CII), 375 (CIII) ml/ha. I dati sono la media del peso e del numero di
acini di 10 grappoli. Le barre rappresentano la deviazione standard (±SD).
Fig. 2. Effetto del trattamento con 3,5,6 TPA sulla compattezza del grappolo, valutata usando la seguente scala 1=
molto spargoli, 2= spargoli, 3= medi, 4= compatti, alla raccolta. L’applicazione del 3,5,6 TPA è stata fatta in due
epoche EI (BBCH 65) e EII (BBCH 73) con tre concentrazioni diverse pari a 125 (CI), 250 (CII), 375 (CIII) ml/ha. La
frequenza relativa delle varie classi, espressa come percentuale, è stata calcolata valutando l’indice di compattezza di 15
grappoli.
13
Fig. 3. Effetto del trattamento con 3,5,6 TPA sulla produzione per ceppo. L’applicazione del 3,5,6 TPA è stata fatta in
due epoche EI (BBCH 65) e EII(BBCH 73) con tre concentrazioni diverse pari a 125 (CI), 250 (CII), 375 (CIII) ml/ha. I
dati sono la media della produzione di 20 piante. Le barre rappresentano la deviazione standard ((±DS).
Fig. 4. Effetto del trattamento con miscela di GA ed auxine sulla lunghezza del rachide dei grappoli della cv Raboso
Piave (A) e Pinot Grigio (B) durante il loro ciclo di sviluppo. L’applicazione della miscela è stata fatta in
corrispondenza dello stadio BBCH 55 con due concentrazioni diverse pari a 250 (CI), 375 (CII) ml/ha. I dati sono la
media delle misure del rachide di 10 grappoli. Le barre rappresentano l’errore standard (±ES).
14
Fig 5. Relazione tra lunghezza del rachide al primo rilievo dopo 14 giorni dal trattamento (BBCH 55) e peso del
grappolo alla raccolta. Le misure si riferiscono ad almeno 5 grappoli del controllo (quadrato) e dei trattati con 250 ml/ha
(CIi, triangolo) e 375 (CII, cerchio) di LG257.
35
30
Espressione rela va
25
20
15
10
5
0
B1.4G
AC
BC
B1.3G
PE
PAE
XGT
EXP
Fig. 6. Livelli di espressione di geni coinvolti nel metabolismo parietale delle cellule del rachide di infiorescenze di
controllo (barra bianca) e trattati con 250 ml/ha (CII, barra grigia) e 375 (CII, barra nera) di LG257 dopo 14 giorni dal
trattamento. I livelli di mRNA sono stati determinati via RT-PCR e normalizzati rispetto al valore misurato al T0
(BCH55). I geni analizzati sono β-1,3 (B1.3G) e β-1,4 (B1.4G) endoglucanasi cellulasi acida (AC) e basica (BC),
pectinesterasi (PE), pectinmetilesterasi (PAE), xyloglucan galattosiltransferasi (XGT) e espansina (EXP).
15
TABELLE
solidi solubili
(° Brix)
pH
controllo
EiCi
EiCii
EiCiii
17.80b
16.30a
19.60c
19.00bc
3.93b
3.75a
3.94b
3.98b
acidità
totale
(g/L)
7.25b
6.12a
6.44a
6.55a
EiiCi
EiiCii
EiiCiii
17.10b
17.90b
17.90b
3.81ab
3.89b
3.93b
6.60a
7.07ab
7.10b
zuccheri buccia/polpa
/acidi
24.55a
26.61ab
30.43b
29.02b
0.98a
0.50c
0.44c
0.43c
25.90a
25.30a
25.22a
0.71b
0.72b
0.81ab
Tabella 1. Determinazione degli indici di maturazione (°Brix, pH, acidità totale, rapporti zuccheri:acidi e rapporto
buccia/polpa) di acini prelevati da 30 grappoli non trattati (controllo) e trattati con 3,5,6 TPA in due momenti del ciclo
di sviluppo EI (BBCH 65) e EII (BBCH 73) con tre concentrazioni diverse pari a 125 (CI), 250 (CII), 375 (CIII) ml/ha.
Le medie seguite dalla stessa lettera non sono significativamente differenti (Duncan p±0.05).
controll
o
Ci
Cii
Solidi
solubili
(°Brix)
pH
Antociani totali
(mg/L)
18.4 a
19.35 b
18.9°
3.31a
3.27 a
3.39 a
758.27 a
819.17 b
910.35 bc
Polifenoli estraibili
(% polifenoli totali) buccia/polpa
45.12 a
47.51 b
49.39 bc
21.84 a
25.04 b
24.57 b
Tabella 2. Determinazione degli indici di maturazione (°Brix, pH, Antociani totali, Polifenoli estraibili e rapporto
buccia/polpa) di acini prelevati da 10 grappoli non trattati (controllo) e trattati con una miscela di GA+auxine alo stadio
di sviluppo BBCH 55 e con due concentrazioni diverse pari a 250 (CI), 375 (CII) ml/ha. Le medie seguite dalla stessa
lettera non sono significativamente differenti (Duncan p±0.05).
16
BIBLIOGRAFIA
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17
2. La selezione in vigneto di lieviti per l’enologia: un ceppo ecotipico dal terroir
del Raboso Piave
Viviana Corich1,2, Raul Baldin1, Barbara Bovo2, Milena Carlot1, Fabio Zilio4, Angiolella Lombardi4, Tiziana
Nardi1,3, Alberto Marangon4 e Alessio Giacomini1,2
1 – Centro Interdipartimentale per la Ricerca in Viticoltura ed Enologia, Università di Padova, Conegliano (TV)
2- Dipartimento di Agronomia Animali Alimenti Risorse Naturali e Ambiente, Università di Padova, Legnaro (PD)
3 – Lallemand Inc., Succursale Italiana, Castel d’Azzano (VR)
4 – Veneto Agricoltura, Istituto per la Qualità e le Tecnologie Alimentari, Thiene (VI)
2.1 INTRODUZIONE
La selezione di lieviti vinari ha lo scopo di ottenere, attraverso un programma ben definito, colture
di lievito capaci di condurre il processo fermentativo verso risultati predeterminati che puntano alla
qualità del prodotto vino. I primi lieviti, isolati negli anni sessanta, sono stati selezionati con lo
scopo di esaltare le caratteristiche tecnologiche (vigore fermentativo, alcol-tolleranza), in modo da
ottenere prodotti senza difetti. Oggi i lieviti sono selezionati sulla base di caratteristiche che
possano migliorare la qualità dei vini attraverso l’espressione di precursori già presenti nei mosti e
la produzione di metaboliti secondari (alcoli superiori, esteri, chetoni, aldeidi). Particolarmente
interessanti sono gli sforzi nella selezione di lieviti con alto valore salutistico, cioè che non
producono sostanze pericolose per la salute del consumatore (amine biogene e ocratossine)
(Vincenzini et al., 2005). Potenzialmente l’uso dei lieviti selezionati può presentare anche degli
svantaggi per nulla trascurabili, poiché fra tutte le colture commercializzate di lieviti secchi attivi
(LSA) sono relativamente poche quelle realmente utilizzate in tutto il mondo dai vinificatori. Per
questo motivo, è sicuramente forte il pericolo di una uniformazione dell’agente microbico con il
risultato di ottenere una riduzione della biodiversità dei lieviti vinari associati all’ambiente di
cantina, ma soprattutto una standardizzazione del gusto e un appiattimento delle caratteristiche
specifiche delle diverse aree produttive. Inoltre, gli starter reperibili in commercio, pur possedendo
caratteri di indubbia importanza enologica, proprio perché provengono da realtà vitivinicole
estranee non sono sempre capaci di sviluppare completamente i sapori e gli aromi tipici di un vino.
In questo contesto l’introduzione dei lieviti ecotipici può rappresentare la soluzione sia ai problemi
di mantenimento della biodiversità microbica che di drastica diminuzione delle sfumature
qualitative ora descritti. Infatti questi lieviti vengono utilizzati esclusivamente nella zona di
isolamento e sono selezionati seguendo le caratteristiche di tipicità del prodotto locale. Sono i lieviti
che originariamente davano luogo alla fermentazione spontanea e contribuivano in questo modo a
18
costruire le caratteristiche di tipicità del vino, poiché ogni zona pedoclimatica e ogni singolo
vigneto nel tempo costituiscono una micro-nicchia per l’insediamento di uno specifico complesso di
lieviti enologici (principalmente appartenenti alla specie Saccharomyces cerevisiae). I
microrganismi di questi micro-habitat sono adattati ed evoluti per vivere in quel luogo, ma
soprattutto sono responsabili dei caratteri organolettici specifici del vino prodotto localmente.
Con lo scopo di esaltare le caratteristiche di un interessante vino regionale, il Raboso è stato
condotto un progetto di selezione per l’identificazione nei vigneti della DOC Piave di un lievito con
buone caratteristiche enologiche in grado di intensificarne il terroir. Le uve di Raboso Piave infatti,
danno origine a mosti con elevata acidità totale (fino a 15 g/l), di cui poco meno del 50% è
costituita da acido malico e un pH intorno a 2,90; possiedono come caratteristica varietale un’ottima
struttura polifenolica (3,5-4 g/kg) che viene integrata mediante un idoneo periodo di
invecchiamento. Gli interventi in fase di vinificazione per ridurre le spigolosità di questo vino,
dovute all’aggressività tanninica e all’elevata acidità, sono sicuramente necessari soprattutto se lo
scopo è quello di far conoscere il prodotto al di fuori dei confini regionali senza stravolgere le
caratteristiche di un vitigno che rimane “tipico” ed espressione del territorio (Ciolfi, 2004; Ciolfi et
al., 2005). Per questo motivo è stato intrapreso un programma di selezione di lieviti ecotipici isolati
solo dai vigneti coltivati a Raboso, in modo da ottenere uno starter selezionato che fosse parte della
microflora naturale di questa peculiare varietà e in grado perciò di fermentare in queste difficili
condizioni e al contempo di esaltarne l’identità. Il progetto di selezione si è avvalso anche
dell’analisi sensoriale, effettuata in più fasi da un panel di giudici esperti che ha permesso
l’identificazione di lieviti non solo dotati di spiccate caratteristiche tecnologiche, ma anche in grado
di valorizzare le caratteristiche varietali dell’uva Raboso.
2.2 ISOLAMENTO DI LIEVITI ECOTIPICI E DISTRIBUZIONE NEL
TERRITORIO DELLA DOC PIAVE
La prima fase della sperimentazione ha previsto un capillare campionamento nelle aree di
produzione del vino Raboso Piave DOC coinvolgendo 20 aziende del territorio dai cui vigneti sono
stati prelevati un totale di 78 grappoli nel periodo di pre-vendemmia. Ogni grappolo raccolto è stato
utilizzato per avviare fermentazioni spontanee con lo scopo di isolare lieviti appartenenti al genere
Saccharomyces. Mediante metodi convenzionali (uso di specifici terreni di crescita) sono stati
raccolti 304 lieviti autoctoni, i quali sono stati successivamente sottoposti ad un indagine
19
100
101
102
104
105
106
107
108
molecolare
(Multiplex PCR, Nardi et al., 2006) che ha permesso di identificare 260 individui
110
115
appartenenti
al genere Saccharomyces. L’ulteriore caratterizzazione genetica (Querol et al., 1996,
121
127
Valero 129
et al., 2005) ha permesso di individuare 130 ceppi di Saccharomyces cerevisiae diversi. La
116
133
distribuzione
geografica dei profili genetici è stata messa in relazione alle diverse aree della DOC
143
150
Piave (fig.1).
Delle 17 località campionate, 16 hanno permesso l’isolamento di S. cerevisiae,
157
161
presentando
un numero variabile da 1 a 7 ceppi. 12 lieviti ricorrono più volte in località diverse, tra
166
167
cui due168ceppi si ripresentano in tutte e tre le macroaree di produzione in cui è stata suddivisa la
169
170
DOC (Tezze,
S. Donà di Piave, Motta di Livenza). Dei 130 profili, 118 sembrano essere tipici della
173
177 di isolamento, essendo presenti ciascuno in una località soltanto.
microarea
179
188
189
100
100
101
101
195
102
102
104
104
199
MARENO DI PIAVE
TEZZE DI PIAVE
1,17% 2,34%
0,78%
2,34%
0,78%
1,17%
1,17%
0,78%
0,78%
0,78%
0,39%
1,56%
1,17%
82,42%
197
ODERZO
1,17%
0,39%
94,53%
96,09%
1,56%
0,78%
0,39%
0,39%
MANSUE' 1,17%
0,78%
200
105
105
106
106
202
107
107
108
108
209
96,88%
SAN POLO
0,78%
0,78%
0,39%
96,88%
207
MOTTA DI LIVENZA
1,56%
212
96,09%
100
101
0,78%
102
104
110
110
115
115
105
RONCADELLE
106
213
107
0,39%0,39%
1,95%
0,39%
0,39%
0,78%
1,56%
108
110
115
121
127
214
129
116
88,28%
133
143
LORENZAGA 1,95%
150
121
121
127
127
216
129
129
116
116
219
133
133
143
143
224
150
150
157
157
227
157
0,78%
161
166
167
168
96,09%
169
170
218
173
177
179
CANDELU'
188
189
0,78%
1,95%
195
197
199
200
202
94,14%
207
209
220
212
213
214
216
0,39%
218
219
220
224
226
227
228
229
freq
226
<
rilev
at i
167
167
168
168
rilevati
179
179
188
188
CHIARANO 1,17% 1,17%
1,17%
1,17%
1,56%
90,23%
0,78%
228
229
173
173
177
177
NEGRISIA
96,09%
161
161
166
166
169
169
170
170
0, 39
rilev
at i
non
0,39%
0,78%
0,39%
0,39%
freq < 0,39
PONTE DI PIAVE
1,56%
non rilevati
1,95%
0,78%
90,23%
6
13
36
123
0,39%
0,78%
0,39%
NOVENTA 0,78%
SALGAREDA
3,13%
123
94,14%
1,17%
94,92%
0,78%
0,78%
0,78%
0,78%
0,78%
MUSILE
Profili
mtDNA
SANTA MARIA DEL PIAVE
1,56%
94,92%
189
189
195
195
1,17%
92,97%
1,95%
0,39%
1,17%
197
197
199
199
Fig. 1 Frequenza di isolamento dei singoli ceppi sul totale dei lieviti raccolti in relazione alle località campionate nel
200
Fig.200
8 Frequenza
dei profili
elettroforetici
sul totale
degli isolati
appartenenti al gruppo
sensu
in
territorio
della DOC
Piave.
Torta grande:
percentuale
di Saccharomyces;
tortaSaccharomyces
piccola: ceppi
di S.stricto
cerevisiae.
202
202
relazione
alle loalità campionate.
207
207
209
209
212
212
Ciascun
ceppo è stato ulteriormente analizzato per la valutazione dei caratteri enologici (mosto
213
213
214
214
216
sintetico
e specifici terreni di crescita, Delfini 1995, Vincenzini et al., 2005) quali: cinetica di
216
218
219
fermentazione,
vigore fermentativo, produzione di SO2 e H2S, adesività, e produzione di schiuma.
220
224
Sulla
base delle caratteristiche genetiche e fenotipiche sono stati scelti 107 ceppi di lievito,
226
226
227
successivamente
inoculati in 100 ml di mosto di uve Raboso usando come controllo due ceppi
228
229
commerciali
comunemente impiegati per la produzione di Raboso. Nel corso di queste
freq < 0,39
rilevati
“nanovinificazioni”
è stato registrato il calo in peso come prima valutazione dell’andamento
non rilevati
fermentativo in mosto naturale; successivamente ciascun fermentato è stato sottoposto a valutazione
20
olfattiva da parte di un panel di 4 giudici esperti al fine di identificare i prodotti con spiccate
caratteristiche di qualità e tipicità. Sulla base del giudizio olfattivo e delle performance di
fermentazione sono stati scelti 5 ceppi, segnalati come migliori, che sono stati testati in
fermentazioni su scala pilota e di cantina. Le caratteristiche enologiche sono riportate in Tab.1 e
Tab.2.
Ceppi
R8.3
R150.1
R150.4
R151.1
R133.5
Etanolo prodotto (%)
7
2 giorni
Fine
giorni
3,2
9,4
10,9
3,6
10,1
11,3
3,2
9,2
11,2
2,1
8,8
11,1
3,5
9,15
11,1
Durata
fermentazione
(gg)
14
14
16
15
16
Schiuma Sedimentazione Adesività
Odore
(mm)
(gg)
(mm)
4
13
10
5
4
14
9
14
10
14
2
0
0
0
1
N
N
N
N
N
Tab. 1. Caratteristiche di fermentazione dei lieviti scelti in mosto sintetico standard contenente 200g/l di glucosio a pH
3,2 (N: assenza di odori sgradevoli).
Produzione Produzione
Ceppi
H2 S
SO2
R8.3
R150.1
R150.4
R151.1
R133.5
++
++
++
+
++
++
++
++
++
++
Attività
Potere
βalcoligeno
glucosidasi
(%)
13,2
+++
14,7
++++
14,1
++++
15,4
crescita lenta
13,5
++
Tab. 2. Produzione di idrogeno solforato, anidride solforosa, capacità di
sviluppare aromi varietali (attività beta-glucosidasica) e potere alcoligeno.
Quest’ultimo è stato valutato in mosto sintetico contenente 300g/l di
glucosio. Produzione/attività: + molto limitata; ++ limitata; +++ media;
++++ elevata.
21
2.3 PRIMA PROVA DI MICROVINIFICAZIONE
I cinque ceppi prescelti (Fig.2) sono stati sottoposti a microvinificazioni di 70 l di mosto da uve
Raboso (vendemmmia 2007, 181 g/l zuccheri, 5,8 g/l acido malico, pH 3,02). Ciascun ceppo
sperimentale, così come il ceppo commerciale di controllo, è stato inoculato a partire da una coltura
liquida in modo da ottenere una concentrazione di 2-5 x 106 ufc/ml. Le analisi chimiche sono state
condotte mediante tecnica FT-IR (FOSS Wine Scan).
Durante la fermentazione alcolica è stato raccolto un campione di mosto in fermentazione per
verificare la dominanza del ceppo inoculato, che in tutti i casi è risultata superiore all’80%. Come si
può osservare in fig. 2, ad eccezione del ceppo ecotipico R8.3 tutti gli altri mostrano cinetiche
lievemente più rapide a quella del ceppo commerciale. Il ceppo R133.5 è quello che produce la
maggior quantità di glicerolo (9,4 g/l, rispetto ad un valore medio di 8,6 g/l).
Andamento Fermentazione
Alcolica
14
Attività demalicante
Acido malico g/l
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
9 10 11 12
1
2
3
4
5
6
Produzione di glicerolo
R8.3
12
R150.1
10
8
R150.4
6
R151.1
4
R133.5
2
0
0
1
2
3
4
5
7
Giorni di FA
Giorni di FA
Glicerolo g/l
Etanolo % v/v
12
6,5
6
5,5
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
6
7
8
9
10 11 12
Giorni di FA
22
controllo
commerciale
8
9 10 11 12
Fig. 2. Andamento della produzione di etanolo, del consumo di acido malico e della produzione di glicerolo durante
microvinificazioni di uve Raboso da parte di 5 ceppi provenienti dalla selezione sul territorio e del ceppo di controllo
commerciale. Dati: vendemmia 2007.
Particolarmente interessante risulta l’attività demalicante dei diversi lieviti in fermentazione: di
nuovo si distingue il ceppo R133.5 che insieme al ceppo R150.1 determina il maggior decremento
in acido malico (circa il 50%) rispetto al controllo.
I vini ottenuti sono stati sottoposti ad analisi sensoriale utilizzando un panel composto da 14 giudici
esperti (produttori e tecnici del settore) scelti dal Consorzio di Tutela. Le valutazioni sono state
effettuate in analogia alla procedura del profilo sensoriale (ISO13299), svolto in una replica per
sessione, utilizzando una scheda a punti contenente 4 descrittori di profilo (acido, amaro, dolce e
salato) 2 descrittori olfattivi (intensità di odore, intensità di aroma) e 2 descrittori edonici
(gradevolezza e tipicità), valutabili su scala graduata da 0 a 10. I descrittori olfattivi sono stati
affiancati da una lista di descrittori specifici (floreale, rosa, viola, agrumi, erbaceo, speziato, pepe,
cannella, frutta rossa, mora, lampone, ciliegia, ribes, mirtillo, prugna) per definire meglio il profilo
sensoriale dei vini e caratterizzare i descrittori edonici gradevolezza e tipicità. Ogni giudice ha
ricevuto i campioni in un piano di distribuzione bilanciato, uno dei vini è stato presentato in doppio
per verificarne il grado di affidabilità (le differenze riscontrate non sono risultate significative). I
risultati sono stati inseriti mediante lettura ottica nel software FIZZ (Biosystemes, Francia).
23
Fig. 3. Analisi delle componenti principali (PCA) dei descrittori sensoriali relative ai campioni degustati.
E’ stata applicata l’analisi delle componenti principali (Fig. 3) per correlare i vini con i descrittori
considerati. Il panel ha identificato il vino come tipico quando ha percepito aromi di frutta rossa,
ribes e ciliegia, mentre è stato identificato come non tipico il vino in cui erano evidenti sentori
erbacei, di rosa e di prugna. Ha inoltre valutato gradevole un vino d’aroma e odore intenso, non
amaro, in cui non fosse presente un forte sentore di agrumi. Sulla base dei risultati ottenuti sono
stati scelti i ceppi R133.5, caratterizzato da maggiore intensità di aroma e di odore, associati alle
note di frutta rossa, ribes, mirtillo e considerato il più gradevole ed il più tipico e il ceppo R8.3 che
pur meno tipico del precedente presenta una buona intensità di odore e olfatto e uno spiccato gusto
dolce. Il vino prodotto con il ceppo commerciale di controllo è risultato sorprendentemente molto
meno tipico, con sentori floreali e in particolare di rosa. Utilizzando l’analisi multivariata PLA
(Partial Least Squares), che permette di orientare i dati secondo 1 o più variabili, è stato possibile
valutare quali dei descrittori olfattivi e di aroma possano essere associati con quelli edonici di
gradevolezza e tipicità (considerate nell’analisi le variabili X e Y) (Fig.4).
24
Fig. 4. Analisi multivariata (PLS) per la valutazione dei descrittori gradevolezza e tipicità.
Osservando la disposizione dei descrittori e delle due variabili nel grafico si deduce che il panel ha
identificato il vino come tipico quando percepiva aromi di frutta rossa, ribes e ciliegia, mentre è
stato identificato come non tipico il vino in cui erano evidenti sentori erbacei, di rosa e di prugna.
Ha inoltre valutato gradevole un vino d’aroma e odore intenso, non amaro, in cui non fosse
presente un sentore di agrumi. Sulla base dei risultati ottenuti sono stati scelti i ceppi R133.5 e R8.3
quali lieviti più promettenti per la vinificazione di Raboso Piave.
2.4 Seconda prova di micro vinificazione
In vendemmia 2008 i due lieviti sono stati prodotti e testati nella forma secca attiva, sempre in
comparazione ad un ceppo commerciale. Sono state svolte 6 microvinificazioni da uva Raboso
Piave, di cui 3 “classiche” e 3 da uva appassita, in collaborazione con Veneto Agricoltura (sede di
Conegliano, TV); l’appassimento è stato condotto presso la Cantina sociale di Tezze (Vazzola) in
locali appositi (calo medio del 30% sul peso iniziale, Tab. 3). Tutte le vinificazioni sono state
inoculate con 2-5 x 106 cellule di lievito per ml di mosto. Sono stati eseguiti due campionamenti per
quantificare la popolazione totale di lievito e per verificare con metodi genetici (Querol et al., 1996)
la dominanza del lievito inoculato, che è risultata in tutti i 6 casi del 100%. Le analisi chimiche sono
state condotte mediante dosaggio enzimatico (EC Wine).
25
Acidità
Zuccheri
totale
(g/l)
(g/l)
pH
Acido
malico
(g/l)
Acido
tartarico
(g/l)
Microvinificazione
Raboso classico
2,91
10,5
217,3
3,8
7,0
Microvinificazione
Raboso passito
2,97
8,8
265,2
3,5
4,9
Vinificazione
Raboso Classico
2,90
9,6
223,4
4,6
4,7
Tab.3. Caratteristiche dei mosti di Raboso impiegati nella prova.
Le microvinificazioni si sono svolte in modo regolare. In relazione al consumo degli zuccheri, in
tutte le vinificazioni tutti i ceppi sono stati in grado di esaurire completamente gli esosi in modo
rapido, seppur con leggere variazioni (Fig.5).
Microvinificazione Raboso classico
g/l zuccheri riduttori
250
200
150
100
50
Microvinificazione Raboso classico
0
2
4
6
8
Giorni di fermentazione alcolica
R 8.3
CO
VRB
M
R 133.5
10
2,5
g/l zuccheri riduttori
0
12
2
1,5
1
0,5
0
7
10
Giorni di fermentazione alcolica
Fig. 5. Andamento del consumo degli zuccheri nel corso della microvinificazione del Raboso classico. Nel grafico in
piccolo gli zuccheri residui a 7 e 10 giorni.COM: ceppo commerciale.
Il ceppo R8.3 si è dimostrato estremamente rapido nella prima fase della fermentazione, quando
però non è presente un eccesso di zuccheri, come nel caso di mosto ottenuto da uva sottoposta ad
appassimento. In questa situazione tutti i ceppi hanno dimostrato un andamento molto simile.
Situazione notevolmente diversa è quella della vinificazione pilota di Raboso classico presso
26
l’azienda Cescon, dove la fermentazione si è protratta molto a lungo. All’8° giorno di
fermentazione alcolica tutte le vinificazioni presentavano ancora un tenore zuccherino compreso tra
i 70 e gli 80 g/l. Varcata la soglia dei 60 g/l residui si è assistito ad un netto rallentamento del
ceppo VRB, mentre era ancora molto intensa l’attività dei ceppi R133.5 ed R8.3. Nell’arco di due
giorni il ceppo R133.5 è stato in grado di metabolizzare circa 59 g/l di zucchero, valori molto simili
al ceppo R8.3 che invece ne ha metabolizzati quasi 51. Al quattordicesimo giorno, dunque, mentre i
ceppi R8.3 ed R133.5 portavano gli zuccheri a valori sotto i 10 g/l, il vino Raboso inoculato con il
ceppo di controllo commerciale restava ancora sopra i 45 g/l (Fig. 6). Al 17° giorno di
fermentazione alcolica le tre vinificazioni sono state svinate completamente in barrique. L’ossigeno
apportato con la svinatura ha contribuito ad una netta ripresa fermentativa del ceppo di controllo
che, probabilmente affaticato dalla concentrazione di alcol, era in una fase di arresto fermentativo.
A conferma dell’effetto positivo della svinatura appena descritto, ci sono i valori relativi alla
concentrazione degli zuccheri determinati il 22° giorno: il ceppo di controllo ha portato gli zuccheri
ad una concentrazione di 3,71 g/l, valori addirittura inferiori a quelli relativi agli altri due ceppi
(8,49 g/l R8.3, 4,85 g/l Ri133.5). Tuttavia tra il 22° e il 37° giorno, quando la concentrazione
zuccherina era ormai prossima all’esaurimento, si è assistito ad un nuovo rallentamento del ceppo di
controllo commerciale (concentrazione zuccherina finale: 1,228 g/l R8.3, 2,582 g/l R133.5 e 3,189
g/l ceppo di controllo). Pertanto, considerando i risultati ottenuti, si può concludere che il ceppo
Microvinificazione Raboso classico
commerciale è stato il meno efficiente nel portare a secco il vino in queste condizioni.
Vinificazione Raboso classico
200
150 250
g/l zuccheri riduttori
g/l zuccheri riduttori
250
200
100 150
50 100
50
0
0
0
0
25
10 4
15
6
20
8 25
10
30
35 12
Giorni
di fermentazione
alcolica
Giorni di
fermentazione
alcolica
CO
VRB
VRB
M
Vinificazione Raboso classico
g/l zuccheri riduttori
R 8.3 R8.3 R 133.5
R133.5
40
10
8
6
4
2
0
22
37
Giorni di ferm entazione alcolica
Fig. 6. Andamento del consumo degli zuccheri nel corso della vinificazione del Raboso passito (la barra rossa indica il
momento della svinatura). Nel grafico in piccolo gli zuccheri residui a 22 e 37 giorni.
27
Il risultato relativo al contenuto in acidità volatile dei vini ottenuti è sicuramente incoraggiante, in
quanto soprattutto nelle prove di microvinificazione anche in condizione di eccesso di zuccheri i
valori misurati sono del tutto comparabili a quelli ottenuti con il ceppo commerciale di controllo. I
risultati relativi alla vinificazione in cantina sono particolarmente interessanti. In questo modo
infatti è stato possibile valutare positivamente il comportamento dei tre lieviti anche considerando
una gestione della fermentazione tradizionale e con minimi interventi enologici (Tab.4).
Acido acetico (g/l)
R8.3
R133.5
COM
Microvinificazione
Raboso classico
0,09
0,16
0,12
Microvinificazione
Raboso passito
0,45
0,44
0,48
Vinificazione pilota
Raboso classico
0,55
0,44
0,48
Tab.4. Valori di acido acetico riscontrati al termine delle fermentazioni alcoliche.
In relazione alla degradazione dell’acido malico, il ceppo di controllo si rivela il migliore (Fig.7 e
Fig.8). E’ comunque doveroso sottolineare che il ceppo commerciale utilizzato viene molto usato
nelle vinificazioni di uva Raboso proprio per la sua spiccata attività demalicante. Ciononostante in
presenza di mosto ottenuto con uva passita, dove il contenuto zuccherino è più elevato, il ceppo
R133.5 rivela delle capacità anche superiori (Tab.5).
g/l acido malico
Microvinificazione Raboso classico
3,8
3,75
3,7
3,65
3,6
3,55
3,5
3,45
3,4
0
2
4
6
8
10
Giorni di fermentazione alcolica
R8.3
R133.5
VRB
CO
M
Fig. 7. Andamento del consumo dell’acido malico nella microvinificazione del Raboso classico.
28
12
Vinificazione Raboso classico
g/l acido malico
5
4,5
4
3,5
3
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Giorni di fermentazione alcolica
R8.3
R133.5
VRB
CO
M
Fig. 8. Andamento del consumo dell’acido malico nella vinificazione del Raboso classico.
R8.3 R133.5 COM
Inizio
FA
3,5
3,5
3,5
Fine FA
3,0
2,7
2,8
Tab. 5 Concentrazione dell’acido malico (g/l) nelle microvinificazioni del Raboso passito a fine fermentazione alcolica.
Al termine della fermentazione alcolica una parte dei vini ottenuti è stata sottoposta a fermentazione
malolattica guidata tramite inoculo di un ceppo di Oenococcus oeni commericiale (Lalvin VP41,
Lallemand Inc., Canada). Dall'osservazione delle cinetiche della fermentazione malolattica in tutte
le microvinificazioni in cui è stata indotta, si può osservare chiaramente che l’attività dei batteri
inoculati non ha risentito della precedente attività dei lieviti. In particolare, nella microvinificazione
di Raboso classico condotta con il ceppo Ri5 l’attività fermentativa dei batteri ha portato ai valori
più bassi di acido malico, terminando in anticipo la fermentazione malolattica (Fig. 9).
29
Fermentazione Malolattica
4
R8.3
Acido malico g/l
3,5
3
2,5
R133.5
2
1,5
1
controllo
commerciale
0,5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Giorni di FA
Fig. 9 Andamento della fermentazione malolattica nella microvinificazione di Raboso classico (vendemmia 2008).
Nella vinificazione di Raboso passito l’attività fermentativa dei batteri lattici è stata simile in tutte
le microvinificazioni.
I vini ottenuti sono stati sottoposti ad analisi sensoriale (scheda e metodiche descritte in precedenza)
da parte di un panel di 9 giudici esperti segnalati dal Consorzio di Tutela, e ad analisi gascromatografica per la determinazione dei principali aromi di fermentazione e varietali (Oretga et al.,
2001).
30
Fig. 10 Analisi delle componenti principali (PCA) dei descrittori sensoriali e dei composti aromatici
relativi ai vini degustati (la lettera P indica i vini passiti).
I dati ottenuti dalle due valutazioni, sensoriale e gas-cromatografica, sono stati analizzati in maniera
integrata utilizzando l’analisi delle componenti principali (fig. 10). Il risultato più evidente riguarda
i descrittori edonici che vengono chiaramente associati al vino Raboso vinificato con i ceppi
ecotipici, mentre il ceppo di controllo esce significativamente dal raggruppamento precedente e
viene correlato con l’elevata concentrazione di fenilacetato (odore di rosa), che rientra nella
percezione floreale condivisa con i vini passiti. In relazione a questi ultimi è interessante notare
come le differenze tra i campioni siano meno evidenti e come nessuno dei tre venga riconosciuto
come tipico, probabilmente perché questa tipologia di prodotto è più recente e meno ancorata alla
tradizione. Infine dall’analisi statistica di ciascuna singola categoria considerata, sia sensoriale che
chimica, si osserva chiaramente che il vino prodotto con il ceppo R133.5 ha una concentrazione
significativamente più elevata di esteri (aromi di fermentazione) ed è quello che ha l’intensità di
aroma maggiore, mentre il campione dotato di maggiore intensità di odore è quello ottenuto con il
ceppo di controllo, determinata però dalla elevata quantità di fenilacetato che allontana il vino dalle
caratteristiche di tipicità.
31
2.5 CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE
Il capillare campionamento condotto nei vigneti della DOC Piave ha permesso di ottenere una
mappatura dei ceppi enologici di S. cerevisiae associati alla varietà Raboso Piave, rivelando un
grado di biodiversità estremamente elevato. Ciascuna area campionata, infatti, è dotata di ceppi
autoctoni, che indicano la presenza di una forte tipicità territoriale. E’ stato perciò possibile
scegliere lieviti con caratteristiche enologiche spiccate, da poter essere utilizzati quali nuovi starter
per la vinificazione del vino Raboso. In particolare, è stato identificato il ceppo R133.5 come il
lievito che maggiormente esalta le qualità del vino Raboso enfatizzando profumi di frutta rossa,
ribes e ciliegia, apportando intensità di aroma e gusto non amaro, nel pieno rispetto delle
caratteristiche tradizionali di questo prodotto. R133.5 è un ceppo con ottime caratteristiche
fermentative, a bassa produzione di acidità volatile e dotato di buona attività demalicante, mostrata
soprattutto in mosti contenenti alte quantità di acido malico o nelle fermentazioni di vino passito.
Infine, tra i ceppi saggiati, è quello che mostra una migliore sinergia con i batteri malolattici,
permettendo una rapida chiusura di questo processo fermentativo.
2.6 RINGRAZIAMENTI
Gli autori del lavoro ringraziano per il supporto finanziario la Provincia di Treviso e la Regione
Veneto. Inoltre ringraziano Stefano Soligo ed Emanuele Serafin (Centro Regionale per la
Viticoltura, l'Enologia e la Grappa, Veneto Agricoltura, Conegliano) per l'esecuzione delle micro
vinificazioni, Antonio Bonotto e Giorgio Cecchetto (Consorzio di Tutela Vini del Piave) per il
supporto tecnico e Giuseppe Cescon per aver fornito l’uva per le microvinificazioni.
BIBLIOGRAFIA
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acidità: il Raboso, Vignevini, 32, 10, 95-99.
Delfini C. (1995) Scienza e tecnica di microbiologia enologica. Edizioni Il Lievito, Asti.
ISO (2003) ISO 13299, Sensory analysis – Methodology, General guidance for establishing a sensory
profile,International Organization for Standardization.
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sensu stricto strains from other yeast species in an enological environment. FEMS microbiology letters 264: 168–173
32
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validation of a new method based on gas chromatographic–flame ionisation detection analysis of dichloromethane
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Querol A., Ramon D. (1996) The application of molecular techniques in wine microbiology. Trends in Food Science &
Technology 7: 73-78.
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yeast in the vineyard: A large-scale, three-years study. FEMS Yeast Research 5: 959-969.
Vincenzini M., Romano P. e Farris G.A. (2005) Microbiologia del vino. Edizioni Ambrosiana, Milano.
33
3. I funghi fitopatogeni: un mezzo da sfruttare per la STABILIZZAZIONE
proteica DEI VINI BIANCHI.
A. Curioni , M. Lucchetta e S. Vincenzi
Le proteine rappresentano un vasto gruppo di macromolecole, che presentano strutture complesse e
differenziate e svolgono una gamma assai vasta di funzioni negli organismi viventi. Nei vini, le
proteine influenzano le caratteristiche organolettiche e, soprattutto, la stabilità, in particolare dei
vini bianchi, dove possono provocare, dopo l’imbottigliamento, torbidità o depositi.
Le proteine presenti nei vini derivano in gran parte dall’uva ed in una certa percentuale anche dai
microrganismi ed in particolare dal lievito (Marchal et al., 1996). Tuttavia, le proteine del vino non
corrispondono esattamente a quelle dell’uva. Infatti, durante la fermentazione queste ultime vanno
incontro a processi di degradazione e di denaturazione ad opera delle proteasi e delle condizioni
particolarmente difficili che si riscontrano dopo la pigiatura e durante la vinificazione (Luguera et
al., 1998). Le proteine che rimangono nel vino sono, quindi, quelle più stabili, ma che
paradossalmente possono provocare instabilità nel medio-lungo periodo.
La maggioranza delle proteine solubili nel succo d’uva sono state identificate come proteine
coinvolte nella difesa della vite da attacchi di parassiti/patogeni (proteine PR), in particolare
chitinasi e proteine Taumatina-simili (TLP) (Waters et al., 1996).
Il vino è un sistema colloidale, nel quale i colloidi sono rappresentati da proteine e polisaccaridi
come anche da aggregati proteine-polifenoli e proteine-polisaccaridi. Una delle caratteristiche
principali dei sistemi colloidali risiede nelle dimensioni delle particelle che sono grandi rispetto alle
dimensioni delle comuni molecole in soluzione vera, mentre sono piccole rispetto alle particelle di
una sospensione, nelle quali però i colloidi possono trasformarsi, aggregandosi tra loro per svariati
motivi, fino a diventare visibili ad occhio nudo (formazione di torbidità). Infatti i colloidi vengono
mantenuti dispersi nella massa liquida da un insieme di forze che ne prevengono l’aggregazione e la
flocculazione. Molti altri fattori però hanno influenza sulla stabilità delle soluzioni colloidali come
la natura chimica delle particelle, forze di attrazione e repulsione tra le particelle colloidali, la
presenza di elettroliti nel mezzo, ecc. Questi fattori sono tanti e così interdipendenti l'uno dall'altro,
che oggi non è ancora possibile dare una teoria completa e soddisfacente della stabilità di un
colloide. A maggior ragione questo è vero anche per un sistema complesso come il vino, dove le
particelle colloidali hanno una natura assai disomogenea. Di conseguenza, nonostante le numerose
ricerche eseguite per cercare di chiarire il fenomeno dell’intorbidamento proteico dei vini bianchi, si
sa ancora relativamente poco riguardo i meccanismi ed i fattori coinvolti nella precipitazione
colloidale delle proteine che provoca la formazione di torbidità in bottiglia.
34
In ogni caso il problema viene risolto praticamente rimuovendo le proteine dal vino tramite
trattamenti con bentonite, una argilla montmorillonitica con forti capacità adsorbenti.
L’adsorbimento da parte della bentonite non è però specifico per le proteine e risulta anche nella
rimozione di altri composti importanti per la qualità del vino, come per esempio gli aromi (Lambri
et al., 2010). Inoltre, la bentonite esausta va smaltita ed il suo uso comporta anche una certa perdita
di prodotto, che rimane intrappolato nel residuo precipitato che si ottiene dopo il trattamento. Negli
ultimi anni si assiste ad un aumento dell’instabilità proteica dei vini bianchi, le cui ragioni non sono
note, che si traduce nella necessità di ricorrere a trattamenti di stabilizzazione sempre più drastici.
Per tutte queste ragioni è necessario cercare e mettere a punto trattamenti di stabilizzazione
alternativi alla bentonite, che possano sostituirla nel processo di produzione dei vini bianchi.
Nella presente ricerca si è cercato di dare un contributo allo sviluppo di metodi alternativi per la
stabilizzazione proteica dei vini bianchi, partendo dall’idea che le proteine instabili dei vini,
essendo proteine di difesa dell’uva, debbano in qualche modo essere “neutralizzate”, cioè rimosse o
degradate, da parte di qualche meccanismo proprio dei funghi fitopatogeni che a queste proteine
devono sopravvivere per infettare e svilupparsi nei tessuti vegetali. Sono quindi stati testati alcune
specie di funghi fitopatogeni per verificare il loro effetto sulla rimozione delle proteine dell’uva
presenti nei mosti e nei vini. I principali risultati con potenzialità applicative sono descritti di
seguito.
3.1 UN ENZIMA PROTEOLITICO FUNGINO PER LA STABILIZZAZIONE
DEI VINI BIANCHI
Diversi ricercatori, già da anni, hanno tentato l’approccio di ridurre l’instabilità potenziale dei vini
bianchi utilizzando enzimi in grado di degradare le proteine dell’uva, utilizzando quindi l’approccio
più semplice, specifico e che richiede condizioni poco aggressive per il prodotto (Pocock et al.,
2003). Purtroppo però, a causa della loro intrinseca resistenza strutturale, queste proteine PR, oltre a
resistere alle condizioni di fermentazione, sono anche particolarmente difficili da idrolizzare da
parte degli enzimi proteolitici e tutti i tentativi fatti fino ad ora per stabilizzare i vini bianchi
utilizzando proteasi commerciali sono falliti.
Uno screening su diversi funghi fitopatogeni della frutta in grado di crescere in ambiente acido, ha
indicato che il fungo Sclerotinia minor è in grado di rilasciare nel mezzo di coltura un enzima
capace di degradare le proteine responsabili dei fenomeni di instabilità dei vini bianchi. Questo
proprio perché il fungo, per potersi sviluppare sulla frutta, deve necessariamente degradare i fattori
con cui la pianta si difende, cioè le proteine PR.
35
La sperimentazione è iniziata testando la capacità proteolitica del brodo colturale di S. minor. Il
fungo, dopo crescita in presenza di proteine purificate dall’uva come unica fonte azotata, produce
enzimi proteolitici esocellulari. I primi test si sono svolti aggiungendo a mosti di Manzoni bianco il
brodo colturale di S. minor, dializzato e concentrato. I mosti trattati sono stati sottoposti a
fermentazione ed i vini ottenuti analizzati per la presenza di proteine e per la loro stabilità. In effetti,
il brodo colturale di S. minor era in grado di diminuire l’instabilità proteica dei vini bianchi del 3050% (fig. 1).
Stabilità proteica
0,045
culturale di S. minor. Il controllo è stato ottenuto
0,040
Torbidità netta A540
Figura 1. Instabilità proteica dei vini trattati con il brodo
0,035
aggiungendo la stessa quantità di brodo colturale ma
0,030
precedentemente bollito per inattivare l’enzima.
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
Controllo
Brodo S. m inor
Successivamente l’enzima è stato parzialmente purificato dal brodo di coltura e si sono condotte
fermentazioni, con mosto di uva Manzoni bianco e Glera, aggiungendo differenti quantità (da 0,001
a 0,00025 U di attività) del preparato proteolitico, comparandone l’effetto con quello di un enzima
proteolitico commerciale (pepsina). I vini ottenuti sono stati sottoposti a test a caldo (heat-test) per
valutarne l’instabilità proteica dimostrando che i mosti trattati con il preparato enzimatico sono
risultati meno instabili (fig. 2). Solamente al dosaggio di impiego più elevato si è osservata una
instabilità maggiore di quella del controllo, molto probabilmente dovuta alla aggiunta di una
eccessiva quantità di proteina, derivante dalla preparazione enzimatica stessa (circa 10 mg/L). Al
contrario, a dosi minori, l’enzima ha provocato una riduzione dell’instabilità proteica pari circa al
40%.
36
Instabilità proteica
Figura 2. Instabilità proteica dei vini trattati con
0,06
diverse quantità di enzima purificato da brodo culturale
0,05
di S. minor e di pepsina. I campioni sono scaldati ad 80
Torbidità
A540
0,04
°C per 2 ore e quindi raffreddati in ghiaccio per due
0,03
0,02
ore.
0,01
spettrofotometricamente e confrontata con quella dei
Enz 0,0005 U
Enz 0,00025 U Pe psina 0,001 U
torbidità
sviluppata
è
misurata
campioni prima del riscaldamento. Se la differenza tra
0
Enz 0,001 U
La
C ontro llo
le due letture è inferiore a 0,02 il vino può essere
definito stabile.
L’analisi elettroforetica (fig. 3) ha mostrato una diminuzione delle proteine dell’uva nei campioni
trattati con il preparato enzimatico da S. minor, rispetto ai campioni trattati con pepsina ed al
controllo. La diminuzione è stata osservata soprattutto a livello della zona delle TLP (intorno a 21
kDa) e della banda intorno 66 kDa, corrispondente all’invertasi d’uva. Nei campioni trattati con il
preparato enzimatico è comparsa, intorno ai 35 kDa, una banda che rappresenta la principale
isoforma delle proteasi aggiunte.
Figura 3. Analisi elettroforetica (SDS-PAGE) delle proteine
dei vini trattati con proteasi da S. minor (Prep. Enz.) a 3
concentrazioni, con pepsina (pepsina) e non trattati (control).
Colorazione con blu Coomassie. I campioni sono stati
preparati precipitando 150 µL di vino
con 4 volumi di
etanolo.
Prove preliminari hanno dimostrato la possibilità di produrre elevate quantità di questo enzima
utilizzando il brodo di coltura del il fungo S. minor ad un costo relativamente basso.
In conclusione, questi risultati principali indicano che è possibile utilizzare preparazioni
proteolitiche da S. minor per degradare le proteine instabili dei vini bianchi, aprendo la strada ad
una nuova strategia di stabilizzazione, semplice, probabilmente economica e molto specifica che
evita interventi drastici non rimuovendo alcuna sostanza dal vino e mantenendone l’integrità. Resta
comunque da chiarire quali siano i fattori che influiscono sulle prestazioni della preparazione
enzimatica utilizzata, che non sempre ha agito dando gli stessi effetti. Questo aspetto rende
necessarie ulteriori ricerche finalizzate ad ottenere preparati standardizzati da utilizzare nella pratica
enologica.
37
3.2 UN POLISACCARIDE FUNGINO CHE RIMUOVE LE PROTEINE
INSTABILI
Un altro fungo fitopatogeno che si sviluppa sulla frutta che ha mostrato di essere in grado di
eliminare le proteine PR instabili quando fatto crescere su un mezzo contenente solo proteine
dell’uva è Sclerotium rolfsii. Si è potuto dimostrare che, in questo caso, il meccanismo che provoca
tale effetto è basato sull’emissione, da parte del fungo, di un polisaccaride esocellulare, lo
scleroglucano, in grado di adsorbire le proteine. In questo modo il fungo dovrebbe difendersi
dall’azione tossica di queste ultime, senza degradarle, ma sequestandole dal mezzo di crescita. Lo
scleroglucano è un polisaccaride che può essere reperito commercialmente e che non è mai stato
testato prima per i suoi effetti sulle proteine del vino.
L’aggiunta di scleroglucano su un vino Manzoni Bianco non trattato con bentonite, a concentrazioni
comprese tra 0,1 e 10 mg/mL è risultata nella diminuzione evidente del contenuto proteico del vino
fino ad arrivare ad una riduzione dell’80% rispetto al contenuto iniziale (fig. 4), il che indica che
questo polisaccaride è in grado di rimuovere in modo assai efficace le proteine del vino, influendo
assai poco sul contenuto in polifenoli (fig. 5).
Contenuto proteico (mg/L)
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
Scleroglucano (mg/mL)
Figura 4. Effetto dell’aggiunta di scleroglucano
Figura 5. Effetto dell’aggiunta di scleroglucano sul
(a diverse concentrazioni) sul contenuto proteico
contenuto in polifenoli totali di un vino Incrocio
di un vino Incrocio Manzoni Bianco.
Manzoni Bianco.
Si è però evidenziato, a seguito del trattamento, un aumento dei polisaccaridi in soluzione nel vino
all'aumentare della dose di scleroglucano aggiunto fino a partire da 2 mg/mL (fig. 6).
Figura 6. Effetto della concentrazione di
scleroglucano sul contenuto in polisaccaridi di
un vino Incrocio Manzoni Bianco.
38
Questo indica che lo scleroglucano è solubile nel vino, dove permane in soluzione, il che
rappresenta un notevole problema per la applicazione pratica di questa tecnica di stabilizzazione.
Per verificare se fosse possibile risolvere il problema si è cercato di capire meglio quale fosse il
meccanismo di interazione dello scleroglucano con le proteine del vino. Appurato che il
polisaccaride conserva la sua carica neutra anche al pH del vino, escludendo così la possibilità di
una interazione ionica con le proteine, esperimenti condotti in condizioni standardizzate, utilizzando
una proteina modello (BSA) hanno dimostrato che la concentrazione dello scleroglucano influisce
fortemente sul contenuto proteico, mentre non ha nessun effetto il tempo di contatto. In effetti, già
dopo 10 minuti si ha un assorbimento totale della proteina utilizzando pochi grammi / litro di
polisaccaride (fig. 7). I risultati della quantificazione dei polisaccaridi solubili confermano però un
aumento della quantità di polisaccaride rilasciato nel mezzo, aumento influenzato sia dalla dose di
scleroglucano aggiunto che dal tempo di incubazione (fig. 8).
Figura 7. Effetto della dose di scleroglucano
Figura 8. Polisaccaridi totali residui in un vino
(0.1, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 mg/mL) e del tempo di
modello (contenente 300 mg/mL di BSA) trattato
contatto (10-30-60-120 min) sul contenuto
con dosi diverse di scleroglucano per diversi
proteico residuo di un vino modello preparato
tempi d’incubazione (10-30-60-120 min).
mediante aggiunta di 300 mg/L di BSA.
39
Per studiare l’effetto delle caratteristiche del solvente sull’azione di rimozione delle proteine, lo
scleroglucano è stato incubato a differenti concentrazioni per 30 minuti in 4 mezzi contenenti 300
mg/L di proteina considerando acqua, acido tartarico a pH 3,2, etanolo al 12% e soluzione di vino
modello (fig. 9).
In acqua ed etanolo l’interazione scleroglucano-proteina risultava decisamente inferiore rispetto a
quella osservata in soluzione acida. È interessante notare come la più intensa interazione si sia
verificata in vino modello, suggerendo un effetto sinergico del pH e dell’etanolo, probabilmente
riconducibile alla migliore idratazione del polisaccaride in presenza di piccole quantità di alcol.
Si è voluto infine studiare l’effetto dello scleroglucano (5 mg/mL, 30 minuti d’incubazione) sulla
rimozione della proteina in presenza di tutte le componenti non macromolecolari presenti nel vino,
inclusi i polifenoli. Si sono utilizzati: I) un vino ultrafiltrato a 3 kDa (quindi senza macromolecole),
II) un vino modello (entrambi contenenti 300 mg/L di proteina e III) un vino Manzoni Bianco tal
quale (fig. 10).
Figura 9. Effetto dell’aggiunta di scleroglucano a
Figura 10. Confronto tra vino ultrafiltrato
diverse dosi sul contenuto di proteina in diversi
contenente 300 mg/L di BSA, vino Manzoni
solventi: acqua, acido tartarico (5 g/L, pH 3,2),
Bianco e vino modello contenente 300 mg/L di
etanolo (12%) e soluzione di vino modello (12 %
BSA dopo trattamento con 5 mg/mL di
etanolo, 5 g/L acido tartarico, pH 3.2).
scleroglucano per 30 minuti.
I risultati hanno evidenziato che la sottrazione di proteine è completa in vino modello, mentre in
presenza nel vino reale e nel vino ultrafiltrato la rimozione non è totale, raggiungendo però circa il
65%, probabilmente per la presenza di polifenoli.
Da questi dati si può ipotizzare che sia la composizione del mezzo a determinare l'intensità
dell'interazione, indipendentemente dalla natura della proteina utilizzata.
40
L'analisi elettroforetica delle proteine di un vino bianco (fig. 11) ha confermato i risultati ottenuti in
precedenza, indicando una interazione particolarmente forte con la proteina a 44 kDa, ma
diminuendo anche l’intensità delle altre bande. I grossi polimeri incastrati nella parte alta del gel,
probabilmente grosse mannoproteine, non sembrano subire sostanziali diminuzioni.
Per valutare infine l’effettiva efficacia dello scleroglucano nella stabilizzazione del vino, campioni
di vino Manzoni bianco trattati con dosi crescenti di scleroglucano sono stati sottoposti a heat-test
NTU (nephelometric turbidity units)
per indurre la precipitazione delle proteine (fig. 12).
120
100
80
Overnight
60
3h
40
20
0
0
1
2
3
4
5
Sclg (mg/ml)
Figura 11.SDS-PAGE (T=14%). Delle
Figura 12. Prove di stabilità a concentrazioni crescenti
proteine di vino I. M. Bianco non trattato
di scleroglucano (0.1-4.0 mg/ml) in Manzoni bianco.
(Vino TQ); trattato con 2 e 5 mg/mL di
Tempo di incubazione 3 e 24 ore (overnight).
scleroglucano;
Colorazione
con
Coomassie.
La torbidità iniziale del vino è molto alta (80 NTU) confermando l’elevata instabilità proteica di
questa varietà. A basse dosi di polisaccaride aggiunto la torbidità aumenta nonostante la netta
diminuzione del contenuto proteico. Questo effetto è probabilmente da imputare al rilascio di
molecole solubili da parte dello scleroglucano. Con quantità maggiori di polisaccaride è stata
osservata invece una diminuzione della torbidità indotta, ma non si è comunque raggiunta la
stabilità del vino nemmeno alle dosi più alte.
In conclusione, questo studio preliminare ha messo in evidenza caratteristiche di notevole interesse
per una applicazione futura dello scleroglucano nella rimozione delle proteine dal vino, anche se,
per arrivare ad un suo utilizzo, sarà necessario risolvere l’inconveniente della sua solubilità
utilizzando modificazioni chimiche, come per esempio la immobilizzazione o la reticolazione del
41
polisaccaride, in grado di rendere tale polimero completamente insolubile nel vino da stabilizzare.
Tali esperimenti sono tuttora in corso.
3.3 CONCLUSIONI
La instabilità proteica dei vini bianchi che, negli ultimi anni, sembra diventare un problema sempre
più scottante, necessita di trovare metodi alternativi all’uso della bentonite, che, da più parti, viene
ritenuto un sistema che porta con sé molti svantaggi.
In questo progetto di ricerca si sono tentati due approcci alternativi per la soluzione del problema
dell’instabilità proteica dei vini bianchi, entrambi basati sullo sfruttamento di funghi fitopatogeni. Il
primo è basato sulla degradazione proteolitica specifica delle proteine responsabili della instabilità,
le proteine di difesa dell’uva che si ritrovano nel vino, sfruttando la capacità di un enzima
proteolitico, ricavato da un fungo che sopravvive in presenza di proteine di difesa, di agire
specificatamente su di esse. Questo approccio è particolarmente promettente perché permetterebbe,
una volta sviluppata la tecnica, di alterare in maniera minima la composizione del vino,
mantenendone le specifiche caratteristiche. Chiaramente questo necessita di soddisfare sia i requisiti
di standardizzazione dei preparati enzimatici, sia di ottenere l’autorizzazione all’uso di derivati di
questa specifica specie fungina, che non appartiene al novero di quelle autorizzate per l’uso in
enologia.
Il secondo approccio invece si basa sulle singolari proprietà di un polisaccaride naturale, lo
scleroglucano, certamente non tossico, che ha dimostrato una sorprendente capacità di interrazione
con le proteine. Tuttavia in questo caso andrebbe risolto il problema della sua solubilità nel mezzo,
che al momento sembra essere il maggiore ostacolo per una utilizzazione pratica.
BIBLIOGRAFIA
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Effect of bentonite fining on Odor-Active compounds in two different white wine styles
Am. J. Enol. Vitic. 61: 225-233.
Luguera, C., Moreno-Arribas, V., Pueyo, E., Bartolomé, B. and Polo, M. C. (1998)
Fractionation and partial characterization of protein fractions present at different stages of the production of sparkling
wines
Food Chem. 63: 465-471.
Marchal, R., Bouquelet, S., Maujean, A. (1996).
Purification and partial biochemical characterization of glycoproteins in a champenois Chardonnay wine.
42
J. Agric. Food Chem., 44: 1716-1722.
Pocock, K. F., HØj, P. B., Adams, K. S., Kwiatkowski, M. J. and Waters, E. J. (2003)
Combined heat and proteolytic enzyme treatment of white wines reduces haze forming protein content without
detrimental effect
Austr. J. Grape Wine Res. 9: 56-63.
Waters, E. J., Shirley, N.J., Williams, P.J. (1996)
Nuisance proteins of wine are grape pathogenesis related proteins
J. Agric. Food Chem. 44: 3-5.
43
4. Pre-Competitive
1. Caratterizzazione varietale di cultivar di Vitis vinifera L. mediante DNA
barcoding di regioni cloroplastiche e genotyping di geni nucleari singola copia
di Nicolè S., Barcaccia G., Lucchin M.
Il miglioramento genetico a cui è stata sottoposta la vite europea (Vitis vinifera L.), attraverso la
selezione naturale e umana, ha permesso la diffusione di migliaia di varietà difficilmente
distinguibili tra loro imponendo perciò l’adozione di validi strumenti investigativi utili ai fini
dell’identificazione varietale (Bessis, 2007). Tale caratterizzazione è dettata sia dal bisogno di
salvaguardare la biodiversità presente nella specie, tutelando le varietà locali da possibile erosione
genetica e risolvendo numerosi casi di ambiguità nella nomenclatura dovuti a omonimie e
sinonimie, sia per garantire l’autenticità e la tracciabilità delle cultivar di vite e dei loro derivati
commerciali. Il riconoscimento delle varietà di vite un tempo si basava esclusivamente sulla
valutazione di tratti ampelografici e ampelometrici, ma l’alta adattabilità e plasticità della specie a
differenti condizioni ambientali è stata ed è tuttora fonte di equivoci. Nuovi approcci basati
sull’impiego di marcatori molecolari, non influenzati dal fenotipo e dall’interazione con l’ambiente,
sono stati sviluppati e possono essere applicati per l’identificazione varietale a frammenti di tessuto
vegetale (This et al. 2004) e talvolta a derivati alimentari, come il mosto e il vino, a cui l’analisi
morfologica è chiaramente non applicabile (Garcia-Beneytez et al. 2002).
Lo scopo di questo studio è quindi lo sviluppo di una metodologia genomica per la caratterizzazione
molecolare delle cultivar di vite, attraverso un approccio di DNA barcoding di regioni
cloroplastiche e di genotyping di regioni nucleari singola copia. Il materiale vegetale oggetto di
studio è rappresentato da una selezione di differenti vitigni locali, nazionali e internazionali, scelti
questi ultimi tra le cultivar maggiormente diffuse a livello europeo, con destinazione finale
prevalentemente vinicola e, in limitati casi, per la produzione di uva passa (o sultanina) e da tavola.
Sono stati perciò campionati 164 genotipi di vite, tra cui 146 differenti cultivar di V. vinifera, 5
specie selvatiche (V. riparia, V. rupestris, V. berlandieri, V. cinerea e V. labrusca) e 3 ibridi
interspecifici (Tabella 1 e 2).
44
Come metodologia è stato testato inizialmente l’approccio chiamato DNA barcoding, proposto dalla
comunità scientifica come un metodo accurato e automatizzabile per l’identificazione genetica di
specie attraverso il sequenziamento di regioni standard non codificanti (introni e spaziatori
intergenici) del DNA plastidiale, usate come marcatori molecolari (Hebert et al., 2003). In questo
contesto ci siamo focalizzati principalmente sulla possibilità di applicare questa tecnica a livello
intraspecifico. A tale scopo si è proceduto con l’analisi della variazione nucleotidica in sequenze
target di DNA cloroplastico con l’intento di ricercare polimorfismi di tipo SNP (Single Nucleotide
Polymorphism) e In/Del (Insertion/Deletion) e di definire degli aplotipi adatti alla caratterizzazione
di singole varietà. Successivamente abbiamo saggiato l’alternativa di usare regioni nucleari singola
copia al fine di genotipizzare le cultivar. Più in dettaglio l’approccio sperimentale è consistito di
quattro fasi principali:
-
estrazione e purificazione del materiale genetico dal tessuto di giovani foglie;
-
caratterizzazione molecolare dei campioni di DNA mediante amplificazione (PCR) e
sequenziamento di sequenze singola copia sia di origine cloroplastica che nucleare;
-
analisi bioinformatica dei dati che prevede l’ispezione visiva dei cromatogrammi ottenuti,
l’analisi della struttura aplotipica (nel caso delle regioni cloroplastiche) e genotipica (per le
regioni nucleari) dei vitigni certificati campionati, nazionali ed internazionali, sulla base
della composizione nucleotidica e dei polimorfismi rintracciati a carico di ciascun gene
esaminato, e successiva analisi filogenetica.
-
verifica dell’efficacia della tecnica utilizzando cultivar locali come caso di studio al fine di
chiarire le relazioni filogenetiche tra le stesse cultivar locali e quelle certificate, usate come
standard di riferimento, e risolvere eventuali situazioni di omonimia e sinonimia.
1.1 INDIVIDUAZIONE E FREQUENZA DEGLI SNP NELLE SEQUENZE
TARGET
Un’analisi preliminare, condotta amplificando 6 regioni cloroplastiche (l’introne rps16 e
gli
spaziatori intergenici trnH-psbA, rpl32-trnL, trnT-trnL, trnL-trnF e atpB-rbcL) conosciute per
essere particolarmente utili ai fini del barcoding tra specie, ci ha consentito di saggiare la variabilità
nucleotidica a carico del DNA cloroplastico (Tabella 3). A differenza di precedenti studi che
avevano dimostrato l’efficacia dell’impiego del genoma cloroplastico per l’identificazione di specie
e varietà vegetali (Kress and Erickson, 2007; Nicolè et al., 2011), il nostro studio ha messo in
evidenza per la specie V. vinifera uno scarso livello di polimorfismi sia a livello inter che
45
intraspecifico. Sulla base di questi dati si è perciò deciso di analizzare la variabilità di alcune
regioni target nucleari per verificare se questo genoma potesse risultare più informativo per i nostri
obiettivi. Abbiamo selezionato cinque regioni codificanti singola copia (due EST, ID04 e IIC08, e
tre regioni geniche, GAI, ATP e UFGT) (Tabella 3).
Combinando le singole sequenze abbiamo ottenuto una sequenza unica, lunga 3317 nucleotidi, che
conteggiava 107 e 96 posizioni polimorfiche rispettivamente tra le sei specie di Vitis e all’interno
della specie V. vinifera (Tabella 2).
L’analisi della struttura della popolazione è stata condotta attraverso il software STRUCTURE che
assegna probabilisticamente singoli genotipi, pre-definiti sulla base della loro origine geografica, a
sottogruppi dedotti in funzione della distribuzione degli alleli. I risultati hanno messo in evidenza
che la nostra collezione di germoplasma è probabilmente composta da tre sottogruppi
geneticamente distinguibili che coincidono rispettivamente con (a) le specie selvatiche non-vinifera
e gli ibridi, (b) le cultivar dell’Europa Occidentale, italiane e portoghesi, e (c) le accessioni
dell’Europa Orientale, rumene e greche, mentre le cultivar spagnole sono distribuite in modo quasi
omogeneo tra i due pool. E’ stata osservata un’elevata omogeneità genetica all’interno di ogni
gruppo, con solo poche accessioni che hanno manifestato un’origine mista, cioè con un’ampia
proporzione di patrimonio genetico condiviso con gli altri gruppi (Figura 1). I genotipi
maggiormente differenziati si identificano con le specie selvatiche e le cultivar rumene, con una
probabilità del 93 e 85% di appartenenza degli individui ai rispettivi gruppi (Figura 1).
1.2 COSTRUZIONE DI APLOTIPI E GENOTIPI CULTIVAR SPECIFICI
L’albero filogenetico costruito mediante il metodo del Neighbour-Joining per visualizzare le
relazioni esistenti tra le accessioni indagate ha messo in evidenza le limitazioni applicative
dell’approccio fenetico classico basato sul calcolo della diversità genetica in funzione dei
polimorfismi di sequenza. L’albero infatti ha permesso di separare le accessioni corrispondenti alle
diverse specie con valori di affidabilità dei singoli nodi maggiori del 75%, mentre i bracci
dell’albero corrispondenti alle singole varietà di V. vinifera erano debolmente supportati. Si è
quindi deciso di utilizzare un nuovo approccio che, invece di convertire i polimorfismi di sequenza
in distanze genetiche, conserva l’informazione nucleotidica sullo stato del carattere per costruire
una matrice aplotipica e genotipica (Sarkar et al., 2002). A differenza del genoma cloroplastico,
scarsamente informativo e perciò scartato, il genoma nucleare, sulla base dei numerosi polimorfismi
di sequenza rintracciati, ha permesso di definire una specifica composizione genotipica per quasi
tutte le cultivar di vite. In questo caso parliamo di genotipo piuttosto che aplotipo in quanto,
46
attraverso l’impiego del genoma nucleare e del diretto sequenziamento delle regioni amplificate,
non è stato possibile separare i due alleli di ciascuna regione, ma questi sono stati combinati e, in
presenza di una posizione eterozigote, si è provveduto ad adottare la nomenclatura prevista dal
codice IUPAC. Il gene marcatore maggiormente informativo è risultato UFGT che da solo è stato
capace di ricostruire 92 genotipi con un numero di cultivar per ciascun genotipo compreso tra 1 e
15, seguito dagli altri geni che singolarmente hanno permesso di individuare al massimo una
trentina di genotipi che presentavano quindi un numero di accessioni maggiore (Tabella 4).
Considerando le cinque sequenze nucleari combinate, i polimorfismi rintracciati hanno permesso di
definire 126 genotipi cultivar specifici, di cui due erano attribuibili agli ibridi interspecifici Bianca e
Perla. La loro composizione nucleotidica è infatti congruente con un’origine derivante da due
diversi eventi di ibridazione interspecifica. Solo pochi genotipi hanno raggruppato più cultivar
contemporaneamente, spesso strettamente imparentate, come nel caso dei Pinot (un unico genotipo
per Pinot Noir, Pinot Blanc e Pinot Gris), delle Regina (due cultivar italiane sono risultate
geneticamente indistinguibile dalla Razaki di origine greca) o del Moscato (Moscato Bianco e
Moscato Giallo geneticamente identici), mentre in un solo caso sono state riunite due cultivar non
imparentate, Fiano e Petit Verdot. Per le cultivar di cui si disponeva di più cloni, come ad esempio
Sultanina, Carmenere, Malbech, Merlot, Pinot Noir e Sagrantino, questi sono sempre risultati, come
atteso, tra loro identici geneticamente.
1.3 CASO DI STUDIO: LE CULTIVAR LOCALI
Una volta stabilita una matrice di genotipi diagnostici sulla base delle cultivar internazionali usate
come standard di riferimento, un campionamento aggiuntivo di cultivar locali tipiche del Nord-Est
d’Italia è stato incluso nell’analisi con l’obiettivo di chiarire l’identità genetica delle accessioni, e
potenzialmente risolvere eventuali situazioni di sinonimie e omonimie o illustrare eventuali rapporti
di parentela tra le cultivar. Delle 23 cultivar locali impiegate, solo 5 sono registrate nel Catalogo
Italiano delle Varietà Coltivate, Pignola, Marzemina Bianca, Marzemina Nera, Raboso Piave e
Raboso Veronese, mentre le altre hanno una diffusione limitata al territorio del Veneto e pertanto
sono strettamente adattate alle condizioni pedo-climatiche della regione. L’analisi basata
sull’approccio di genotyping delle regioni nucleari ha permesso di ricostruire genotipi specifici
solamente per 11 cultivar locali, come Schiavetta Doretta o Marzemina Nera Bastarda, di cui 3
inserite nel Catalogo Italiano delle Varietà Coltivate, mentre gli altri genotipi sono risultati
condivisi da più cultivar contemporaneamente, sia locali che certificate, suggerendo eventuali
sinonimie. Ad esempio, le due cultivar Corbinona e Corbinella sono risultate condividere lo stesso
47
genotipo confermando precedenti risultati, ottenuti con marcatori microsatelliti nucleari e
cloroplastici, a sostegno di un caso di sinonimia (Salmaso et al., 2008). Identico risultato anche per
le cultivar Marzemina Nera e Marzemina Cenerenta, che sulla base di analisi con marcatori SSR,
possono essere considerate sinonime (Salmaso et al., 2008). Altro caso particolare è rappresentato
dai Rabosi, per i quali i due genotipi locali non certificati, Raboso Piave e Raboso Veronese, hanno
confermato la loro identità genetica con gli omonimi vitigni certificati. Per quanto concerne il
Friularo, invece, tale cultivar anche se non registrata nel Catalogo Italiano delle Varietà Coltivate, è
ritenuta essere un biotipo del Raboso Piave adattato alla regione dei Colli Euganei, come
confermato sia da analisi precedenti con marcatori SSR (Salmaso et al., 2008) che dai risultati
attuali basati sul sequenziamento di alcune regioni nucleari.
1.4 CONCLUSIONI
L’alto numero di genotipi ottenuti con questo studio dimostra che il fingerprinting varietale basato
sull’analisi di polimorfismi del DNA in regioni nucleari singola copia è possibile e potrebbe
pertanto costituire uno strumento diagnostico utile ai fini della caratterizzazione genetica di cultivar
internazionale e locali. Tutelare questo patrimonio genotipico è fondamentale sia per garantire
l’autenticità delle cultivar di vite e dei loro derivati sia per proteggere le varietà locali che
rappresentano non solo una valida risorsa per il territorio, dato che queste cultivar costituiscono
tuttora la base di famosi vini regionali, come il Gruaja, la Marzemina e il Friularo, ma anche una
potenziale fonte di variabilità genetica sfruttabile in programmi di miglioramento genetico.
BIBLIOGRAFIA
Bessis R (2007). Can J Bot 85:679-690
Garcia-Beneytez E et al. (2002). J Agr Food Chem 50:6090-6096
Hebert PDN et al. (2003). Proc R Soc Lond B 270:313-321
Krees WJ et al. (2007). PloS ONE 6:1-10
Nicolè S et al. (2011). Genome 54:529-545
Salmaso M et al. (2008). Genome 51:838-855
Sarkar IN et al. (2002). Mol Phylogenet Evol 24:388-399
This P et al. (2004). Theor Appl Genet 109:1448-1458
48
Tabella 1: Lista dei genotipi impiegati.
No. Specie
Cultivar
Origine
Origine
Destinazione bacca
86 Vitis vinifera
Italia
certificato
vino, tavola
19 Vitis vinifera
Spagna
certificato
vino
16 Vitis vinifera
Portogallo
certificato
vino
11 Vitis vinifera
Grecia
certificato
vino, tavola, passa
Romania
certificato
vino
4 Vitis vinifera
1 ibrido interspecifico
Perla
Italia
certificato
tavolo
1 ibrido interspecifico
Bianca
Italia
certificato
vino
1 ibrido interspecifico
Tintoria*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
1 Vitis riparia
Gloire
collezione CRA ISV
locale
portainnesto
1 Vitis rupestris
Du Lot
collezione CRA ISV
locale
portainnesto
1 Vitis berlandieri
selvatico
collezione CRA ISV
locale
portainnesto
1 Vitis cinerea
selvatico
collezione CRA ISV
locale
fonte di germoplasma
1 Vitis labrusca
selvatico
collezione CRA ISV
locale
fonte di germoplasma
CRA ISV, Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura Istituto Sperimentale per la Viticoltura
Tabella 2: Lista delle cultivar locali impiegate come caso di studio.
Vitis vinifera
Gruaja*
Breganze, Vicenza
locale
vino
Vitis vinifera
Agostana Nera*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Cabernet Lispida*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Corbinella*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Corbinona*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Friularo *
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Gatta*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Marzemina Bianca
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Marzemina Cenerenta*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Marzemina Nera
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Marzemina Nera Bastarda*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Negrara Veronese*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Pattaresca*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Pignola
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Raboso Piave
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Raboso Veronese
Colli Euganei, Padova
locale
vino
Vitis vinifera
Schiavetta Doretta*
Colli Euganei, Padova
locale
vino
*, Varietà non registrate nel Catalogo Italiano delle Varietà Coltivate;
49
Tabella 3: Lista delle regioni, cloroplastiche e nucleari, amplificate con indicata la localizzazione cromosomica,
la funzione e la lunghezza della regione.
Marker
rps16
rpl32-trnL
trnH-psbA
trnT-trnL
atpB-rbcL
trnL-trnF
Cromosoma
cloroplasto
cloroplasto
cloroplasto
cloroplasto
cloroplasto
cloroplasto
Funzione
introne
spaziatore intergenico
spaziatore intergenico
spaziatore intergenico
spaziatore intergenico
spaziatore intergenico
Lunghezza (bp)
956
1377
460
1016
927
406
GAI
1
fattore di trascrizione delle giberelline
761
ID04
3
proteina con dominio ZIP per il legame al DNA
419
IIC08
3
proteina con dominio zinc finger
418
ATP
7
ATP sintasi
800
UFGT
16
glucosiltransferasi coinvolta nella trasduzione
del segnale mediato da GA
919
Taberlet, P., L. Gielly, G. Pautou, and J. Bouvet. 1991. Universal primers for amplification of three
non-coding regions of chloroplast DNA. Pl. Mol. Biol. 17: 1105-1109.
Tabella 4: Numero (No) di SNP, frequenza, numero di genotipi (Gn) e numerosità (Gh) di
accessioni per ciascun genotipo all'interno della specie Vitis vinifera e tra le specie selvatiche
per ciascuna regione target nucleare.
Frequenza
Gn
(1SNP/bp)
Vitis spp. V. vinifera Vitis spp. V. vinifera Vitis spp. V. vinifera
17
14
44.76
54.36
23
18
21
21
19.95
19.95
33
28
19
17
22
24.59
14
11
21
15
38.09
53.33
25
19
29*
29
31.69
31.69
97
92
107
96
31
34.55
134
126
No. SNPs
GAI
ID04
IIC08
ATP
UFGT
Combinate
50
Gh
V. vinifera
1-101
1-44
2-86
1-73
1-15
1-4
Tabella 5: Ricostruzione della composizione genotipica delle cultivar locali e di alcune cultivar internazionali. Per
ciascun gene indici differenti indicano una diversa combinazione genotipica.
Accessione
Cabernet Sauvignon**
Genotipo GAI ID04 IIC08 ATP
1
GAI1 IDO^ IICO81 ATP!
Pignola*
UFGT
UFGTÌ
2
GAI2 ID04! IICO82 ATP2
UFGT2
3
GAI2 ID042 IIC082 ATP3
UFGT3
Corbinona*
Negrara Veronese*A
4
GAI2 ID042 IICO82 ATP3
GAI2 ID043 IIC082 ATP4
UFGT3
UFGT4
Merlot R3**
5
GAI2 ID043 IICO83 ATPÌ
UFGT5
6
GAI2 ID043 IICO83 ATPT
GAI2 ID043 IIC083 ATP!
GAI2 ID043 IICO84 ATP5
UFGT5
UFGT5
UFGT6
7
GAI2 ID043 IICO84 ATP6
UFGT6
Marzemina Nera*
Marzemina Bianca*
8
GAI2 ID043 IICO84 ATP6
GAI2 ID044 IICO84 ATP3
UFGT6
UFGT7
Schiavetta Doretta*A
9
GAI2 ID043 IICO85 ATPy
UFGTfl
10
GAI2 ID043 IICO85 ATPÌ
UFGT9
Friularo*
11
GAI2 ID043 IICO84 ATP8
UFGT7
Raboso Veronese*
Raboso_Piave*
12
GAI2 ID045 IICO84 ATPa
GAI2 ID046 IICO82 ATP5
UFGT7
UFGT10
GAI2 ID046 IICO82 ATP5
UFGT10
Friularo*
Friularo*A
GAI2 ID046 IICO82 ATP5
GAI2 ID046 IICO82 ATP5
UFGT10
UFGT10
Friularo*A
Friularo*A
Chardonnay Blanc**
13
GAI2 ID046 IICO82 ATP5
GAI2 ID046 IICO82 ATPS
GAI2 ID046 IIC082 ATP5
UFGT10
UFGTm
UFGTn
14
GAI2 ID046 IICO84 ATP!
UFGT12
15
GAI2 ID044 IICO82 ATP4
UFGT13
16
GAI2 ID044 IICO84 ATP5
UFGT14
17
GAI2 ID047 IIC086 ATP9
UFGT1S
18
GAI2 ID048 IIC086 ATP9
UFGT1fi
A
Corbinella*
A
Merlot 181**
Merlot**
Pattaresca*A
Marzemina_Cenerenta*
Cabernet_Lispida*
A
A
A
Raboso_Piave*
A
Marzemina Nera
A
Bastarda*
Agostana Nera*A
A
Gatta*
A
Gruaja*
A
Tintoria*
*, cultivar locali; **, cultivar internazionali; A, cultivar non registrate nel Catalogo Italiano delle Varietà
coltivate.
51
Figura 1
52
2. Identificazione di variazioni genetiche in Vitis vinifera attraverso il risequenziamento di cultivar di Merlot e Prosecco
C. Rigobello, A. Vezzi, R. Schiavon, A. Albiero, C. Forcato e G. Valle
CRIBI - Centro di Ricerca Interdipartimentale per le Biotecnologie Innovativa, Università
degli Studi di Padova
Il sequenziamento del genoma della vite (Jaillon et al., 2007), per il quale il gruppo del CRIBI ha
attivamente contribuito, ha consentito di acquisire informazioni che permetteranno di migliorare le
condizioni di coltivazione delle varie cultivar per far fronte ai gusti e alle necessità dei consumatori.
Il nostro gruppo ha inoltre partecipato ad ulteriori studi per caratterizzare le funzioni dei geni e i
meccanismi con cui questi sono regolati (Horner et al., 2010), mentre attualmente il nostro gruppo
sta partecipando ad altre ricerche post-genomiche.
Tra i vari campi di analisi dei dati di sequenziamento, la genomica funzionale ha il compito di
identificare e interpretare il significato di varianti geniche (alleli) presenti in cultivar diversi, per
metterle in relazione alle funzioni specifiche dei corrispondenti geni, nonché alle caratteristiche
(fenotipo) che i geni e le loro varianti alleliche determinano. Queste informazioni sono quindi
necessarie per spiegare le relazioni tra geni e proteine e capirne le caratteristiche fenotipiche che
descrivono le qualità di un vitigno rispetto ad un altro. Ne sono un esempio le componenti
aromatiche (sintesi di antocianine, flavonoidi, polifenoli, e altri metaboliti secondari) che stanno
alla base delle diverse qualità di vino. Un altro aspetto da considerare riguarda sicuramente il
miglioramento della struttura della pianta intesa come crescita e maturazione, qualità della bacca,
resistenza ai patogeni e condizioni di crescita in relazione ai cambiamenti climatici. Le differenze a
livello genico, all’interno della stessa specie, spesso portano a diverse sostanze a livello fenotipico,
che possono favorire una serie di individui rispetto ad altri.
Il nostro progetto di ricerca ValViVe ha appunto l’intento di individuare le variazioni genetiche
(polimorfismi) in cultivar della stessa specie. A questo proposito sono state individuate due varietà
autoctone di vite (Merlot e Prosecco Glera) con l’intento di evidenziare le differenze genomiche
caratterizzanti la singola cultivar.
L'obiettivo del progetto era quello di avere il maggior numero possibile di marcatori al fine di
disegnare eventualmente una mappa genetica per la singola cultivar. E' ben noto che la disponibilità
di marcatori genetici offre la possibilità di indagare i genotipi e valutare le differenze tra le specie o
le sottospecie. Le mappe genetiche consentono di facilitare le tecniche di allevamento delle piante
(breeding) e la ricerca genomica, individuando alleli favorevoli associati a caratteri “positivi" o
53
alleli che portano, ad esempio, alla suscettibilità rispetto ad alcuni patogeni o a determinate
condizioni ambientali.
La scelta delle due cultivar in questione è stata valutata rispetto a diversi aspetti:
-
L’origine autoctona dei vitigni e le diverse condizioni di crescita. Il Merlot è proveniente
dall’Azienda vitinvinicola Borin Vini e Vigne coltivato presso Monticelli, Monselice,
Padova. Le plantule di Prosecco (Glera) provengono dal C.R.A. (Centro di Ricerca per la
Viticoltura di Susegana) e sono state coltivate su terreno solido in un ambiente controllato
presso l’Università di Padova.
-
L’esiguità di informazioni genomiche su queste due specifiche cultivar.
Per ottenere i risultati è stato condotto un esperimento di re-sequencing dei genomi di Merlot e
Prosecco (Glera), usando la piattaforma SOLiD (Applied Biosystems). La vite in natura è altamente
polimorfica, con due aplotipi che rivelano milioni di SNP. Questo aspetto della vite rappresenta una
potente risorsa per i programmi di miglioramento genetico e molecolare. Una volta che la sequenza
di una particolare varietà è disponibile (nel caso della vite la PN40024) è possibile eseguire degli
esperimenti di sequenziamento comparativo o risequenziamento (re-sequencing) di altri genomi
correlati per identificare polimorfismi, mutazioni e variazioni strutturali. Questo tipo di studio, però,
necessita della disponibilità di un genoma di riferimento ed un sistema ad alta processività che
fornisca la copertura necessaria per il rilevamento di una variante. Un altro punto critico del resequencing è la preparazione delle librerie di DNA che è molto complessa e impegna tanto tempo
considerando l'analisi multipla dei genomi da confrontare. Per questi motivi l'uso dei sequenziatori
di nuova generazione è innovativo: gli esperimenti di re-sequencing sono eseguiti in parallelo su
diversi genomi con un notevole risparmio di tempo.
Considerando tutti questi aspetti, sono state create due librerie mate-pairs, una per ogni cultivar a
cui è seguita una corsa di sequenziamento standard sulla piattaforma SOLiD 3. Successivamente i
dati prodotti sono stati analizzati per l'identificazione di eventuali polimorfismi. Sono state prodotte
per il Merlot 8,4 Gb di sequenza genomica, mentre per il Prosecco 6,8 Gb (tabella 1).
Merlot
Prosecco
Million of
reads
Gb
Million of reads
Gb
Tabella 1.
Tot output
337.8
8.4
271.5
6.8
Dati SOLiD: reads prodotte
First alignment
85.5
2.1
152.8
3.8
e reads allineate.
Final alignment
131.6
3.3
211.8
5.3
Not aligned
206.2
5.1
59.7
54
1.5
Grazie all'uso di un software specifico di allineamento di short reads, denominato PASS, sviluppato
presso il CRIBI, circa 1,2 milioni e 2,2 milioni di SNP sono stati identificati rispettivamente per
Merlot e Prosecco. Di questi, circa 400 mila sono in comune tra le due cultivar, mentre gli altri sono
cultivar-specifici (figura 1).
Figura 1. Diagramma di Venn - numero
di SNP identificati. Zona rossa: SNP di
Merlot; zona verde: SNP di Prosecco;
zona gialla: SNP in comune tra le 2
cultivar.
Ulteriori studi sono necessari per approfondire questa prima analisi dei dati. Le varianti individuate
saranno inoltre testate mediante una PCR di pool di SNP casuali per confermare le analisi
bioinformatiche. L'analisi di specifici set di geni sarà utile per indagare le differenze all'interno di
una famiglia genica o tra famiglie. Tutte le variazioni sono state mappate nel GBrowse della vite
come SNP di Merlot e SNP di Prosecco. Ciascuna evidenza indica il cambiamento di base, il
codone che nel caso viene modificato e l'amminoacido che eventualmente cambia (figura 2).
Figura 2. Rappresentazione del GBrowse di Vitis vinifera. In alto viene rappresentata una
Panoramica di ciascun cromosoma (es. chr 3). Subito sotto si può identificare una regione del
cromosoma stesso. Infine nei dettagli vengono visualizzati gli SNP di Merlot e Prosecco che sono
55
rappresentati da puntini di diverso colore. Il colore è identificativo di un cambiamento di base che
porta eventualmente ad una modificazione della sequenza aminoacidica.
Lo studio ha anche permesso di identificare variazioni strutturali (SVs) individuando alcune “aree"
di particolare interesse, soprattutto per quel che riguarda le selezioni definite “large”. Il limite delle
analisi bioinformatiche per il rilevamento delle differenze è spesso dovuto ad una bassa copertura
del genoma. In questo caso, prendendo in considerazione solo le coppie corrette della libreria matepairs, cioè quelle coppie con corretto orientamento reciproco e che mappano ad una giusta distanza
nel genoma di riferimento, si è ottenuta una buona copertura fisica (50 X per il Merlot e 141 X per
il Prosecco) e una bassa copertura di sequenza (1,5 X Merlot e 3,5 X Prosecco). Questo ultimo dato,
in ogni caso, se preso in considerazione assieme al coverage fisico, fornisce alcune importanti
indicazioni sui riarrangiamenti genomici. Si può quindi affermare che, la grande quantità di dati
prodotti dai sequenziatori di nuova generazione offre la possibilità di studiare in parallelo diversi
aspetti che riguardano le relazioni tra i geni e i meccanismi che regolano le loro funzioni. Il
problema sorge nell'analisi ed interpretazione corretta dei dati stessi; infatti, una pianificazione della
ricerca non corretta potrebbe portare ad un grosso spreco di risultati. Per quanto riguarda questo
specifico studio, è senz’altro necessaria un'analisi più accurata dei riarrangiamenti nelle regioni
codificanti per verificare la diversità nucleotidica e il tasso di diversità tra le cultivar.
REFERENZE BIBLIOGRAFICHE
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splicing of primary microRNA transcripts and tissue specific expression of mature microRNAs in
Vitis vinifera." BMC genomics 11, no. 1 (2010): 109.
56
3. La Plasticità Fenotipica in Vitis vinifera cv Corvina.
Silvia Dal Santo, Sara Zenoni, Giovanni Battista Tornielli, Marianna Fasoli, Flavia Guzzo, Massimo Delledonne,
Mario Pezzotti - Università di Verona, Dipartimento di Biotecnologie, Strada Le Grazie 15, 37134 Verona, Italia
3.1 INTRODUZIONE
Vitigno, annata e “terroir”, assieme alla denominazione di origine definiscono sinteticamente un
vino. Il disciplinare di produzione esplica analiticamente i dettagli di coltivazione e vinificazione
secondo un protocollo derivato sia dalla conoscenza tecnica che dalla tradizione locale. Il vino è la
risultante di un complesso processo biologico che deriva dalla profonda interazione della pianta vite
con il suo ambiente. Il vitigno è un entità genetica unica, generalmente rappresentata da uno o pochi
individui perfettamente adattati ad un territorio e moltiplicati vegetativamente per migliaia o milioni
di talee, ovvero, geneticamente parlando, un clone o più cloni. L’uomo ha da secoli capito che per
mantenere inalterate le combinazioni genetiche tipiche di un unico individuo, bisogna evitare la
ricombinazione dei caratteri e quindi la sessualità. La combinazione vite ed ambiente è quindi
sicuramente unica, cioè, in termini genetici, un’interazione genotipo-ambiente che esprime un
particolare ed unico fenotipo. L’ambiente in senso lato è l’insieme dei fattori naturali (pedoclimatci, microbici) ed antropici (es: tecniche colturali) che influenzano l’espressione dei caratteri.
Il ruolo fondamentale dell’ambiente nella coltivazione della vite e nella produzione di vino era già
chiaro agli Egizi, che nel 3000 a.C. riportavano sui recipienti i dati relativi all’annata di produzione,
al nome delle aziende produttrici, alla loro ubicazione e al tipo di vino. I romani definivano Ager
Falernum il luogo di produzione del Falerno, e specificavano nel Pittacium (etichetta), apposto
sulle anfore, la zona del Falerno, l’annata e il vitigno con cui era stato prodotto il vino, per stabilirne
di conseguenza il valore di mercato.
La biologia molto recentemente ha sviluppato conoscenze che hanno consentito la nascita della
genomica, una branca della genetica che studia la struttura, la funzione e l’evoluzione dei genomi
dei viventi. Il genoma rappresenta il potenziale di una cellula, di un individuo, di una specie, la cui
manifestazione dipende dalle complesse interazioni tra le componenti genetiche e ambientali. Nel
2007 sono stati pubblicati i risultati del sequenziamento e dell’analisi dettagliata del genoma della
vite (Jaillon et al., 2007; Velasco et al., 2007). Le due iniziative, una italo-francese e l’altra italoamericana, hanno decodificato rispettivamente il genoma di PN 40024, un clone sperimentale non
coltivato di Pinot Nero, e di ENTAV 115, clone di largamente diffuso di Pinot Nero. Questi
risultati, di grande valenza internazionale e motivo di orgoglio, costituiscono la base di partenza per
gli studi futuri e consentiranno l’adozione di metodologie innovative di genomica applicata per
sviluppare e rafforzare la viticoltura italiana del XXI secolo.
57
Inoltre recentemente è stato decodificato il genoma della varietà autoctona Corvina, attraverso
l’analisi della sequenza del suo clone più diffuso nell’areale veronese (clone 48), per identificarne e
studiarne le caratteristiche di tipicità ed unicità (Delledonne et al. 2012 in corso di preparazione).
Dalla conoscenza del genoma della vite e di tutte le sue varietà coltivate possono essere sviluppati
strumenti tecnologici e realizzate applicazioni importantissime, quali: riclassificare con precisione il
germoplasma coltivato e selvatico; caratterizzare ed identificare con certezza i cloni delle varietà
coltivate; individuare i tratti genetici responsabili di caratteristiche di qualità e resistenza; effettuare
il miglioramento genetico assistito in tempi brevi e studiare nei dettagli il rapporto genotipoambiente. Quest’ultimo punto è di basilare importanza nella viticoltura moderna perché ci consente,
attraverso lo studio del genoma e soprattutto della sua attività, di interpretare scientificamente il
concetto di terroir, cioè definire con esattezza gli elementi genetici che un organismo (es: clone di
una varietà di vite) mette in gioco quando coltivato in un determinato ambiente e come questi
elementi partecipino alla definizione qualitativa delle proprietà organolettiche di un vino. Inoltre,
attraverso la conoscenza del genoma, si possono delineare le relazioni tra geni e metaboliti di una
bacca e successivamente del vino e le studiarne le variazioni legate alla stagionalità, all’ambiente e
all’opera dell’uomo.
La genomica quindi deve servire a definire scientificamente i parametri che compongono il terroir e
che determinano la tipicità dei prodotti alimentari, per fornire un supporto di comprensione e di
rigore scientifico a ciò che l’uomo fino ad ora ha solo intuito ed applicato con successo.
La plasticità fenotipica si definisce come l’abilità di un organismo con un dato genotipo di cambiare
il proprio fenotipo in risposta ad ambienti differenti. Gli organismi vegetali, a causa del loro stile di
vita sessile, mostrano una plasticità fenotipica particolarmente ben sviluppata. Molti degli aspetti
della biologia dei vegetali che possono essere definiti plastici sono, altresì, di grande importanza
ecologica ed agronomica come vari tratti morfologici, fisiologici ed anatomici, il periodo di
sviluppo, di morfogenesi e di riproduzione, il “breeding system” fino ad arrivare al sistema per il
corretto sviluppo della progenie. Studi di carattere molecolare e di genetica quantitativa e
comparativa hanno rivelato il carattere precipuamente adattativo della plasticità fenotipica negli
organismi vegetali e la sua importanza nella diversificazione ecologica ed evolutiva delle piante
(Aubin-Horth and Renn, 2009; Kramer and Havens, 2009; Nicotra et al., 2010; Schlichting and
Smith, 2002).
Nel presente progetto di ricerca, si è deciso di studiare la plasticità fenotipica per mezzo di approcci
“omici”, principalmente trascrittomici e metabolomici, della cultivar Corvina di Vitis vinifera.
Questa cultivar, assieme a Rondinella e Molinara, costituisce la principale componente per la
produzione del vino Amarone. Questo vino, oltre al Recioto, rappresenta la tipicità per eccellenza
58
della produzione vinicola della provincia Veronese. Il presente studio è volto all’analisi della
relazione che intercorre tra il genotipo del clone 48 di Corvina, clone più utilizzato nella pratica
vinicola locale e il territorio veronese stesso, le sue caratteristiche fisico-chimiche e le peculiari
pratiche agronomiche in esso utilizzate.
3.2 RISULTATI
Al fine di studiare la plasticità fenotipica in Vitis vinifera, sono state raccolte durante tre stagioni
produttive consecutive (2006, 2007, 2008) bacche di uva Corvina in tre diversi stadi di sviluppo. Il
primo corrispondente all’invaiatura (veraison), è il periodo durante il quale la bacca subisce i
cambiamenti maggiori, diventando più morbida e dolce, perdendo acidità ed assumendo colore ed
aromaticità. Il secondo e terzo stadio di sviluppo presi in esame corrispondono agli stadi fenologici
della pre-maturazione e maturazione. In queste fasi si verifica, nella bacca, un flusso di tipo
floematico e l’accumulo di composti volatili ed altri metaboliti secondari, determinanti per la
formazione dell’aroma , del sapore e del profumo, caratteristici di un vino quali i terpenoidi e i
polifenoli (Coombe and McCarthy, 2000).
Le bacche raccolte per questo lavoro di ricerca provenivano da undici aziende viti-vinicole presenti
nel territorio veronese. Le imprese agricole prese in esame, tutte coltivanti il clone 48 di Corvina, si
distribuiscono su tre macro-aree geografiche: Soave, Bardolino e Valpolicella, le più importanti per
la produzione di vino locale (Figura 1). Si è proceduto alla caratterizzazione delle aziende viticole
sulla base di attributi ambientali e pratiche agronomiche utilizzate. Le caratteristiche prese in esame
per questo studio sono state: l’altitudine del vigneto (da 100 a 450 metri sul livello del mare), il tipo
di suolo (da sabbioso ad argilloso e da poco ad altamente calcareo), l’età del vigneto (da 6 a 18
anni). Per quanto riguarda le pratiche agronomiche e di allevamento si è deciso di considerare, per
ogni azienda, la forma di allevamento utilizzata (spalliera Guyot o forme a pergola), la direzione dei
filari (nord-sud o est-ovest), il sesto d’impianto, e il particolare portainnesto utilizzato (K5BB,
420A, 41B, SO4).
Il campionamento delle bacche è stato effettuato raccogliendo, in un’unica data per tutte le 11
diverse aziende, circa 20-30 grappoli lungo tutto il filare, per ottenere un campione più omogeneo e
rappresentativo; per ogni grappolo, si sono selezionate circa 100 bacche, scartando quello che
manifestavano chiari segni di danni dovuti ad agenti esterni. Per ogni pool di bacche campionato,
circa la metà delle bacche è stata usata per un’analisi fisico-chimica delle bacche stesse e per analisi
enologiche sul succo derivante. Inoltre, sono state eseguite analisi enologiche anche sui mosti e i
vini, ottenuti mediante tecniche di micro-vinificazione.
59
La parte restante delle bacche campionate è stata congelata in azoto liquido e conservata a -80° C,
al fine di mantenere inalterate le caratteristiche fisiologiche delle bacche stesse. Da queste bacche,
private dei semi, sono stati estratti i metaboliti, successivamente analizzati tramite spettrometria di
massa e i trascritti. In particolare, per lo studio del trascrittoma, è stato deciso di utilizzare la
piattaforma NimbleGen e di ibridare i trascritti estratti dai vari campioni su il microarray
NimbleGen 090918_Vitus_exp_HX12, il cui design è basato sulla nuova annotazione V1 del
genoma di vite. In totale sono state effettuate 171 ibridazioni.
Dalle prime analisi del trascrittoma della cultivar Corvina, si è potuto evincere che il trascrittoma di
vite è altamente plastico durante le varie annate prese in esame e che esso può caratterizzare annate
con un andamento meteorologico standard da un’annata con un andamento significativamente
diverso e più sfavorevole. L’annata 2007, infatti, è stata caratterizzata in tutta la regione da un
periodo eccezionalmente caldo specialmente nel mese di aprile (Tomasi et al., 2011), quando la vite
si trova nella sua fase fenologica di germogliamento (Figura 2A). L’analisi trascrittomica, effettuata
per i tre anni su di un numero ristretto ma ugualmente significativo di aziende, durante i tre stadi di
sviluppo della bacca sopra descritti, ha evidenziato come l’effetto di questa variabilità
metereologica sia più evidente rispetto alla variabilità esistente tra le singole aziende. Infatti, il
dendrogramma derivante da un’analisi di correlazione (Distanza di Pearson, p < 0,01) riportato in
Figura 2B mostra chiaramente che il trascrittoma delle bacche prelevate nel 2007 si distanzia in
modo significativo dal trascrittoma delle bacche prelevate nelle annate 2006 e 2008, in maniera
indipendente dal sito (azienda) di campionamento. Questo risultato indica chiaramente che piante di
vite esposte a variazioni metereologiche attivano un sistema di risposta plastico che può essere
sfruttato dal produttore per ottenere una standardizzazione della qualità del prodotto finale. Non a
caso, i geni che presentano una variazione trascrizionale più ampia tra annate metereologicamente
standard - 2006/2008 - e un’annata tendenzialmente più calda - 2007 - sono geni coinvolti nella
produzione dei metaboliti secondari importanti perché caratterizzano il vino a livello qualitativo e
sensoriale. Molti membri della famiglia genica delle stilbene sintasi, ad esempio, sono caratterizzati
da espressione genica significativamente diversa fra i due tipi di annata. Questo enzima è coinvolto
nella biosintesi dei fenilpropanoidi, ed in particolar modo nella sintesi del resveratrolo, un
particolare fenolo molto noto non solo perche dona al vino particolari caratteristiche qualitative ma
anche importanti proprietà benefiche per la salute dell’uomo (Gatto et al., 2008).
La over-espressione dei geni codificanti le stilbene sintasi in annate meterologicamente standard
rispetto ad annate più calde è stata verificata analizzando a livello metabolico il contenuto di
resveratrolo del succo di uve campionate nei rispettivi tipi di annata (Figura 2C), trovando una
60
evidente correlazione tra risultati ottenuti con approcci diversi, trascrittomico e metabolomico,
partendo dallo stesso materiale biologico.
Per la seconda parte del progetto è stata presa in considerazione un’annata dall’andamento
meteorologico standard, quale il 2008, ampliando il numero di aziende studiate a 11. Dall’analisi
trascrittomica di questi campioni si è potuto notare come la plasticità fenotipica sia un fenomeno
ben rappresentato in vite: circa il 5% del totale dei trascritti è utilizzato dal genoma del clone 48 per
risposte e arrangiamenti plastici. Durante lo sviluppo della bacca, cioè, circa 1500 geni mostrano
una modulazione significativamente diversa nelle varie aziende, dipendente cioè unicamente dal
sito di allevamento delle vigne (Analisi non parametrica Kruskal-Wallis, p < 0,01).
Inoltre, utilizzando approcci statistici di tipo multivariato, sono state studiate le relazioni che
intercorrono tra gli 11 siti di prelevamento del materiale biologico. I trascrittomi delle bacche
provenienti dalle varie aziende si separano in 5 gruppi principali quando analizzati con l’analisi
statistica della O2PLS-DA (Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis).
Ciò indica che l’allevamento della cultivar Corvina in aziende con caratteristiche diverse può
provocare risposte simili a livello trascrizionale (Figura 3). Alcuni gruppi di geni plastici, difatti,
potrebbero essere impiegati dalla pianta in modo uguale come reazione ad ambienti diversi. In
particolare, le aziende facenti parte di ogni singolo gruppo statistico sono caratterizzate dall’uso di
diverse combinazioni di pratiche agronomiche: la forma di allevamento utilizzata (spalliera Guyot o
forme a pergola), la direzione dei filari (nord-sud o est-ovest) e il particolare portainnesto utilizzato
(K5BB, 420A, 41B, SO4). Questo risultato suggerisce che la plasticità fenotipica di vite sarebbe
influenzata più dalle pratiche agronomiche, da scelte e tecniche apportate dall’uomo, piuttosto che
dagli attributi ambientali del sito ove sorge la particolare azienda viti-vinicola. Quest’ultimi, infatti,
non risultano significativi all’analisi statistica.
3.3 CONCLUSIONI
La Plasticità fenotipica del clone 48 della cultivar Corvina di Vitis vinifera è stata valutata mediante
approcci “omici”, principalmente trascrittomici, metabolomici ed enologici, su campioni di bacche
provenienti da vitigni di aziende del territorio veronese.
Le variazioni di trascritti e metaboliti sono state messi in relazione con specifiche caratteristiche
ambientali e con le diverse pratiche agronomiche utilizzate. Se ne è evinto che il trascrittoma di vite
risponde e si plasma più in base ad attività e consuetudini agronomiche apportate dall’uomo che a
caratteristiche prettamente naturali, come il tipo di suolo, l’altitudine o l’età del vigneto. Grazie
61
all’ampio campionamento, protrattosi nell’arco di tre annate vitivinicole, si è potuto anche
verificare come il trascrittoma di vite reagisca in modo plastico ad eventi atmosferici specifici di
ogni stagione produttiva.
Da questo studio si possono trarre alcuni benefici pratici per la coltivazione di vite e la produzione
di vino di qualità costante nel tempo. Innanzi tutto, all’atto di programmazione, organizzazione e
impianto di un nuovo vitigno, il produttore potrà considerare quali pratiche agronomiche utilizzare
(forma di allevamento, tipo di orientazione del filare, portainnesto) in relazione alle caratteristiche
di vino che desidera ottenere (maggior contenuto in polifenoli, maggior contenuto in zuccheri
riduttori etc).
Secondariamente, tramite campionamenti su piccola scala, analisi trascrittomiche e monitoraggio di
alcuni geni “markers”, il produttore potrà fare una stima dell’andamento della stagione produttiva
in relazione ad eventi atmosferici (ad esempio, un forte innalzamento della temperatura durante la
fioritura) ed agire di conseguenza con pratiche di “viticoltura assistita”.
3.4 LEGENDE
Figura 1. Rappresentazione schematica delle aree viti-vinicole del territorio veronese interessate
dal campionamento di bacche di Corvina.
Figura 2. (A) Andamento tendenziale della temperatura media registrata nelle aree interessate dal
campionamento di bacche di Corvina nelle annata 2006, 2007 e 2008. (B) Dendrogramma dei
trascrittomi di bacche di vite prelevate da 4 aziende diverse durante tre annate. I valori di
correlazione di Pearson sono convertiti in coefficienti di distanza per definire l’altezza del
dendrogramma. (C) Contenuto relativo in Resveratrolo di bacche di vite prelevate nelle annate 2006
e 2008 (average) and 2007.
Figura 3. Rappresentazione schematica della clusterizzazione a 5 gruppi del “dataset” dopo analisi
con O2PLS - DA (Simca-P 12.0)
62
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63
FIGURE
Figura 1
Area del
Valpolicella
Area del
Bardolino
Area del
Soave
Figura 2
64
Figura 3
65
4. La famiglia multigenica delle stilbene sintasi in vite: organizzazione genomica
e analisi di espressione in condizioni di stress biotico e abiotico
di Alessandro Vannozzi, Ian B. Dry, Margherita Lucchin
4.1 ABSTRACT
Gli stilbeni rappresentano un gruppo minore di fenilpropanoidi che vengono accumulati in una
minoranza di specie vegetali in seguito a stress biotici e abiotici quali infezione da parte di patogeni,
ferita, esposizione a radiazione UV-C e trattamento con agenti chimici. La pathway biosintetica che
porta alla loro produzione costituisce una branca minore della pathway dei flavonoidi ed è
catalizzata da enzimi noti come stilbene sintasi (STS), delle poliketide sintasi del terzo tipo (PKS),
filogeneticamente molto vicine alle chalcone sintasi, gli enzimi chiave che sovraintendono alla
biosintesi di chalconi e dei flavonoidi in genere. Ad oggi, STS sono state clonate da arachide, sorgo,
alcune specie di pino e vite, l’unica pianta da frutto in grado di accumulare stilbeni il cui genoma è
stato completamente sequenziato. Ad eccezione del sorgo, in tutte le altre specie, le STS sono
organizzate in famiglie multigeniche composte di membri strettamente relazionati tra loro.
Questo studio riporta la completa caratterizzazione genomica della famiglia delle STS in vite a
partire dall’identificazione, annotazione e analisi filogenetica di tutti i membri sulla base della
versione più recente del genoma di vite e fornisce una panoramica del pattern di espressione di ogni
singolo membro in diverse condizioni di stress biotici e non.
I risultati ottenuti suggeriscono l’esistenza di almeno 36 geni full-lenght caratterizzati da una subfunzionalizzazione trascrizionale tra diversi sottogruppi della famiglia genica e forniscono un
importante base per la pianificazione di analisi funzionali mirate alla definizione del ruolo e
dell’evoluzione dei diversi membri di questa famiglia genica.
4.2 INTRODUZIONE
Il termine “fitoalessine” fa riferimento a un vasto set di composti lipofilici di basso peso molecolare
che vengono accumulati dalle piante in difesa dall’attacco di patogeni, ma anche in risposta a stress
abiotici quali l’esposizione a radiazione ultravioletta (UV-C), ferita, trattamento con sali e metalli
pesanti o ormoni quali etilene o jasmonati (JAs). Sebbene questi composti mostrino una notevole
diversità nel regno vegetale, nella vite (Vitis vinifera L.) costituiscono un gruppo piuttosto ristretto
di molecole, tutte appartenenti alla famiglia degli stilbeni (Counet et al., 2006). Gli stilbeni, come i
flavonoidi appartengono alla classe dei poliketidi, un importante gruppo di fenilpropanoidi derivati
dall’estensione della forma attivata del acido cumarico con tre gruppi acetilici. Oltre alle vitacee, gli
66
stilbeni sono stati rintracciati in almeno 72 specie vegetali distribuite in 31 generi e 12 famiglie tra
cui Fagaceae, Liliaceae, Moraceae, Myrtaceae, Papillionasceae, Pinaceae e Poaceae (Counet et al.,
2006; Sotheeswaran et al., 1993; Yu et al., 2005).
La totalità degli stilbeni presenti in vite è rappresentata da molecole più o meno complesse derivanti
da modificazioni dell’unita chimica di base 3,5,4-triidrossi-trans-stilbene, nota come resveratrolo.
Alcune specie vegetali, quali Polygonum cuispidatum e Pinus spp., accumulano stilbeni in modo
costitutivo (Hart et al., 1981; Jayatilake et al., 1993; Benova et al., 2008; Hathway et al., 1962), ciò
nonostante, la maggior parte degli studi condotti su arachide (Arachis ipogea), pino e vite hanno
mostrato che gli stilbeni sono presenti a livelli molto bassi in condizioni normali e, al contrario,
vengono massicciamente accumulati in seguito a stress attraverso l’attivazione trascrizionale dei
geni che sovraintendono alla loro biosintesi e alla co-attivazione di geni appartenenti alla pathway
generale dei fenilpropanoidi, quali PAL e C4H (Fig.1). L’enzima responsabile della biosintesi del
resveratrolo, isolato per la prima volta da colture cellulari di arachide (Schöppner et al., 1984) e
noto col nome di stilbene sintasi (STS), appartiene alla famiglia delle poliketide sintasi del III tipo,
di cui le chalcone sintasi (CHS) rappresentano l’archetipo principale. L’enzima è un dimero di peso
molecolare pari a 90 KDa e un punto isoelettrico (pI) pari a 4.8. L’azione catalitica delle STS
sembra dovuta a un residuo di cisteina presente in una regione altamente conservata, comune sia a
STS che CHS. Tale residuo costituisce il sito di legame per il p-coumaroyl-CoA, la molecola
substrato comune ad entrambe, STS e CHS (Schöppner et al., 1984). Questi due enzimi non solo
competono dal punto di vista metabolico per lo stesso substrato, ma mostrano un alto grado di
somiglianza sulla base della omologia di sequenza (che raggiunge anche il 75-90% di identità
amminoacidica a seconda delle specie) e del confronto tra le due strutture cristallografiche.
Le STS, che a differenza delle ubiquitarie CHS sono presenti esclusivamente nelle specie vegetali
in grado di accumulare stilbeni, catalizzano la formazione in una singola reazione enzimatica dello
stresso identico intermedio tetraketidico che si forma in seguito all’attività delle CHS, ma con un
diverso processo di ciclizzazione che porta alla formazione degli stilbeni piuttosto che dei chalconi
(Fig. 2). Ad oggi, STS sono state clonate da
arachide (A. hypogaea), pino silvestre (Pinus
sylvestris), pino rosso giapponese (P. densiflora), pino strobo (P. strobus), vite (V. vinifera) e sorgo
(Sorgum bicolor). Nella totalità di queste piante, ad eccezione di sorgo, le STS esistono come
famiglie multigeniche: in pino strobo sono state identificate 2 STS (Raiber et al., 1995), in pino
silvestre sono stati clonate almeno 5 pinosilvina sintasi (la pinosilvina rappresenta il principale
stilbene prodotto in pino; Preising-Müller et al., 1999) mentre 3 membri sono stati isolati nel pino
rosso giapponese (Kodan et al., 2002). Ad esclusione del sorgo, in cui è stato isolato solo un gene
codificante per stilbene sintasi (Yu et al., 2008; Paterson et al., 2009), la vite rappresenta l’unica
67
pianta da frutto in grado di accumulare stilbeni il cui genoma sia stato interamente sequenziato
(Jaillon et al., 2007; Velasco et al., 2007). Sulla base delle predizioni geniche della copertura 8.4 X
del genoma ottenuto dal genotipo PN40024 (Consorzio Italo-Francese) (Jaillon et al., 2007) la
famiglia multigenica delle STS conterebbe almeno 43 membri. Tale numero si riduce notevolmente
su si considero le predizioni geniche ottenute sul genotipo PN ENTAV 115 ad opera dell’ Istituto
agrario di S. Michele all’Adige (IASMA), che avrebbe ha predetto l’esistenza di appena 21 STS
(Velasco et al., 2007).
Questo studio si è posto come obbiettivo principale la chiarificazione e definizione
dell’organizzazione della famiglia delle STS in vite e, contemporaneamente, l’analisi della risposta
trascrizionale di ciascun membro di tale famiglia in condizioni di stress biotico e abiotico, con lo
scopo di valutare l’esistenza di una sub-funzionalizzazione trascrizionale tra i vari membri e
spiegare l’accumulo di un numero così elevato di copie geniche in vite, contrapposto alla totale
assenza di tali geni nella maggior parte delle specie del regno vegetale.
4.3 RISULTATI
Identificazione, annotazione e distribuzione cromosomica delle STS in vite
In una prima fase di studio, la bozza del genoma ottenuta dal genotipo altamente omozigote
PN40024 è stata analizzata al fine di individuare sequenze geniche codificanti per stilbene sintasi. A
tale scopo, il modello di Hidden Markow (H.M.M) per il sito catalitico comune a CHS/STS
(PS00441; http://expasy.org/prosite) è stato utilizzato come query in una ricerca mediante blastP sul
database proteomico delle coperture 8X e 12 X del genoma di vite. Per estendere la ricerca anche a
membri non predetti dagli strumenti bioinformatici utilizzati nella creazione di tale database (GAZE
e JIGSAW) la ricerca è stata estesa anche all’intera sequenza genomica (tBLASTx).
Tre predizioni contenenti il sito attivo CHS/STS ma rappresentanti CHS e non STS sono state
escluse dagli hit ottenuti dai blast e dalle successive analisi lasciando un totale di 41 sequenze
geniche putativamente codificanti per STS. L’analisi delle sequenze amminoacidiche e
nucleotidiche mediante Vetor NTI Suite 9 ha portato all’esclusione di alcune predizioni considerate
pseudogeni, probabilmente originati dalla duplicazione di STS funzionali, ma contenenti mutazioni
di stop o in/del risultanti in proteine prive della totalità o di parte del sito catalitico e verosimilmente
non funzionali. Con l’esclusione di tali sequenze l’analisi ha portato all’identificazione di 36 geni
STS, nominati VvSTS1-36 sulla base della loro posizione cromosomica (Tavola 1). VvSTS1-4
localizzano in una regione di circa 90 Kb sul cromosoma 10, mentre VvSTS5-36 sono localizzate in
68
una regione di circa 500Kb sul cromosoma 16 (Fig. 3). La lunghezza dei geni varia da un minimo di
1315 nt (VvSTS9) a un massimo di 1566 (VvSTS1) in base alla lunghezza dell’unico introne
posizionato sulla tripletta codificante per Cys-60, come precedentemente osservato da Schrooder et
al (1988). Le sequenze proteiche predette hanno una lunghezza di 390-392 aa ad esclusione di tre
membri che codificano per proteine tronche: VvSTS1, che ha una mutazione di stop in posizione
234, VvSTS2 che ha una mutazione di stop in posizione 367 e VvSTS12 che ha una mutazione di
stop in posizione 185. In tutti i casi le tre proteine tronche conservano il sito catalitico CHS/STS e
,pertanto, sono state considerate putativamente funzionali.
4.4 ANALISI FILOGENETICA DELLA FAMIGLIA DELLE VVSTS
La sequenze amminoacidiche delle VvSTS identificate dall’analisi del genoma di PN40024 sono
state allineate mediante il modulo AlignX di Vector NTI Suite 9 utilizzando la matrice BLOSUM.
Tale
modulo
si
basa
sullo
stesso
algoritmo
utilizzato
in
ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ ). Nell’allineamento è stata inclusa anche la sequenza
amminoacidica dedotta per una CHS, utilizzata come out-group. Sulla base dell’allineamento
amminoacidico è stato generato un albero filogenetico mediante Neighbour Joining con 1000
repliche di bootstrap (Fig. 4). L’analisi mostra che le VvSTS clusterizzano in 3 sottofamiglie
principali indicate come A, B1 e B2. La sottofamiglia A è composta da membri localizzati nel
cromosoma 16 ed è la più vicina alla CHS in termini di omologia di sequenza. La sottofamiglia B si
divide a sua volta in due cluster minori: B1, composto interamente da membri che localizzano nel
cromosoma 10 (VvSTS1-VvSTS4) e B2, che comprende le restanti VvSTS che localizzano nel
cromosoma 16.
4.5 ANALISI DI ESPRESSIONE DELLE FAMIGLIA
CONDIZIONI DI STRESS BIOTICI E ABIOTICI
VVSTS
IN
Il pattern di espressione delle 36 VvSTS predette nelle coperture 8 e 12X del genoma di PN40024 è
stato analizzato in condizioni di stress biotici ed abiotici. L’alto grado di omologia di sequenza che
incorre tra i diversi membri della famiglia delle STS pone diverse difficoltà nella discriminazione
dei membri specifici attraverso analisi di espressione basate su tecniche tradizionali quali RT PCR o
qPCR. Pertanto, allo scopo di superare tale limitazione, è stato utilizzato un metodo di analisi basato
sul sequenziamento dell’intero trascrittoma (mRNA-seq) mediante tecnologie di sequenziamento di
nuova generazione (NGS).
69
Dischi fogliari ottenuti da piante di V. vinifera cv. Pinot noir sono stati campionati a 0, 24 e 48 h dal
trattamento con ferita, esposizione a radiazione ultravioletta (UV-C) e infezione con peronospora
(Plasmopara viticola). I sette pools di RNA, ottenuti dai campioni trattati e da un unico campione di
controllo (0h) comune a tutti i trattamenti, sono stati utilizzati per produrre le librerie necessarie per
il processo di sequenziamento, effettuato tramite piattaforma “Genoma Analyser II” (GAIIx) presso
l’Istituto di Genomica Applicata (Udine, Italia).
Il sequenziamento ha prodotto un totale di 325,519,708 reads della lunghezza di 36-39 nt. Per ogni
singolo trattamento sono state prodotte almeno 32 milioni di reads, un numero sufficiente a
garantire una buona copertura del trascrittoma e un’analisi quantitativa dell’espressione genica
(Zenoni et al., 2010). Le reads ottenute dall’mRNA-seq sono state allineate su entrambe le
coperture 8X e 12X del genoma di PN40024 (Jaillon et al., 2007) mediante i softwares “CLC
Genomic Workbench” e “ELAND”.
Il sequenziamento dell’intero trascrittoma è stato effettuato col principale obbiettivo di comparare i
livelli di espressione di ciascuna VvSTS in diverse condizioni di stress per evidenziare dinamiche e
cinetiche di risposta diverse tra i vari membri della famiglia. Per arrivare a conclusioni
statisticamente robuste circa differenze di risposta nei vari campioni corrispondenti ai diversi
trattamenti è importante utilizzare più repliche biologiche. Ciononostante, a causa degli elevati costi
richiesti per le nuove tecnologie di sequenziamento l’analisi è stata necessariamente condotta su una
singola replica biologica ottenuta creando un pool di tessuti provenienti da differenti piante. Va
comunque precisato che tale analisi ha costituito una fase preliminare cha ha fornito dati che, in un
secondo tempo, sono stati validati mediante dettagliate analisi qPCR (dati non riportati). La figura 5
mostra una rappresentazione grafica del pattern di espressione delle VvSTS in risposta ai tre tipo di
stress analizzati. A una prima analisi estesa a tutti i trattamenti appare evidente che l’esposizione a
radiazione UV-C rappresenta il trattamento che induce in maniera più massiccia la maggior parte
delle VvSTS, seguito da infezione con peronospora e ferita. In modo del tutto analogo Borie (2004),
comparando il livello di espressione delle VvSTSs in risposta a infezioni con Botrytis cinerea,
esposizione a UV-C e trattamento con agenti chimici mediante analisi northern blot, aveva indicato
l’esposizione a UV-C come il trattamento che induceva la risposta più estesa e più rapida. Lascia un
po’ perplessi la risposta piuttosto debole rilevata in seguito all’infezione con peronospora, tuttavia,
il basso livello di induzione delle VvSTS nei dischi fogliari infettati potrebbe essere dovuto al fatto
che la risposta delle VvSTS all’attacco fungino ha luogo più tardi, e di conseguenza l’induzione
registrata nelle prime 48 h rappresenta più una risposta a ferita che una reale risposta al patogeno.
Tale osservazione ha trovato conferma in dettagliate analisi real time (dati non riportati). La figura
6 mostra i patterns di espressione delle VvSTS in risposta ai tre trattamenti somministrati
70
analizzando ogni singolo trattamento separatamente. In tutti i tre casi (Fig. 6A,B e C) i membri sono
organizzati in base ai valori di espressione, dal meno espresso (quadrati blu, in alto) al più espresso
(quadrati gialli, in basso). E’ da notare che le scale di espressione relative sono diverse tra i vari
pannali (corrispondenti ai diversi stress) poiché si basano sui valori massimi e minimi registrati per
quel particolare trattamento. Questa rappresentazione grafica è utile per comparare l’induzione di
ogni singolo membro nei diversi trattamenti.
I risultati evidenziano che le VvSTS più responsive sono le medesime in tutti i trattamenti, seppur
con diversi livelli di intensità. Questi membri corrispondono a quei geni facenti parte della
sottofamiglia B2. In particolare VvSTS36 e VvSTS7 rappresentano i membri maggiormente espressi
in tutti i trattamenti esaminati, con valori di RPKM che si attestano attorno a 100 in caso di ferita,
200 in seguito a infezione e 1900 (circa 15 volte maggiore) in dischi fogliari a 24 h dall’esposizione
a UV-C. Le VvSTS appartenenti alle sottofamiglie A e B1 non sembrano rispondere ai trattamenti
con la stessa intensità: i membri del gruppo A mostrano un’induzione a 24h dall’esposizione a UVC (il punto della cinetica che registra la più alta induzione delle VvSTS) che va da un minimo di 10
RPKM (VvSTS11) a un massimo di 300 RPKM (VvSTS12). L’induzione registrata per i membri del
gruppo B1 è ancora più bassa: sebbene sia stata registrata una sensibile induzione in seguito a
trattamento UV, non si sono riscontrati cambiamenti significativi in seguito a ferita e infezione.
Un’osservazione interessante riguarda i membri della sottofamiglia B1 che sono gli unici a mostrare
un’espressione costitutiva, seppur bassa, in foglie non trattate (controllo 0 h). In dettaglio VvSTS3 è
il gene più espresso nel campione di controllo (0h) con valori di RPKM vicini a 100. Un livello
minimo di espressione costitutiva, seppur minore, è osservabile anche per alcuni membri del gruppo
A, mentre è assolutamente assente nei membri della sottofamiglia B2.
4.6 DISCUSSIONE
Ad oggi, geni appartenenti alla famiglia delle stilbene sintasi sono stati clonati da diverse specie
vegetali tra cui arachide, sorgo, pino e vite (Morales et al., 2000). Nel maggior parte di queste
specie le STS sembrano organizzate in famiglie multigeniche composte di due, tre o cinque membri.
Le predizioni effettuate in vite stimano un numero di STS che va da un minimo di 21 copie, sulla
base del genotipo PN ENTAV 115 (Velasco et al., 2007), a un massimo di 43 membri sulla base
della copertura 8.4X del genoma ottenuto dal clone PN40024 (Jaillon et al., 2007).
Gli obbiettivi principali di questo studio erano a) la caratterizzazione della famiglia multigenica
delle STS in vite a partire dall’identificazione di tutti i membri, la loro annotazione e lo studio dei
loro rapporti filogenetici; b) lo studio della induzione di ciascun membro della famiglia in risposta a
71
trattamenti con stress biotici (infezione con peronospora) e abiotici (ferita e irraggiamento UV-C).
L’analisi del genoma ottenuto dal genotipo altamente omozigote PN40024 ha portato
all’identificazione di 36 geni VvSTS. Tutte quelle sequenze che non presentano il sito catalitico
comune a CHS e STS, che contiene un residuo di cisteina essenziale per il legame del p-coumaroylCoA e la funzionalità dell’enzima, non sono state considerate in quanto putativamente non
funzionali. I geni funzionali sono stati nominati VvSTS1-VvSTS36 sulla base della loro posizione
cromosomica (Tavola 1), coi geni VvSTS1-4 localizzati in una regione di circa 90 Kb del
cromosoma 10 e i restanti geni (VvSTS5-36) localizzati in una regione di circa 500 Kb del
cromosoma 16. La sequenza genomica dei membri isolati varia in lunghezza da un minimo di 1315
nt (VvSTS9) a un massimo di 1566 nt (VvSTS1), a seconda delle dimensioni dell’unico introne
posizionato nella tripletta codificante per Cys60, come precedentemente osservato da Schröder et al.
(1988). La maggior parte delle VvSTS codificano per prodotti proteici della lunghezza di 392 aa, ad
esclusione di VvSTS25 e VvSTS18 che mancano rispettivamente di uno e due aminoacidi e di tre
VvSTS tronche corrispondenti a VvSTS1, VvSTS2 e VvSTS12.
Il dominio C-terminale di STS e CHS è importante per l’attività catalitica di questi enzimi in quanto
possiede dei residui amminoacidici altamente conservati. In un confronto delle proprietà
enzimatiche di tre STS di pino giapponese (PdSTS1, PdSTS2 re PdSTS3) e una CHS (PdCHSX),
Kodan et al. (2001) hanno osservato che PdSTS3, che presenta una mutazione frame-shift che
determina un codone di stop prematuro e una proteina tronca, presenta delle divergenze funzionali
rispetto alle altre due STS. PdSTS3 mostra infatti un’attività biosintetica maggiore e sembrerebbe
aver perso la funzione inibitoria, a differenza di PdSTS2 e PdCHSx che sono inibite da
pinocembrina o pinosilvina. Qualcosa di simile potrebbe essere ipotizzato per la famiglia delle STS
in vite, considerando l’estensione di tale famiglia e l’esistenza di proteine tronche quali VvSTS1,
VvSTS2 e VvSTS12.
L’allineamento di sequenza e l’analisi filogenetica basata sulle proteine predette sul genotipo
PN40024 hanno rivelato l’esistenza di tre gruppi principali di VvSTS, indicati come A, B1 e B2
(Fig. 4). Il gruppo A risulta composto da geni localizzati nel cromosoma 16 ed è il più vicino alle
CHS dal punto di vista filogenetico. Il gruppo B si divide a sua volta in due sottogruppi: B1,
composto esclusivamente da membri localizzati nel cromosoma 10 e B2, che comprende le
rimanenti VvSTS del cromosoma 16.
La maggior parte degli studi sull’accumulo di composti stilbenici e sull’espressione dei geni
coinvolti nella loro biosintesi condotta su arachide, pino e vite ha indicato che tali geni sono
altamente inducibili in risposta a un vasto range di stress biotici e abiotici, tra cui il danno
meccanico (Pezet et al., 2003), l’esposizione a radiazione ultravioletta (Wang et al., 2010), il
72
trattamento con agenti chimici e l’applicazione di ormoni vegetali quali etilene o jasmonati (Belhadj
2008a, b). Sebbene tali studi forniscano un importante contributo alle conoscenze riguardo il
comportamento delle STS, la mancanza di informazioni circa le dimensioni di tale famiglia genica
in vite e l’estrema conservazione amminoacidica che ne caratterizza i membri ha portato
all’accumulo di dati che meritano di venir riconsiderati sulla base delle nuove conoscenze fornite
dal sequenziamento del genoma.
In particolare, le analisi di espressione basate su metodi di PCR convenzionali potrebbero in realtà
non riflettere il reale pattern di espressione di un singolo membro a causa della aspecificità dei
primers utilizzati nel processo di amplificazione. Inoltre, numerosi studi sull’accumulo e
espressione delle STS sono basate su analisi di tipo Northern Blot, che costituisce un efficace
strumento per monitorare il comportamento dell’intera famiglia, ma non fornisce alcuna
informazione circa il comportamento dei singoli membri. Per superare tali problemi legati alla
estrema conservazione di sequenza, in questo studio è stato utilizzato un approccio del tipo mRNAseq. La tecnologia NGS è basata su sequenziamento dell’intero trascrittoma e, dato un determinato
genoma di riferimento, permette di monitorare l’accumulo di trascritto di ciascuna predizione del
genoma. Il pattern di induzione di tutti i geni VvSTS identificati in vite in risposta a ferita,
esposizione a UV-C e infezione con peronospora è stato studiato in dischi fogliari di Pinot nero a
0h, 24h e 48h dall’applicazione dei trattamenti. Una prima interessante considerazione guardando
all’espressione delle VVSTS nel campione di controllo (0h) sta nel fatto che una espressione basale
costitutiva appare limitata ai membri della sottofamiglia B1, gli unici localizzati nel cromosoma 10.
E’ interessante l’osservazione che questi stessi geni rappresentano quelli col minor grado di
induzione in seguito a stress.
Riguardo la risposta a stress, i risultati indicano che, tra i tre trattamenti esaminati, l’esposizione a
UV-C rappresenta il trattamento più efficace nell’induzione delle VvSTS, seguito da infezione con
Plasmopara e ferita, il tutto in accordo con osservazioni effettuate precedentemente (Borié et al.,
2004). Il basso livello di induzione delle VvSTS osservato nei dischi infettati con peronospora è
probabilmente dovuto al fatto che la risposta specifica a infezione si scatena più tardi, anche in
considerazione delle tempistiche necessarie al patogeno per portare a termine i processi di
germinazione e penetrazione. La risposta osservata nelle prime 48 h dal trattamento potrebbe quindi
rappresentare più un background corrispondente all’induzione scatenata da ferita (taglio dei dischi
fogliari) piuttosto che una risposta all’attacco del patogeno. Queste osservazioni hanno trovato
conferma in analisi real time effettuata su cinetiche più estesi (dati non riportati). Al contrario, la
risposta a trattamento UV-C risulta essere molto più veloce e intensa, raggiungendo il picco a 24 h
dal trattamento. Una possibile spiegazione potrebbe essere che a differenza di ferita e infezione,
73
trattamenti che vanno a colpire solo un sottoinsieme di cellule del tessuto, l’esposizione UV-C
colpisce una porzione molto più estesa di cellule.
Andando a monitorare la specificità di risposta dei diversi sottogruppi ai diversi stress applicati,
sembra che i membri appartenenti al sottogruppo B2 siano quelli che mostrano il più alto gradi di
risposta a tutti e tre i trattamenti, seguiti dal sottogruppo A, che mostra una induzione minore ma
ancora significativa e infine dal sottogruppo B1 che, ad esclusione dello stress UV, non sembra
minimamente indotto dai trattamenti.
Il sottogruppo B2, che include le VvSTS più lontane filogeneticamente dalle CHS, è quindi quello
che mostra i più alti livelli di induzione in seguito a stress, mentre gli altri due gruppi deviano da
questo comportamento mostrando una diminuzione nella capacità di rispondere a stress e un
incremento nell’espressione costitutiva. Questa osservazione sembra dare concretezza all’ipotesi
che quelle VvSTS che sembrano più vicine alla VvCHS potrebbero mostrare una regolazione, se
non addirittura una attività enzimatica che è più vicina a quella delle CHS che a quella delle STS.
La conferma di tale ipotesi richiederà analisi biochimiche e enzimatiche su membri appartenenti
alle diverse sottofamiglie.
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75
Table I
Nella tabella sono riportati tutti i membri della famiglia multigenica delle STS identificati sulla base
delle coperture 8X e 12X del genotipo PN40024. I geni sono stati nominati da VvSTS1 a STS36
sulla base della loro posizione cromosomica. Sulla tabella sono riportati gli ID corrispondenti
nell’8X e nel 12X. La localizzazione cromosomica e la lunghezza del gene sono riportate.
76
Figura 1
Principali fattori biotici e abiotici coinvolti nell’induzione delle stilbene sintasi e nella co-induzione dei geni a monte
coinvolti nella pathway generale dei fenilpropanoidi quali PAL (phenialanine ammonia lyase) e C4H (cinnammate-4hydroxilase).
77
Figura 2
Particolare della pathway generale dei fenilpropanoidi e delle pathway di produzione degli stilbeni e dei flavonoidi. Gli
enzimi nella pathway sono mostrati come segue: PAL: phenylalanine ammonia-lyase; C4H: cinnamate-4-hydroxylase;
4CL: 3-coumaroyl-CoA synthase; CHS: chalcone synthase; STS: stilbene sintase.
78
Figura 3
Localizzazione cromosomica dei geni VvSTS in vite. I cromosomi sono rappresentati in scala per rappresentare
graficamente la posizione fisica delle STS. Tutti i membri del gruppo B1 (VvSTS1-4) sono localizzati sul cromosoma
10, mentre gli altri membri sono sul cromosoma 16.
79
Figura 4
Organizzazione filogenetica dell’intera famiglia delle STS in vite. Le sequenze sono state allineate tramite ClustalW e
l’albero è stato ottenuto tramite metodo neighbour joining. L’attendibilità dell’albero è stata testata tramite
bootstrapping con 1000 repliche. I differenti colori di background indicano le tre sottofamiglia principali in cui si
dividono le VvSTS. La CHS è stata utilizzata come out-group.
80
Figura 5
Rappresentazione grafica del profilo di espressione dall’intera famiglia delle VvSTS. I diversi trattamenti (ferita, UV-C e
infezione) sono indicati sopra ogni colonna. I geni sono indicati alla destra di ogni riga. I valori di espressione sono
indicati in RPKM (mapped reads per Kb of exon per million mapped reads).
81
Figura 6
Rappresentazione grafica dei livelli di espressione di tutti i membri della famiglia delle VvSTS. I trattamenti(ferita,
esposizione a UV-C e infezione con peronospora) sono considerati separatamente ed indicati sopra ogni colonna. I geni
sono indicati alla destra di ogni riga. I valori di espressione sono indicati in RPKM (mapped reads per Kb of exon per
million mapped reads). A: ferita; B: UV-C; C: infezione con peronospora.
82
5. Un approccio trascrittomico per lo studio dello stress nutrizionale in piante di
Glera
di Elisabetta Barizza, Michela Zottini - Dipartimento di Biologia, Università degli Studi di Padova
5.1 RIASSUNTO
La resa di un vigneto in termini di produttività e la qualità del vino sono il risultato dell’interazione
tra genotipo (vitigno) ed ambiente (Asselin, 2000). In generale infatti il prodotto di un genotipo non
è rigidamente definito, ma può avere un’ampia gamma di espressioni, tanto più ampia quanto
maggiore sarà la reattività di quella varietà alle influenze ambientali. E’ noto che i fattori ambientali
che possono influenzare i sistemi di produzione del vino sono molteplici: la composizione minerale
e microbica del suolo, il clima, la geomorfologia del territorio, ecc., tuttavia sono quasi del tutto
mancanti dati di tipo molecolare. In quest’ottica, nel presente lavoro si è utilizzato un approccio di
tipo trascrittomico per valutare la risposta delle piante a diverse condizioni ambientali. In
particolare, in questo lavoro abbiamo sottoposto ad uno stress nutrizionale da carenza alcune piante
di Glera cresciute in coltura idroponica, in condizioni controllate di luce, temperatura ed umidità.
Tale approccio ci permette di valutare l’effetto di una sola variabile sui diversi parametri che sono
stati valutati.
5.2 INTRODUZIONE
La nutrizione cationica della vite è uno dei più importanti fattori che incidono sull’acidità del mosto
e del vino (Attia et al., 2004). In particolare il potassio è il maggior nutriente per la vite e
rappresenta il catione più abbondante presente negli acini. La sua azione non si manifesta sullo
sviluppo vegetativo, come per l'azoto, bensì sull'intero metabolismo della pianta, cioè sulle attività
che si svolgono per farla crescere e mantenerla in vita. Il potassio nella vite si trova in forte
concentrazione nei punti ad attivo accrescimento o metabolismo (fotosintesi, ecc) e in alcuni organi
di riserva del tronco. Tale elemento è fondamentale durante la fecondazione (migliora la
germinabilità del polline), all'invaiantura e alla maturazione. Grazie alla sua mobilità nel floema, il
potassio si accumula principalmente nei tessuti superficiali degli acini durante la maturazione. In
particolare favorisce l'aumento del grado zuccherino e la perfetta maturazione dei grappoli, migliora
la serbevolezza, il profumo e l'aroma del vino. Esiste infatti una relazione positiva tra il contenuto
di potassio e il pH del mosto e del vino, dovuto al fatto che il potassio determina la salificazione di
alcuni acidi organici, in particolare dell’acido tartarico, in bitartrato di potassio (Poni et al., 2003;
83
Corazzina, 2007). E’ noto che l’acidità è uno dei fattori essenziali che caratterizza la qualità del
vino, determinando una buona stabilità microbiologica e mantenendo conseguentemente una
migliore qualità. E’ stato dimostrato che la carenza di quest’elemento può generare acidità troppo
elevate nel vino, in ragione di una debole precipitazione di bitartrato di potassio al momento della
vinificazione, mentre una concentrazione eccessiva di potassio causa un aumento della
precipitazione del tartrato di potassio durante la fermentazione e il consolidamento freddo, portando
ad un aumento del pH del vino che incide sulla sua stabilità.
5.3 METODOLOGIE
In questo studio sono state utilizzate piante di Glera clone ISV-ESAV10 cresciute in un sistema di
coltura idroponica flottante (Fig. 1). La composizione della soluzione idroponica è quella riportata
in letteratura (Garcia et al 2001). Per quanto riguarda la soluzione utilizzata per indurre lo stress da
carenza di potassio, questo elemento è stato ridotto nella soluzione al 20% di quella di controllo.
Figura 1. Coltura idroponica di Glera.
L’esperimento di stress nutrizionale è stato condotto nell’arco di quattro settimane durante le quali
sono stati valutati diversi parametri fisiologici (lunghezza, peso, numero di foglie). Inoltre è stato
valutato il contenuto di diversi elementi minerali mediante analisi ionomica in collaborazione con il
professor Gian Attilio Sacchi e il dottor Giorgio Lucchini del Dipartimento Produzione Vegetali
(DiProVe) di Milano mediante spettrometria di massa (ICP-MS, Inductively Coupled Plasma –
Mass Spectroscopy.
Per l’analisi molecolare sono stati raccolti gli apici delle piante sottoposte a stress e sottoposti a
controllo in diversi tempi. Per l’isolamento dell’RNA è stato utilizzato il kit MasterPureTM Plant
RNA Purification Kit (Epicenter) seguendo le indicazioni del produttore. La purificazione
dell’mRNA è stata fatta utilizzando le Dynal beads (Invitrogen) che hanno permesso di ottenere
mRNA altamente purificato ed integro per le successive analisi di trascrittomica.
84
Per il sequenziamento dell’mRNA è stato utilizzato un sequenziatore di ultima generazione SOLiD
5500 XL in grado di sequenziare 75 + 35 paia di basi alle estremità di frammenti di cDNA di
dimensione media di 150 nucleotidi, seguendo un protocollo “paired-end”.
Per la bioinformatica sono stati impiegati il linguaggio di programmazione Perl e database
relazionale MySQL installati in un cluster di calcolo Linux.
5.4 RISULTATI
Caratterizzazione fisiologica delle piante di Glera sottoposte a stress nutrizionale.
Per ogni esperimento, che è stato ripetuto almeno tre volte, sono state impiegate dieci piante di
Glera mantenute in coltura idroponica in terreno liquido di controllo o carente di potassio. Ad
intervalli regolari sono state fatte le opportune misurazioni. Nella Fig. 2 sono riportati i grafici
relativi ai parametri di crescita misurati: numero dei nodi, lunghezza del fusto, numero delle foglie,
e peso fresco.
-K+
CTR
Figura 2. Parametri fisiologica di crescita misurati nel corso dell’esperimento di stress nutrizionale.
Come si può osservare dai grafici riportati in figura, non sono state riscontrate differenze
significative nei parametri di crescita misurati nelle piante sottoposte a stress rispetto a quello di
controllo nel periodo di tempo nel quale sono state fatte le misurazioni.
Valutazione del contenuto di amido nelle foglie.
85
L’amido è un polimero del glucosio che funge da riserva dei carboidrati, nelle piante verdi. La
produzione di amido avviene durante il giorno, a partire da molecole di glucosio. Forma di
accumulo di questo polimero sono grossi granuli nello stroma del cloroplasto. Tale distribuzione
semi-cristallina nei granuli, rende l’amido praticamente insolubile, quindi per essere trasportato
deve essere degradato e dunque idrolizzato a glucosio. Durante la notte l’amido, accumulato e
prodotto di giorno grazie alla fotosintesi, viene quindi riconvertito in zuccheri e contribuisce a
soddisfare le esigenze metaboliche della pianta.
Il potassio non va a costituire direttamente le macromolecole ma è un’importante cofattore per
molte reazioni cellulari. Essendo anche un cofattore importante per gli enzimi responsabili della
sintesi dell’amido (Amtmann and Armengaud 2009) si pensa sia direttamente coinvolto nella
biosintesi e nell'accumulo dello stesso nella pianta. Eventuali alterazioni nella disponibilità e nel
successivo accumulo di potassio potrebbero quindi determinare alcune variazioni nella
concentrazione di amido nella pianta.
Si è quindi realizzata un’analisi qualitativa del contenuto di amido in foglie emerse dopo l’inizio del
trattamento, mediante colorazione “Lugol”. Il risultato ottenuto è presentato in Fig. 3.
Contenuto di amido relativo
250
200
150
Figura 3 Contenuto di amido in foglie di piante di controllo (blu)
100
e sottoposte a stress da carenza di potassio (rosso). P-value:
2,05649E-07
50
CTR
-K
0
Dall’istogramma ottenuto risulta chiaro che vi è una differenza statisticamente significativa del
contenuto fogliare di potassio che nelle piante sottoposte a stress è di circa il 50% rispetto ai
controlli. La carenza di potassio determina perciò una riduzione consistente del contenuto di amido
nelle foglie delle piante trattate. Se questo sia dovuto ad una ridotta sintesi o ad un’aumentata
degradazione non è possibile dirlo al momento ed ulteriori analisi saranno perciò necessarie.
Ionomica delle foglie di Glera
Questo studio è stato realizzato per capire se e come varia il contenuto di alcuni ioni in conseguenza
alla carenza nelle piante trattate rispetto ai controlli.
86
Nella Fig. 4 sono riportati i dati per alcuni ioni analizzati. Dai grafici si evince che le principali
differenze tra piante di controllo e piante sottoposte allo stress sta nel contenuto di potassio e
magnesio mentre non si sono riscontrate differenze significative per quanto riguarda altri elementi.
Figura 4. Ionomica
Tale dato ci dà perciò una misura dell’entità dell’effetto che ha avuto lo stress sulla composizione
minerale dei tessuti della pianta.
Analisi di espressione genica
Per l’analisi molecolare dei meccanismi che vengono attivati in risposta allo stress nutrizionali si è
seguito il profilo di espressione di alcuni geni importanti, soprattutto nella fase di percezione dello
stress. Tali geni marcatori (vedi tabella 1) sono principalmente geni che codificano per canali e
trasportatori del potassio.
GENI ANALIZZATI
• Akt1: canale del potassio
• Hak5: trasportatore del potassio
• Kup3: trasportatore del potassio
• Kea5: trasportatore del potassio
• Chx17: trasportatore del potassio
• Aca1: pompa del calcio
• Nrt2.1: trasportatore del nitrato
Tabella 1
87
I livelli di espressione dei geni di interesse sono stati valutati mediante RT-PCR e riportati in Fig. 5.
Nella Fig. 5 sono riportati i risultati relativi ai profili di espressione genica in apici e radici di piante
di Glera sottoposte a stress.
Figura 5. analisi per RT-PCR di geni marcatori di stress in apici e radici di Glera. I valori riportati sono normalizzati
rispetto al controllo non trattato.
Una più approfondita analisi molecolare delle piante sottoposte allo stress nutrizionale è stata
ottenuta mediante un approccio trascrittomico che si è avvalso dell’uso del sequenziatore SOLiD
5500 XL. Il sequenziatore di ultima generazione SOLiD, del centro CRIBI dell’Università di
Padova, ha permesso di ottenere 150 milioni di sequenze di RNA da ogni campione.
È stata sviluppata una piattaforma per l’analisi del trascrittoma basata sul sistema di allineamento
PASS. Essendo il primo esperimento di RNA-Seq effettuato su Prosecco si è deciso di effettuare
un’annotazione cultivar specifica dei siti di “splicing” e dei polimorfismi a singolo nucleotide
(SNP) in relazione al cultivar di riferimento (Pinot nero PN40024). I dati così ottenuti saranno
rilasciati in un database accessibile alla comunità scientifica.
Questo esperimento ha innanzitutto fornito la sequenza dei geni di Glera fornendo un notevole
contributo a chi studia la biologia molecolare di questo cultivar (fino ad oggi si è usata la sequenza
di un Pinot Noir sequenziato nel 2007). L’analisi ha permesso di confermare il ruolo dei
trasportatori di membrana per la risposta allo stress.
88
5.5 CONCLUSIONI
In questo lavoro sono stati studiati gli effetti della carenza da potassio sulla crescita, sullo sviluppo
e sull'espressione genica in piante di V. vinifera della varietà Glera clone ISV-ESAV 10. In
particolare è stata condotta una caratterizzazione fisiologica e molecolare della risposta allo stress
nutrizionale in piante coltivate in soluzione idroponica, in condizioni di temperatura e luminosità
controllate. Dall’analisi dei differenti risultati ottenuti si deduce che le piante di Glera nel periodo di
durata dell’esperimento (4 settimane) non mostrano evidenti segni di sofferenza per la mancanza di
apporto di potassio. Tuttavia il contenuto di ioni, amido e l’espressione genica sono sensibilmente
alterati fin dall’inizio del trattamento e cioè molto prima di quando eventualmente appaiono i primi
segni di sofferenza della pianta. L’approccio trascrittomico ha permesso di valutare quali siano i
meccanismi molecolari immediatamente attivati dalla pianta in seguito alla percezione delle alterate
condizioni ambientali. L’approccio sperimentale usato inoltre ci ha mostrato come nelle condizioni
controllate di coltura idroponica è possibile ottenere dati riproducibili e consistenti in quanto è
possibile variare solo un parametro senza alterare tutti gli altri.
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89
5. Valutazione economica delle tecniche proposte e loro valorizzazione in termini
di strategie di marketing
di Vasco Boatto – CIRVE Centro Interdipartimentale per la Ricerca in Viticoltura ed Enologia
1. MODALITÀ DI VALUTAZIONE ECONOMICA DEI RISULTATI
CONSEGUITI
Il progetto esecutivo di ValViVe prevede che la valutazione economica ex-post dei risultati relativi
alle singole ricerche venga eseguita mediante l’analisi costi-benefici e l’analisi del rischio.
Normalmente l’analisi costi-benefici2 di una qualsiasi iniziativa prevede sia un’analisi finanziaria
che un’analisi economica. La prima verifica la sostenibilità finanziaria dell’iniziativa (copertura
delle spese) ed il suo rendimento finanziario in base ai flussi di cassa, facendo riferimento
esclusivamente al soggetto che realizza l’iniziativa. La seconda si effettua per determinare se ed in
che misura l’iniziativa è conveniente secondo una prospettiva pubblica o sociale; in altre parole
considera tutti i guadagni e le perdite indipendentemente dal soggetto a cui si riferiscono. Nel nostro
caso, tenuto conto che l’obiettivo è valutare i risvolti economici per il settore vitivinicolo regionale,
è stata effettuata esclusivamente l’analisi economica.
Premesso che il progetto si è appena concluso e che quindi i risultati delle ricerche che ne facevano
parte non hanno ancora trovato pratica applicazione, fatta eccezione per qualche prova sperimentale
relativa ad alcune di esse e che non tutte le ricerche prevedevano ricadute immediatamente
applicabili alla realtà produttiva, in primo luogo si è reso necessario definire tali ricadute, con la
collaborazione degli stessi ricercatori. A questo proposito le ricerche che componevano il progetto
sono raggruppabili in due categorie (Allegato A):
 quelle con effetto nel breve periodo, definite proprio per questo di tipo competitivo, tese
all’identificazione varietale, allo sfruttamento della plasticità fenotipica ed al miglioramento del
processo di vinificazione;
2
AA.VV.: Guida all’analisi costi- benefici dei progetti di investimento (Fondi Strutturali, Fondo di Coesione e ISPA);
Preparata per: Unità di Valutazione, DG Politica Regionale e Coesione, Commissione Europea; 2003.
Alberigi Quaranta A.; Giovannini A.; Rago S.: Sulla valutazione degli investimenti per ricerca e sviluppo (L'Industria –
n. 3, 1982).
Burton A.WEISBROD: Costs and Benefits of Medical Research: A Case Study of Poliomyelitis; “The Journal of
Political Economy”, 1971.
Mishan E.J.: L’abc dell’analisi costi benefici – Tratto da “Mercurio”: Anno XV, n. 2 febbraio 1972.
90
 quelle in grado di produrre risultati pratici sul settore vitivinicolo soltanto nel medio e lungo
periodo, considerate quindi di tipo pre-competitivo, relative al miglioramento qualitativo delle
uve, alla resistenza dei vitigni agli stress ed a particolari pratiche di coltivazione e vinificazione.
In pratica queste ultime ricerche necessitano di ulteriori passaggi ed approfondimenti per pervenire
a risultati concreti, la cui valutazione si presenta, pertanto, assai più difficoltosa.
A livello micro-economico (singola azienda) il valore delle innovazioni originate dalle ricadute
delle ricerche in esame in generale è determinato dal valore dei benefici prodotti da ciascuna
innovazione, dal quale bisogna detrarre i costi da sostenere per ottenere tali benefici. Inoltre,
dipende dal grado di rischio che presenta la sua applicazione, cioè dalle probabilità che non si
concretizzino effettivamente i benefici previsti e dal danno che questo evento comporterebbe.
Riguardo invece al valore complessivo di ciascuna innovazione (livello macro-economico),
prudenzialmente si sono considerati soltanto i benefici diretti, cioè quelli che vanno a vantaggio
delle aziende che applicano concretamente l’innovazione, escludendo tutti quegli operatori
dell’indotto che potrebbero trarne un ulteriore vantaggio. Di conseguenza tale valore è determinato
dal valore netto aziendale dell’innovazione e dal numero di operatori che la adottano, o meglio dalla
quantità di produzione alla quale verrà applicata. Pertanto un aspetto che influisce in misura
sostanziale sulla valutazione macro-economica di un’innovazione è rappresentato dal livello di
diffusione ad essa attribuibile. I fattori in grado di influire sull’adozione3 di un’innovazione sono: a)
la consapevolezza da parte dei potenziali utilizzatori della bontà dell’innovazione, determinata sia
dal grado di coinvolgimento nelle scelte e nelle decisioni alla base del progetto di ricerca, sia dalla
rispondenza degli obiettivi della ricerca con i bisogni degli utilizzatori stessi; b) l’efficacia della
divulgazione dei contenuti dell’innovazione e dell’assistenza tecnica per la loro applicazione
pratica; c) i problemi connessi all’applicazione dell’innovazione, che possono essere di natura
economica (necessità di investimenti), di natura tecnica (capacità di apprendimento ed esecuzione
delle nuove pratiche) e di natura culturale (ricettività ai cambiamenti). Ne consegue che per
garantire il successo di un progetto di ricerca, oltre alla consonanza che deve esserci tra gli obiettivi
conseguiti e le effettive esigenze dei produttori, è fondamentale organizzare e realizzare un
adeguato e mirato percorso di divulgazione dei risultati, meglio se supportato anche da iniziative di
assistenza tecnica basata su di un rapporto continuativo tra tecnico e produttore. Perché tutto ciò
3
Un recente studio dell’INEA (I percorsi della ricerca scientifica e la diffusione dell’innovazione – Il caso
dell’agricoltura piemontese; INEA 2007) nell’effettuare la valutazione di sei progetti di ricerca affronta le
problematiche della diffusione reale e potenziale delle relative innovazioni, mettendo in evidenza i fattori che la
favoriscono e la condizionano.
91
avvenga in modo efficace ed efficiente è necessario l’esercizio di una vera e propria azione di
coordinamento da parte di un soggetto in grado di svolgerla ed al quale è unanimemente
riconosciuto questo ruolo, e la costruzione di una “rete” per favorire il rapporto tra i soggetti
interessati.
Infine, l’analisi del rischio ha lo scopo di valutare il danno economico che si verificherebbe qualora
le ricadute delle ricerche considerate dovessero risultare non o scarsamente efficaci. In concreto,
comporta l’individuazione del possibile effetto dannoso, la determinazione della sua entità e della
probabilità che il danno si verifichi. Anche in questo caso tale valutazione si presenta
particolarmente difficoltosa soprattutto per le ricerche di tipo pre-competitivo, per le quali mancano
ancora risultati certi e concreti.
Passando ora alle modalità per la determinazione vera e propria del valore economico dei benefici
relativi alle ricadute o innovazioni prodotte dalle ricerche in esame, è stata messa a punto una
specifica procedura composta dalle seguenti operazioni:
a. formulazione di un partial budget4 (Allegato B) per ciascuna nuova tecnica innovativa; in
pratica si tratta di un bilancio, relativo ad un qualsiasi processo produttivo, con il quale si
prendono in considerazione soltanto gli effetti economici conseguenti ai cambiamenti introdotti
nel processo in esame; è articolato in due sezioni: effetti positivi (nuovi redditi e costi non
sostenuti) ed effetti negativi (mancati redditi e nuovi costi); la differenza algebrica tra gli effetti
positivi e quelli negativi costituisce l’utile o la perdita della nuova tecnica a livello di singola
azienda; nella scheda che contiene il partial budget è presente anche uno spazio per la
rilevazione delle problematiche relative all’implementazione dell’innovazione, che possono dar
luogo ad eventuali nuovi costi, e degli aspetti relativi alla sua rischiosità;
b. determinazione per ciascun partial budget rilevato dell’utile o perdita dell’innovazione
correlata;
c. rettifica dei risultati aziendali, come sopra determinati, per tener conto del rischio calcolato sulla
base dei dati rilevati (probabilità di accadimento x valore del danno);
d. stima del valore economico complessivo di ciascuna innovazione prodotta, mediante estensione
all’intero distretto del vino veneto5 dei risultati calcolati a livello microeconomico; in effetti tale
operazione richiede preventivamente, per ogni tecnica innovativa, la quantificazione della
produzione che potrà beneficiarne.
4
AA.VV. : Using the partial budget to analyze farm change (Maryland Cooperative Extension – University of
Maryland; 1991).
Craig Chase: Using partial budgets to make decisions (Iowa State University – University Extension; maggio 2010).
5
Condizione prevista nel “Patto per lo sviluppo del Distretto Veneto del Vino” (Triennio 2007 - 2010).
92
Per quanto riguarda l’analisi delle azioni di marketing da attuare per la valorizzazione delle nuove
tecniche, come previsto nel progetto, è stato predisposto uno specifico questionario-intervista
(Allegato C) inviato poi ad un ampio e qualificato gruppo di organismi del settore, costituito da
circa cinquanta operatori scelti tra i sottoscrittori del secondo Patto. Attraverso tale questionario si
è anche colta l’occasione per verificare la conoscenza degli intervistati riguardo agli obiettivi
generali del progetto ValViVe e per conoscere, in misura molto sintetica, il valore da essi attribuito
alle ricadute pratiche delle singole ricerche e l’interesse alla loro applicazione.
2. RISULTATI DELLE ATTIVITÀ DI RICERCA
Di seguito si riporta una sintesi degli obiettivi di ciascuna delle sette unità di ricerca, delle attività
svolte e dei risultati conseguiti alla fine del progetto (31 dicembre 2010). Tali obiettivi, come già
anticipato nel precedente paragrafo, unitamente ai risultati conseguiti ed alle ricadute previste sul
settore vitivinicolo veneto sono stati ulteriormente sintetizzati nella tavola sinottica di cui
all’Allegato A.
2.1 A – Unità di ricerca n. 16
Nel progetto di ricerca di questa unità erano previsti due obiettivi.
1. Caratterizzazione molecolare del germoplasma viticolo veneto mediante la rilevazione di
polimorfismi di sequenza per una rapida identificazione dei vitigni. Nella prima parte del lavoro
sono state analizzate la diversità genetica e le relazioni filogenetiche in una collezione di vecchi
vitigni autoctoni del Veneto (30 vitigni del comprensorio euganeo), dimostrando che il
germoplasma locale rappresenta una risorsa genetica unica per la viticoltura, la cui scomparsa
equivarrebbe ad una perdita significativa per i futuri programmi di miglioramento genetico,
oltre che dal punto di vista storico-culturale. Successivamente è stato avviato lo sviluppo di
strumenti diagnostici molecolari per il monitoraggio della biodiversità vegetale, capaci di
identificare in modo univoco specie appartenenti allo stesso genere e le varietà appartenenti alla
stessa specie coltivata. La caratterizzazione genetica dei materiali, effettuata con l'impiego di
marcatori microsatelliti, ha permesso di identificare in modo inequivocabile il singolo vitigno.
In pratica è stata messa a punto una piattaforma molecolare che consente di attribuire a ciascuna
varietà di vite una sorta di codice a barre che, potendo identificare in maniera univoca le
singole varietà, potrà costituire un efficace strumento per la protezione delle varietà autoctone,
rappresentando il primo passo di un percorso di tracciabilità a partire dal vivaio/vitigno.
6
Coordinata dalla prof.ssa Margherita Lucchin.
93
2. Applicazione della genomica funzionale allo studio dell’interazione vitigno-ambiente e
caratterizzazione di geni coinvolti in vie metaboliche correlate alla qualità della bacca. Su
alcune cv della collezione sopra citata si è proceduto alla caratterizzazione dei geni che
controllano la sintesi degli stilbeni7, in particolare il resveratrolo, che partecipano alle funzioni
di difesa della pianta, in risposta a stress di natura biotica o abiotica. Quattro vitigni autoctoni
(Friularo, Pattaresca, Gruajo, Cabernet Lispida) sono risultati di particolare interesse per l’alto
contenuto di questo stilbene all’invaiatura ed a maturazione (oltre 15 mg/kg di uva). Questa
caratteristica consente la loro valorizzazione sia per ampliare l'offerta produttiva di vini locali,
sia come fonte di geni in programmi di miglioramento genetico.
La sintesi degli stilbeni nella vite è controllata da una famiglia multigenica piuttosto ampia (da
22 a 43 geni) i cui membri non sono mai stati indagati singolarmente. La caratterizzazione
genomica dell’intera famiglia è stata sviluppata mediante l’identificazione, l’annotazione e lo
studio delle relazioni filogenetiche che intercorrono tra i diversi geni e, successivamente,
valutando il profilo di espressione di ogni gene in dischi fogliari sottoposti a infezioni di
peronospora e a stress di tipo abiotico. Si è così avviato un accurato studio funzionale dei geni
che controllano la sintesi degli stilbeni i cui risultati potranno consentire l’individuazione delle
varianti geniche di maggiore interesse per la resistenza agli stress. I risultati di tale studio,
integrati da adeguate conoscenze sulla regolazione dell’espressione genica e sull’interazione
fenotipo-ambiente, potranno essere utilizzati a fini selettivi.
2.2 B – Unità di ricerca n. 28
Il progetto di ricerca affidato a questa unità aveva come obiettivo la caratterizzazione molecolare
del germoplasma viticolo veneto mediante la rilevazione di polimorfismi di sequenza per una
rapida identificazione dei vitigni9. In pratica è stato eseguito il completo sequenziamento del
genoma (circa 500 milioni di basi nucleotidiche) di due varietà: Prosecco e Merlot. Questo risultato
consente di stabilire univocamente, attraverso un’analisi molto laboriosa e quindi costosa, non solo
se una pianta di vite (o una sua parte) appartiene o meno ad una di queste due varietà, ma anche
eventuali differenze tra varianti locali dello stesso vitigno. In concreto sarebbero necessari ancora
7
Questi composti presenti nelle bacche mature e nel vino sono legati alla salute umana per la loro azione antiossidante
in quanto sono in grado di proteggere l'organismo dalle malattie cardiovascolari e, pare sia dimostrato, prevengono le
insorgenze neoplastiche.
8
Coordinata dal prof. GiorgioValle.
9
Di fatto questa ricerca, basata sull’utilizzo delle basi nucleotidiche, e quella della prof.ssa Lucchin (1° obiettivo),
fondata sui marcatori microsatelliti, costituiscono due diverse tipologie di analisi per addivenire allo stesso risultato:
l’identificazione delle cv.
94
alcuni mesi di lavoro per mettere a punto una procedura di analisi altrettanto sicura dal punto di
vista diagnostico ma assai più praticabile sul piano pratico, in quanto basata sull’utilizzo di alcune
decine di migliaia di marcatori10 (basi nucleotidiche del DNA), e quindi più accessibile anche
economicamente11. Comunque per estendere questa nuova procedura di analisi agli altri vitigni
veneti è necessario applicarla prima in via sperimentale (per testarla) su alcuni esemplari
sicuramente appartenenti a ciascuna cv. Successivamente questa tecnica innovativa potrebbe
costituire un vero e proprio servizio12 a sostegno della competitività, in quanto i singoli produttori
potrebbero garantire l’origine della propria produzione vitivinicola attraverso l’avvio di un percorso
di tracciabilità.
2.3 C – Unità di ricerca n. 313
L’obiettivo di questa unità era lo studio dell’interazione vitigno-ambiente mediante l’applicazione
della genomica funzionale, con particolare riferimento alla relazione che intercorre tra il genotipo
del clone 48 di Corvina14 e il territorio veronese, le sue caratteristiche fisico-chimiche e le peculiari
pratiche agronomiche in esso utilizzate15. Dalle prime analisi del trascrittoma16 si è osservato come
10
Per avere un’idea della portata di questa nuova pratica basta pensare che attualmente l’analisi del genoma della vite si
effettua utilizzando poche decine di marcatori, ottenendo però risultati molto generici.
11
Attualmente si può ipotizzare un costo massimo di 400 € per analisi. In effetti questo costo è soggetto a modificarsi in
diminuzione molto velocemente grazie alla ricerca ed all’evoluzione tecnologica; basti pensare che nel giro di 3-4 anni
si è ridotto di 100 volte ed ancora potrà ridursi nel prossimo futuro.
12
L’applicazione concreta di questa tecnica di analisi coinvolge fondamentalmente tre soggetti: il produttore (vivaista o
viticoltore), il tecnico con la specifica funzione di raccogliere, tramite appositi kit di conservazione, il materiale da
analizzare ed infine il laboratorio in grado di eseguire l’analisi genetica.
13
Coordinata dal prof. Mario Pezzotti.
14
Questa cultivar, assieme alla Rondinella ed alla Molinara, costituisce la principale componente per la produzione del
vino Amarone che, assieme al Recioto, rappresenta la tipicità per eccellenza della produzione vinicola della provincia
veronese; in particolare il clone 48 di Corvina è quello più utilizzato nella pratica vinicola locale.
15
Durante tre stagioni produttive consecutive (2006, 2007 e 2008) sono state raccolte bacche del clone 48 di uva
Corvina in tre diversi stadi di sviluppo: il primo, corrispondente all’ invaiatura (veraison), è il periodo durante il quale
la bacca subisce i cambiamenti maggiori, diventando più morbida e dolce, perdendo acidità ed assumendo colore ed
aromaticità; negli altri due stadi di sviluppo presi in esame, corrispondenti agli stadi fenologici della pre-maturazione e
della maturazione, nella bacca si verifica un flusso di tipo floematico e l’accumulo di composti volatili ed altri
metaboliti secondari, determinanti per la formazione dell’aroma, del sapore e del profumo caratteristici del vino, quali i
terpenoidi ed i polifenoli. Le bacche raccolte provenivano da undici aziende viti-vinicole distribuite nelle tre macro-aree
geografiche più importanti per la produzione di vino locale (Soave, Bardolino e Valpolicella) e caratterizzate sia sulla
base degli aspetti ambientali che delle pratiche agronomiche utilizzate. Le caratteristiche considerate sono state:
l’altitudine del vigneto (da 100 a 450 metri sul livello del mare), il tipo di suolo (da sabbioso ad argilloso e da poco ad
95
la plasticità fenotipica sia un fenomeno ben rappresentato, infatti circa il 10% del totale dei trascritti
è utilizzato dal genoma per risposte ed arrangiamenti “plastici”. Durante lo sviluppo della bacca,
circa 2900 geni mostrano una modulazione significativamente diversa nelle varie aziende. Inoltre, si
è potuto evincere che il trascrittoma di vite è altamente plastico durante le varie annate prese in
esame. Le variazioni di trascritti e metaboliti sono state messe in relazione con specifiche
caratteristiche ambientali e con le diverse pratiche agronomiche utilizzate. Se ne è dedotto che il
trascrittoma di vite risponde e si plasma più in base ad attività e consuetudini agronomiche
apportate dall’uomo che a caratteristiche prettamente naturali, come il tipo di suolo, l’altitudine o
l’età del vigneto. Grazie all’ampio campionamento, protrattosi nell’arco delle tre annate vitivinicole
considerate, si è potuto anche verificare come il trascrittoma di vite reagisca in modo plastico ad
eventi atmosferici specifici di ogni stagione produttiva.
Da questo studio si possono trarre alcuni benefici pratici per la coltivazione della vite e la
produzione di vino di qualità costante nel tempo. Innanzi tutto, al momento della progettazione
dell’impianto di un nuovo vitigno, il produttore potrà fare alcune scelte agronomiche (forma di
allevamento, tipo di orientazione del filare, portainnesto) in relazione alle caratteristiche del vino
che desidera ottenere (maggior contenuto in polifenoli, maggior contenuto in zuccheri riduttori,
etc). Secondariamente, tramite campionamenti su piccola scala17, analisi trascrittomiche e
monitoraggio di alcuni geni “markers”, il produttore potrà fare una stima dell’andamento della
stagione produttiva in relazione ad eventi atmosferici (ad esempio, un forte innalzamento della
temperatura durante la fioritura) ed agire di conseguenza con pratiche di “viticoltura assistita”.
2.4 D – Unità di ricerca n. 418
L’obiettivo di questa unità era lo studio degli effetti dei trattamenti ormonali sulla compattezza del
grappolo, con particolare riferimento alla cv Raboso Piave.
Nel primo anno di attività è stata testata l’efficacia di un prodotto auxinico-analogo (3,5,6-tricloro2-piridilossiacetico, 3, 5, 6 TPA) come diradante fiorale; al fine di valutarne l’effetto è stata
condotta una prova anche sulla cv Pinot grigio. I risultati delle osservazioni preliminari indicano la
sua efficacia solamente sulla cv di Pinot grigio, mentre sul Raboso Piave gli effetti non sono stati
altamente calcareo), l’età del vigneto (da 6 a 18 anni). Per quanto riguarda le pratiche agronomiche e di allevamento
sono state considerate la forma di allevamento utilizzata (spalliera Guyot o forme a pergola), la direzione dei filari
(nord-sud o est-ovest), il sesto d’impianto e il portainnesto utilizzato (K5BB, 420A, 41B, SO4).
16
RNA messaggero.
17
E’ previsto il prelievo di tre campioni per ciascun tipo di verifica che si vuole realizzare; l’analisi di ciascun campione
ha un costo di circa 400 euro.
18
Coordinata dal prof. Angelo Ramina.
96
significativi. In pratica la sua efficacia sul Pinot grigio è stata condizionata principalmente
dall’epoca di somministrazione ed in misura minore dalle dosi impiegate. Il diradante si è
dimostrato in grado di ridurre sensibilmente l’indice di compattezza del grappolo a fronte, però, di
una maggiore dimensione finale della bacca19. Dati simili erano stati ottenuti impiegando anche
l’acido gibberellico la cui applicazione, però, è fortemente dipendente dalla concentrazione, oltre al
fatto che la finestra temporale relativa alla sua applicazione è più ristretta, al contrario dell’ormone
auxinico che presenta una finestra temporale più ampia.
Nel secondo anno di attività (2010) è stato provato sul Raboso Piave20 un nuovo prodotto, costituito
da una miscela di gibberelline ed auxine, che sembra essersi dimostrato particolarmente positivo in
quanto: a) la minore produzione di acini è parzialmente compensata dal loro maggior accrescimento
(+50%), conseguente all’allungamento del rachide; in sostanza il peso del grappolo trattato risulta
comunque minore rispetto a quello del testimone di circa il 50%, il che comporta il dimezzamento
della produzione complessiva; b) la diversa conformazione del grappolo, dovuta alla sua minore
compattezza, ostacola gli attacchi di botrite e quindi ne favorisce l’appassimento sulla pianta con
conseguente “potenziale” miglioramento delle caratteristiche organolettiche dell’uva.
Qualora gli attuali risultati fossero confermati da ulteriori prove sperimentali e fosse accertato
l’effettivo miglioramento della qualità del prodotto, tale innovazione potrebbe essere utilizzata con
successo per la lotta alla botrite. Riguardo alle prove sperimentali ancora necessarie (almeno per
altri 2-3 anni), queste dovrebbero verificare in particolare l’assenza di effetti collaterali (ad es. sulla
fertilità dei fiori) conseguenti ai trattamenti ormonali e quindi stabilire la loro ininfluenza sulle
produzioni future.
19
La produzione per ceppo è risultata mediamente più bassa rispetto al testimone del 40%; i minori livelli produttivi
hanno comportato un incremento degli zuccheri nelle bacche delle tesi trattate in prima epoca con le concentrazioni più
alte (250 e 375 ml/ha) di oltre 1,5 °Brix; per quanto riguarda il pH sono stati registrati lievi incrementi, mentre i valori
di acidità titolabile sono risultati sensibilmente più bassi rispetto al testimone; il rapporto tra i solidi solubili totali e
l’acidità totale è risultato più elevato nella tesi trattata con la concentrazione di 250 ml/ha indicando una migliore
palatabilità delle uve; il rapporto tra buccia e polpa, invece, è risultato più basso nelle tesi trattate a conferma del
maggiore accrescimento finale delle bacche delle tesi trattate in confronto al controllo.
20
La prova è stata eseguita nell’Azienda agricola Giorgio Cecchetto (Tezze di Piave - Vazzola).
97
2.5 E – Unità di ricerca n. 521
L’obiettivo specifico di questa ricerca era l’identificazione di geni la cui espressione è modulata in
funzione di differenti condizioni di disponibilità dei principali nutrienti e che sono relativi a vie
metaboliche (zuccheri) che influenzano la qualità dell’uva. Nella prima fase della ricerca (2009) è
stata realizzata una serie di attività finalizzate alla messa a punto del sistema sperimentale. In
particolare è stata definita la tecnica di coltivazione idroponica della vite (cv. Prosecco), per
superare i vincoli (es.: stagionalità) legati alla coltivazione nell’ambiente esterno; sono state
amplificate e uniformate le piante necessarie per gli esperimenti; si sono stabiliti i tempi di
radicazione e crescita delle piante in idroponica; sono stati valutati parametri fisiologici quali
l’efficienza fotosintetica e il contenuto di potassio22, calcio e magnesio nelle foglie.
Successivamente, nel 2010, sono state condotte le prove di stress nutrizionale attraverso l’uso di
substrati con diverse carenze di elementi nutritivi. Per concludere definitivamente la ricerca manca
l’individuazione dei geni regolatori, che vengono attivati dalle carenze nutrizionali, mediante
l’analisi del trascrittoma, che è costituito dalle molecole di RNA messaggero prodotte da tali geni.
L’effettiva conclusione di questa ricerca, che richiede ancora 3-4 anni di attività sperimentali, potrà
consentire la messa a punto di un facile e veloce sistema di valutazione, attraverso l’analisi dei
tessuti, degli stress nutrizionali in atto nella vite.
2.6 F – Unità di ricerca n. 623
L’obiettivo della ricerca era la stabilizzazione proteica24 dei vini bianchi mediante lo sfruttamento
delle potenzialità di un fungo fitopatogeno (Sclerotinia minor). In pratica sono state provate due
21
Coordinata dalla prof.ssa Michela Zottini.
22
Nella vite il K+ è uno dei più importanti nutrienti, essendo il principale catione presente nella bacca; la sua carenza
influenza negativamente la resa e la concentrazione di composti solubili nella bacca, ma un livello eccessivamente alto,
innalzandone il pH, può avere un impatto negativo sulla qualità della bacca e del vino.
23
24
Coordinata dal prof. Andrea Curioni.
Normalmente la stabilizzazione dei vini bianchi nei confronti dei fenomeni di intorbidamento proteico viene
realizzata attraverso l’uso della bentonite (materiale assorbente piuttosto aspecifico). La dose da impiegare viene
determinata mediante l’analisi d’instabilità proteica (bentotest o riscaldamento in presenza o assenza di tannino); il
trattamento viene normalmente eseguito mediante travaso o rimontaggio con immissione della bentonite utilizzando un
tubo Venturi; dopo qualche giorno si ha il deposito completo della bentonite sul fondo della vasca e si può procedere ad
un travaso per recuperare il vino stabilizzato. Tale sistema produce, però, sia un impoverimento del quadro
organolettico del vino, sia una perdita quantitativa, per effetto dell’assorbimento, pari a circa il 5% del vino trattato. In
effetti quest’ultima quantità può essere recuperata quasi interamente mediante filtrazione sotto vuoto o tangenziale
oppure centrifuga più filtrazione a cartoni (probabilmente la maggior parte delle cantine venete ricorre alla filtrazione
sotto vuoto; solo quelle più grandi utilizzano il filtro tangenziale che consente di diminuire un po’ i costi); in ogni caso
98
vie: la prima basata sull’uso di un enzima proteolitico (proteasi) prodotto dal fungo in questione; la
seconda utilizzando un polisaccaride (scleroglucano) sempre prodotto dallo stesso fungo.
Per quanto riguarda la possibilità di utilizzare la proteasi, che è il metodo risultato più valido, alla
fine del progetto si è giunti alla conclusione che sono comunque necessari ulteriori
approfondimenti. Queste nuove prove, per la cui realizzazione si prevede almeno un altro anno di
lavoro, avranno un duplice scopo: a) individuare le modalità migliori per la produzione dell’enzima
ad uso commerciale; b) eseguire delle prove di cantina25, considerato che fino ad ora sono state
realizzate solo prove di microvinificazione; in particolare le prove di cantina dovranno confermare
la possibilità di non dover ripetere l’intervento per ottenere la stabilizzazione voluta. In sostanza
l’uso dell’enzima, in sostituzione della bentonite per la stabilizzazione proteica dei vini bianchi26,
sembra che produca un duplice vantaggio: nessuna perdita di vino e miglioramento delle qualità
organolettiche del prodotto.
Riguardo infine all’uso dello scleroglucano, questo non è ancora praticabile in quanto necessita di
ulteriori studi; in particolare il suo utilizzo sarà realizzabile quando sarà stato eliminato
l’inconveniente della sua solubilità nel vino stesso.
2.7 G – Unità di ricerca n. 727
La ricerca aveva tre obiettivi.
1. Identificazione dei ceppi di lievito più adatti alla produzione di vini veneti. Inizialmente,
utilizzando dieci ceppi selezionati dalla vasta collezione di ceppi veneti, sono state eseguite
altrettante microvinificazioni su uve di Raboso Piave, il cui prodotto è stato sottoposto ad analisi
sensoriale. Da questi dieci è stato quindi individuato un gruppo di tre ceppi utilizzati per
realizzare delle prove di vinificazione in azienda28 sempre su uve di Raboso Piave, sul cui
prodotto sono state eseguite sia analisi sensoriali che analisi chimiche (confrontando i risultati
con quelli relativi al vino Raboso P. di controllo ottenuto con il lievito commerciale
il vino così recuperato è di qualità inferiore a quello precedentemente travasato. Inoltre c’è anche il problema dello
smaltimento della bentonite impregnata di vino.
25
26
L’utilizzo dell’enzima si effettua semplicemente mediante la sua aggiunta al mosto da trattare.
Le sperimentazioni effettuate hanno riguardato fondamentalmente la fermentazione primaria, di conseguenza la
proteasi potrebbe essere usata, in teoria, anche per i vini bianchi frizzanti.
27
Coordinata dal prof. Alessio Giacomini.
28
Aziende che hanno realizzato le vinificazioni sperimentali:
 Azienda agricola Giorgio Cecchetto (Tezze di Piave - Vazzola);
 Tenuta Bonotto Delle Tezze (Tezze di Piave - Vazzola);
 Azienda agricola Giuseppe Cescon (Fossalta Maggiore di Chiarano).
99
tradizionale). In sostanza le analisi sensoriali hanno consentito di stabilire che la qualità del
Raboso Piave prodotto con i lieviti autoctoni è superiore a quella dello stesso tipo di vino
ottenuto con i lieviti tradizionali. Dal gruppo dei tre ceppi è stato poi selezionato un unico
lievito da destinare alla produzione commerciale29, allo scopo di produrre vino Raboso Piave di
particolare qualità (magari specificando in etichetta l’utilizzo del lievito autoctono30).
2. Costruzione di protocolli per la vinificazione personalizzati, mediante lo studio delle condizioni
ottimali di sviluppo microbico nel mosto e nel vino. In fase di attuazione con particolare
riferimento alla presenza dell’azoto; si può arrivare all’individuazione di specifici lieviti
autoctoni da utilizzare per le uve locali ed evidenziare anche le condizioni ottimali d’uso,
specificando la quantità di azoto necessaria e gli aromi prodotti con quella quantità.
3. Produzione di un sistema di etichettatura genetica dei ceppi coinvolti nella sperimentazione in
grado di contribuire alla realizzazione della rintracciabilità tecnologica del prodotto vino. I
ceppi di lievito autoctoni isolati sono tutti geneticamente identificabili grazie alle caratteristiche
genetiche del DNA mitocondriale (si possono evidenziare mediante il profilo di restrizione del
DNA totale), però la loro rintracciabilità è possibile fino alla vinificazione (prima della fase di
filtrazione ed imbottigliamento).
3. VALUTAZIONE ECONOMICA DELLE RICADUTE
In primo luogo bisogna ricordare nuovamente che i risultati delle ricerche in esame non hanno
ancora trovato pratica applicazione, a parte qualche prova sperimentale relativa ad alcune di esse, e
che in ogni caso quasi la metà delle innovazioni da esse originate sono di tipo pre-competitivo, cioè
si potranno mettere in pratica soltanto nel medio e lungo periodo. Pertanto, inizialmente
l’applicazione del partial budget è stata provata nelle tre aziende che avevano preso parte alle prove
sperimentali riguardanti due specifiche ricerche31: a) lotta alla botrite sulla vite di Raboso Piave
29
Riguardo al prezzo di tale lievito, questo dipenderà dalla domanda, dalle politiche di marketing della ditta produttrice
nonché da eventuali accordi commerciali tra questa ed il Consorzio di tutela Vini del Piave. Per le vinificazioni
sperimentali in azienda ne sono stati venduti complessivamente 35 kg (confezioni da 500 g; se ne utilizzano 20 g/hl); il
prezzo praticato per l’occasione è stato di 40 €/kg (prezzo scontato a partire da 48 €/kg che è il prezzo di un lievito
tradizionale).
30
A questo proposito è utile sottolineare che secondo la ditta produttrice (LALLEMAND Italia di Castel D’Azzano –
VR) sarebbe anche possibile denominare il nuovo lievito in modo da evidenziarne l’origine territoriale; per far questo
sarebbe però necessario che ci fosse un effettivo interesse da parte del Consorzio di tutela Vini del Piave. In realtà
sembra che la ditta non abbia rilevato una particolare disponibilità all’utilizzo del lievito autoctono, anche solo a titolo
sperimentale.
31
Come vedremo costituiscono fondamentalmente innovazioni di processo piuttosto che di prodotto.
100
mediante diradamento del grappolo con una miscela ormonale; b) produzione di Raboso Piave di
particolare qualità utilizzando il lievito autoctono selezionato. Particolare attenzione è stata dedicata
alla valutazione delle innovazioni relative alle ricerche di tipo competitivo, proprio perché
applicabili nel breve periodo, ma pure in questo caso l’utilizzo del bilancio parziale si è dimostrato
difficoltoso soprattutto con riferimento alla valutazione economica dei benefici: da un lato, a causa
della sempre non chiara consapevolezza dei potenziali benefici, dall’altro, per la difficoltà ad
attribuire loro l’effettivo apprezzamento da parte del mercato. Talvolta anche il solo giudizio
qualitativo è risultato essere contrastante tra le diverse aziende. Si è deciso quindi di restringere il
campo di applicazione del bilancio parziale alle sole innovazioni sperimentate in azienda, potendo
disporre per ciascuna di esse di risultati più concreti cui fare riferimento. L’esito è stato il seguente:
 produzione di Raboso Piave di qualità con lievito autoctono (innovazione di tipo competitivo):
premesso che l’utilizzo di tale lievito non sembra presentare particolari problemi o rischi
rispetto alla vinificazione tradizionale e che il suo costo si può ipotizzare simile a quello dei
lieviti normalmente utilizzati, l’opinione più diffusa, a fronte di un miglioramento qualitativo
del vino, peraltro non unanimemente riconosciuto, è che quest’ultimo aspetto difficilmente
potrebbe tradursi in un aumento del prezzo di vendita, perché il Raboso già si colloca in una
fascia commerciale abbastanza elevata; l’unica conseguenza ipotizzata potrebbe essere invece
un ulteriore consolidamento del suo mercato, conseguente ad una più spiccata “tipicizzazione”
del prodotto;
 lotta alla botrite sulla vite di Raboso Piave mediante diradamento del grappolo (innovazione di
tipo pre-competitivo): nonostante che l’introduzione pratica di questa nuova tecnica richieda,
come già specificato in precedenza, ancora alcuni anni di attività sperimentali, sono già stati
individuati alcuni aspetti problematici relativi alla sua applicazione: a) l’impiego deve avvenire
nel momento migliore della fioritura: il rispetto di questa condizione dipende prevalentemente
dal rischio piovosità; b) la minore produzione conseguente alla minore compattezza del
grappolo, generalmente molto spargolo, è stata rilevata intorno al 50%; c) il maggior onere in
termini di lavoro per effettuare un veloce intervento manuale di sfogliatura, la cui intensità
dipende dalla forma di allevamento, è in ogni caso molto modesto e si rende comunque
necessario per aumentare la visibilità del grappolo, dalla quale dipende l’efficacia del prodotto
diradante. In generale la valutazione32 di questa innovazione è fortemente condizionata in
termini negativi dalle problematiche appena evidenziate. Infatti, da un lato, la possibilità di
eseguire il trattamento nel momento giusto, determinante ai fini della sua efficacia, è ritenuta un
32
Comprende il giudizio di tutte e tre le aziende sentite, quindi anche delle due che non hanno partecipato alla
sperimentazione.
101
evento non facile da realizzare, dall’altro, la riduzione della produzione di circa la metà è
considerata molto negativa, tanto più che la vite di Raboso già di per sé ha una produttività
incostante. Si ritiene comunque che la forte riduzione della produzione potrebbe essere
accettabile soltanto se fosse accompagnata da un effettivo miglioramento della qualità dell’uva
sulla quale, peraltro, la ricerca non è ancora stata in grado di fornire indicazioni precise e
qualcuno avanza dubbi sul fatto che si possa realmente verificare, proprio a causa
dell’ingrossamento degli acini. Qualcun altro contesta addirittura la necessità di specifici
trattamenti antibotrici, a parte qualche rapido intervento di defogliatura meccanica. In ultima
analisi anche qualora si verificasse la migliore delle ipotesi, cioè il trattamento diradante fosse
eseguito in maniera tempestiva e si realizzasse l’ipotizzato miglioramento qualitativo del
prodotto, che potrebbe comportare un incremento del valore unitario dell’uva “stimato” al
massimo intorno al 50%, a fronte di una riduzione della produzione “accertata” pari a quasi la
metà, si registrerebbe comunque un minor valore della produzione complessiva di circa il 2025%, risultando quasi ininfluente il mancato costo relativo ai trattamenti antibotrici non eseguiti.
Su di una terza innovazione, relativa alla stabilizzazione proteica dei vini bianchi con la proteasi
prodotta dal fungo Sclerotinia minor (innovazione di tipo competitivo), si è potuto realizzare
un’altra applicazione del partial budget, avendo come riferimento una dettagliata analisi dei costi33
fornita dagli stessi ricercatori e riguardante la stabilizzazione con la bentonite. In questo caso sono
state interessate complessivamente quattro aziende, comprendenti le tre già coinvolte nelle prove
sperimentali di cui sopra. Premesso che si ritiene non esistano particolari problematiche relative
all’utilizzo dell’enzima in questione, tenuto conto anche della modestissima quantità necessaria,
questa innovazione è valutata molto positivamente perché non presenta le controindicazioni della
bentonite. Infatti quest’ultima talvolta richiede più di un intervento e spesso rischia di annullare
quasi completamente tutto il lavoro fatto in vigneto per produrre un’uva di qualità, perché
neutralizza anche i composti che stanno alla base della qualità stessa. In termini di valore, però, non
tutti concordano sul fatto che l’utilizzo della proteasi possa tradursi in un generalizzato aumento del
prezzo del vino come riconoscimento della migliorata qualità. C’è chi stima un possibile incremento
massimo del 10%, chi invece ritiene che l’eventuale aumento del prezzo potrà riguardare soprattutto
i vini bianchi di minor pregio, in quanto partono da prezzi più bassi, chi infine pensa che l’uso
dell’enzima proteasi possa essere limitato ai soli vini bianchi fermi, perché nel caso dei frizzanti la
33
Analisi instabilità proteica (metodo riscaldamento più tannino): 13,50 €/100hl; trattamento con bentonite
(ammortamento pompa, manodopera e bentonite): 55,00 €/100hl; travaso per recuperare il vino stabilizzato
(ammortamento pompa e manodopera): 40,00 €/100hl; filtrazione con filtro sottovuoto del deposito rimasto
(ammortamento del filtro, coadiuvanti di filtrazione, manodopera e smaltimento residui): 270,00 €/100hl.
102
sua efficacia potrebbe essere compromessa a causa delle basse temperature di lavorazione. In ultima
analisi, sulla base dei dati economici forniti dai ricercatori, il valore dell’innovazione in esame
sarebbe di circa 2,30 €/hl, solo in termini di minori costi (costi non sostenuti meno nuovi costi)34 e
tralasciando il valore del vino non perduto, comunque molto modesto. Moltiplicando questo valore
unitario per la quantità dei vini bianchi prodotti mediamente in Veneto 35 risulta che il valore
complessivo annuo di questa innovazione di tipo competitivo sarebbe di oltre 10 milioni di euro,
sotto forma di incremento del valore aggiunto a favore dei produttori.
Riguardo alla valutazione di tutte le altre innovazioni, per quanto detto in premessa di questo
paragrafo in merito all’impossibilità di attribuire valori realistici a benefici non sempre
quantificabili e talvolta anche incerti, si è ritenuto opportuno far riferimento alle rilevazioni di tipo
qualitativo realizzate con il questionario-intervista. Questa scelta però comporta fondamentalmente
due limiti: l’impossibilità di quantificare il valore economico delle singole innovazioni e
l’incertezza che comunque caratterizza il loro valore qualitativo, soprattutto a causa della modesta
conoscenza dei contenuti del progetto ValViVe da parte degli intervistati.
Rispetto a quest’ultimo aspetto si evidenzia la difficoltà per questo tipo di ricerche, che hanno un
elevato contenuto di originalità ed innovatività, di realizzare una partecipazione attiva e propositiva
da parte dei produttori. Questi infatti hanno dichiarato a conclusione del lavoro svolto, nel 90% dei
casi (Grafico 1), di avere difficoltà a comprendere i contenuti delle attività di ricerca e
conseguentemente ad esprimere un giudizio sulla loro efficacia. E’ questa una problematica
frequente soprattutto per ricerche a forte valenza precompetitiva, dove la distanza tra il contenuto
scientifico proprio della ricerca e la conoscenza dello stesso da parte dei potenziali fruitori finali è
molto accentuata. Lo studio36 di altri casi di ricerca ha consentito di ipotizzare la soluzione di
questo problema attraverso un intenso e capillare lavoro preparatorio sui temi della ricerca da parte
dell’assistenza tecnica, nel motivare l’ampiezza dei diversi aspetti oggetto della ricerca stessa
nonché le aspettative sui risultati attesi. Nel caso in esame questa operazione di comunicazione
sembra essere stata carente.
34
Costo complessivo non sostenuto relativo all’uso della bentonite: 3,78 €/hl; costo presunto dell’enzima proteasi: 1,50
€/hl.
35
Produzione veneta vini bianchi: anno 2007 hl 3.964.764; anno 2008 hl 4.321.380; anno 2009 hl 5.123.380;
produzione media del triennio 2007-2009 hl 4.469.841 (Fonte: ISTAT, utilizzazione della produzione di uva).
36
Vedi studio INEA citato in precedenza.
103
Grafico 1 - Conoscenza degli obiettivi del Progetto ValViVe da parte dei
rappresentanti delle aziende vitivinicole intervistate
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Nulla
Modesta
Buona
Si è inoltre rilevata una scarsa attenzione nei confronti dei risultati del progetto da parte della
maggioranza degli stessi sottoscrittori del Patto di sviluppo, considerando che coloro che hanno
risposto al questionario rappresentano poco meno di un quarto del gruppo di operatori ai quali era
stato inviato. In ogni caso coloro che hanno accettato l’intervista rappresentano un po’ tutte le
dimensioni produttive, dalle più piccole alle più grandi.
Considerando la valutazione delle innovazioni, si vede che quelle di tipo competitivo, le prime sei
del grafico sotto riportato (Grafico 2), hanno ottenuto un grado di apprezzamento positivo
relativamente più omogeneo, rispetto alle restanti di tipo pre-competitivo, considerato che una
quantità di intervistati oscillante tra il 30 ed il 50% ha attribuito loro un valore buono. D’altra parte
le quattro che hanno avuto la valutazione positiva più alta (cioè la stabilizzazione con la proteasi, la
produzione di Raboso P. con lievito autoctono, l’analisi dei tessuti per la stima della produzione e la
rintracciabilità dei lieviti autoctoni) sono anche quelle che hanno registrato valori nulli in misura
variabile dal 10 al 30%. Quindi è evidente che, nel complesso, l’atteggiamento dei produttori verso
queste nuove tecniche è abbastanza differenziato e probabilmente risente, in una certa misura, del
diverso interesse di ciascuno nei loro confronti. Più variegato appare il giudizio relativo alle
innovazioni di tipo pre-competivo, tre delle quali (cioè la selezione di vitigni resistenti agli stress,
l’individuazione di lieviti autoctoni per la vinificazione di uve locali e l’analisi dei tessuti per la
valutazione degli stress nutrizionali) sono state comunque considerate positivamente da quasi il 7080% degli operatori intervistati. Anche per queste innovazioni è possibile ravvisare una certa
correlazione tra la valutazione e l’interesse ad applicarle, come vedremo tra breve.
104
Grafico 2 - Valutazione sintetica delle innovazioni prodotte dal Progetto ValViVe da
parte dei rappresentanti delle aziende vitivinicole intervistate
Val. nullo
Val. modesto
Val. buono
1 - analisi per determinazione cv
viti locali
2 - scelta forma allevam.,
orientam. filare e portainnesto
3 - analisi tessuti per stima
produzione
4 - stabilizzazione proteica vini
bianchi con proteasi
5 - lievito autoctono per
produzione di Raboso Piave
6 - rintracciabilità lieviti autoctoni
7 - valorizzazione vitigni Friularo,
Pattaresca, Gruajo e Cabernet
8 - selezione vitigni resistenti agli
stress
9 - diradamento del grappolo
sulla vite di Raboso Piave
10 - analisi tessuti per valutazione
stress nutrizionali
11 - lieviti autoctoni per
vinificazione uve locali
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
E’ interessante osservare che la valutazione sintetica degli intervistati, in linea di massima, tende a
confermare quella analitica relativa alle tre innovazioni alle quali è stato applicato il partial budget.
Infatti, non più della metà degli operatori consultati attribuisce un buon valore all’uso di lievito
autoctono per la produzione di Raboso Piave di qualità, mentre la restante parte per il 20% la
considera un’innovazione di valore modesto ed il 30% addirittura nullo. Riguardo al diradamento
del grappolo per la lotta alla botrite sulla vite di Raboso Piave il giudizio nel complesso è
tendenzialmente negativo: l’80% si divide infatti tra valore nullo e modesto e soltanto il rimanente
20% gli attribuisce un valore buono. Infine, sulla stabilizzazione proteica dei vini bianchi con la
proteasi la quasi totalità si esprime per un valore complessivamente positivo (50% buono, 40%
modesto) e soltanto il restante 10% le attribuisce un valore nullo.
Per quanto riguarda l’interesse degli intervistati ad applicare le innovazioni prodotte dal progetto
ValViVe, in generale esso è tendenzialmente minore al valore assegnato a ciascuna, come si vede
confrontando le percentuali evidenziate nel grafico sotto riportato (Grafico 3) con quelle del grafico
precedente. In particolare, le innovazioni che suscitano la maggiore attenzione tra quelle di tipo
competitivo sono: a) la stabilizzazione dei vini bianchi con la proteasi prodotta dal fungo Sclerotinia
105
minor (50% degli intervistati); b) la scelta della forma di allevamento, orientamento del filare e
portainnesto in relazione alle caratteristiche del vino che si vuole ottenere (40%). Invece tra quelle
di tipo pre-competitivo il maggior interesse, con il 60% dei consensi in ambedue i casi, è rivolto: a)
alla selezione di vitigni più resistenti agli stress; b) all’individuazione di lieviti autoctoni per la
vinificazione di uve locali, con l’evidenziazione delle condizioni ottimali d’uso in riferimento alla
quantità di azoto necessaria.
Grafico 3 - Interesse da parte dei rappresentanti delle aziende vitivinicole intervistate ad
applicare le innovazioni prodotte dal progetto ValViVe
Int. nullo
Int. modesto
Int. buono
1- analisi per determinazio ne cv viti lo cali
2 - scelta fo rma allevam., o rientam. filare e po rtainnesto
3 - analisi tessuti per stima pro duzio ne
4 - stabilizzazio ne pro teica vini bianchi co n pro teasi
5 - lievito auto cto no per pro duzio ne di Rabo so P iave
6 - rintracciabilità lieviti auto cto ni
7 - valo rizzazio ne vitigni Friularo , P attaresca, Gruajo e Cabernet
8 - selezio ne vitigni resistenti agli stress
9 - diradamento del grappo lo sulla vite di Rabo so P iave
10 - analisi tessuti per valutazio ne stress nutrizio nali
11- lieviti auto cto ni per vinificazio ne uve lo cali
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
4. AZIONI DI MARKETING
Secondo la American Marketing Association (2004) il marketing è una funzione organizzativa e un
insieme di processi volti alla creazione, alla comunicazione e all’offerta di valore ai clienti, nonché
a una gestione del rapporto con il cliente che generi un beneficio per l’organizzazione37 e per tutti i
suoi membri. In pratica il marketing racchiude tutti quei comportamenti aziendali finalizzati a
comprendere le aspettative dei clienti e quindi a soddisfarle nel modo migliore per costruire e
garantire all’azienda un rapporto profittevole e duraturo con la clientela. Pertanto è compito del
marketing, da un lato, analizzare il mercato allo scopo di individuare il giusto collegamento del
prodotto aziendale con la clientela, dall’altro, caratterizzare tale prodotto per soddisfare le
preferenze dei clienti.
37
Si parla di organizzazione e non solo di impresa perché il marketing è una funzione che può essere esercita da
qualsiasi organismo, economico e non.
106
Con il già citato questionario-intervista si è cercato di individuare le azioni di marketing e non,
ritenute dagli operatori intervistati più idonee per costruire una strategia finalizzata alla
valorizzazione delle nuove tecniche messe a punto (competitive) oppure delineate (pre-competitive)
con il progetto ValViVe. In effetti l’oggetto della valorizzazione è sempre il prodotto vino nel quale
però le innovazioni vengono inglobate andando a costituire un ulteriore valore aggiunto di cui
potranno beneficiare i produttori in varia misura, solo realizzando specifiche azioni finalizzate a tale
scopo. Per meglio comprendere le indicazioni fornite dagli intervistati sono state raccolte anche
informazioni relative alla loro politica aziendale con riguardo all’adeguamento della produzione alle
preferenze del mercato, al contenimento dei costi di produzione, alle modalità di rapportarsi con la
clientela mediante le diverse forme di comunicazione, ed infine alle azioni inerenti più direttamente
il mercato per accrescere la competitività del prodotto aziendale. Ne è risultato che sono
particolarmente diffusi gli interventi per l’ammodernamento delle tecniche industriali riguardanti la
vinificazione e l’invecchiamento, meno quelli che interessano il reimpianto dei vigneti per
migliorare ed adeguare le cv alle richieste del mercato ed ancora meno quelli relativi al
contenimento dei costi, probabilmente perché i margini di manovra in tal senso sono già molto
esigui (Grafico 4).
Grafico 4 - Interventi attuati o in corso di realizzazione da parte delle aziende vitivinicole
intervistate per aumentare la competitività del prodotto aziendale
1 - reimpianto cv più richieste dal mercato e di migliore qualità
2 - miglioramento tecniche vinificazione ed invecchiamento
3 - introduzione nuove linee di prodotto
4 - contenimento costi (vigneto, cantina e distribuz. del prodotto)
5 - altro
6 - comunicazione mediante stampa
7 - comunicazione mediante televisione
8 - comunicazione mediante cartellonistica
9 - comunicazione mediante internet
10 - comunicazione mediante partecipazione a fiere
11 - comunicazione mediante visite aziendali
12 - comunicazione mediante altro
13 - contenimento prezzi (anche con vendite promozionali)
14 - maggiore identificazione del vino con il territorio
15 - incremento prodotto imbottigliato con marchio aziendale
16 - rinnovamento packaging
17 - rinnovamento etichetta
18 - vendita per posta
19 - vendita per via telematica
20 - riorganizzazione amministrativa con riferimento al marketing
21 - miglioramento professionalità degli addetti
22 - ristrutturazione attività di logistica
23 - realizzazione indagini di mercato
24 - diversificazione aree e canali di vendita
25 - integrazione commerciale con altre aziende di produz.
26 - altro
0%
10%
107
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Gli strumenti più utilizzati per agganciare e comunicare con la clientela sono soprattutto le visite
aziendali, la partecipazione alle fiere ed i contatti telematici attraverso internet. Più numerosi e
variegati gli interventi riguardanti più direttamente il mercato, tra i quali prevalgono in maniera
netta le azioni per sviluppare una maggiore identificazione del prodotto con il territorio e quelle per
rinnovare il packaging e l’etichetta. Sono inoltre presenti in larga misura la formazione
professionale degli addetti al mercato e la diversificazione delle aree e dei canali di vendita; assai
poco praticato è invece il contenimento dei prezzi di vendita. In ultima analisi l’immagine che ne
esce è quella di un settore vitivinicolo veneto moderno e dinamico che affronta la competitività
puntando sulla qualità del prodotto, sui servizi in esso incorporati, sulla capacità professionale dei
propri addetti e sull’acquisizione di nuove quote di mercato.
Tornando alle azioni ritenute più utili per valorizzare le ricadute pratiche delle ricerche di tipo
competitivo finanziate con il progetto ValViVe, queste naturalmente variano, soprattutto in termini
di numerosità delle opzioni espresse, a seconda delle innovazioni cui si riferiscono (Grafico 5).
Grafico 5 - Azioni ritenute utili da parte dei rappresentanti delle aziende vitivinicole intervistate
per valorizzare le innovazioni di tipo competitivo realizzate con il progetto ValViVe
analisi per determinazione cv viti locali
scelta forma allevam. orientam. filare e portainnesto
analisi tessuti per stima produzione
stabilizzazione proteica vini bianchi con proteasi
lievito autoctono per produzione di Raboso Piave
rintracciabilità lieviti autoctoni
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Azioni (vedi legenda rportata sotto)
Legenda azioni:
1 - indagine di mercato
2 - adeguamento dei prezzi di vendita
3 - sostituzione dei vitigni non corrispondenti
4 - contenimento dei costi in vigneto
5 - contenimento dei costi in cantina
6 - avvio processo di tracciabilità
7 - certificazione di prodotto
8 - adeguamento dei disciplinari di produzione
9 - maggiore identificazione del vino con il territorio
10 - formazione degli addetti aziendali con riferimento al marketing
11 - comunicazione. aziendale rivolta ad operatori di mercato ed opinion leader
12 - comunicazione aziendale rivolta ai consumatori
13 - comunicazione istituzionale rivolta ad operatori di mercato ed opinion leader
14 - comunicazione istituzionale rivolta ai consumatori
15 - altro
108
Il quadro complessivo che viene fuori dall’analisi delle risposte fornite con il questionario,
indipendentemente dalla valutazione attribuita in precedenza alle singole innovazioni e
dall’interesse ad applicarle, si può così riassumere:
 analisi per la determinazione delle cv di viti locali: a parere degli intervistati per sfruttare nella
misura maggiore questa innovazione, in primo luogo, bisogna puntare alla certificazione di
prodotto e ad una più forte identificazione del vino con il territorio, ma nello stesso tempo
bisogna anche eseguire delle appropriate indagini di mercato per capire quali sono le reali
aspettative dei consumatori; altre azioni ritenute utili e comunque in una certa misura collegate
alle precedenti sono l’avvio di un processo di tracciabilità, anche attraverso l’adeguamento dei
disciplinari di produzione, e la realizzazione di una specifica attività di comunicazione, sia
aziendale che istituzionale, nei confronti degli operatori di mercato, degli opinion leaders e dei
consumatori;
 scelta della forma di allevamento, orientamento del filare e portainnesto in relazione alle
caratteristiche del vino che si vuole ottenere: in questo caso ciò che si ritiene di maggiore utilità
è l’eventuale contenimento dei costi di produzione che si può realizzare nella gestione del
vigneto e poi anche un maggiore legame con il territorio, da comunicare opportunamente ai
consumatori, ed un adeguamento dei disciplinari di produzione;
 analisi dei tessuti per stimare l’andamento della stagione produttiva in relazione agli eventi
atmosferici: la cosa che si ritiene di gran lunga più utile da fare (60% degli intervistati) è
contenere i costi di produzione in vigneto;
 stabilizzazione dei vini bianchi con la proteasi prodotta dal fungo Sclerotinia minor: anche in
questo caso il contenimento dei costi di produzione, naturalmente in cantina, rappresenta
l’azione più opzionata, seguita però anche dall’opportunità di eseguire una specifica attività di
comunicazione, soprattutto da parte aziendale, nei confronti dei consumatori, in primo luogo, e
quindi degli operatori di mercato e degli opinion leaders;
 uso di lievito autoctono per la produzione di Raboso Piave di qualità: gli interventi più condivisi
per sfruttare questa possibilità sono un’ulteriore valorizzazione del legame del vino con il
territorio e lo sviluppo della comunicazione in tal senso, soprattutto da parte dell’azienda;
 rintracciabilità dei lieviti autoctoni isolati: secondo gli intervistati questa innovazione deve
essere finalizzata principalmente alla diminuzione dei costi di produzione in cantina ed all’avvio
di un processo di tracciabilità, in funzione anche della certificazione di prodotto; evidenziata
anche l’attività di comunicazione, sia aziendale che istituzionale, soprattutto nei confronti dei
consumatori.
109
In ultima analisi si vede che per valorizzare le ricadute di tipo competitivo prodotte dal progetto
ValViVe bisognerebbe costruire una strategia articolata principalmente su tre filoni. Il primo
riguarda la fase produttiva attraverso le azioni finalizzate al contenimento dei costi di produzione
mentre gli altri due appartengono più direttamente al marketing. Il secondo è infatti costituito
dall’identificazione del vino con il territorio da sviluppare mediante la tracciabilità, la certificazione
e l’adeguamento dei disciplinari. Mentre il terzo è rappresentato dalle molteplici attività di
comunicazione. Modesto rilievo hanno riscosso le indagini di mercato, nonostante questo strumento
sia comunemente considerato fondamentale per la funzione di marketing. D’altra parte si è visto che
è un’attività non particolarmente presente tra quelle realizzate dalle aziende vitivinicole intervistate.
Infine, anche per quanto riguarda le innovazioni di tipo pre-competitivo, nonostante la loro
applicazione richieda ancora alcuni anni di studio e prove sperimentali, sono state rilevate numerose
azioni “attualmente” ritenute utili alla loro “futura” valorizzazione (Grafico 6).
Grafico 6 - Azioni ritenute utili da parte dei rappresentanti delle aziende vitivinicole
intervistate per valorizzare le innovazioni di tipo pre-competitivo realizzate con il progetto
ValViVe
valorizzaz. vitigni di Friularo, Pattarasca, Gruajo e Cabernet
selezione vitigni resistenti agli stress
diradamento del grappolo di Raboso Piave
analisi tessuti per valutazione stress nutrizionali
lieviti autoctoni per vinificazione uve locali
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Azioni (vedi legenda riportata sotto)
Legenda azioni:
1 - indagine di mercato
2 - adeguamento dei prezzi di vendita
3 - sostituzione dei vitigni non corrispondenti
4 - contenimento dei costi in vigneto
5 - contenimento dei costi in cantina
6 - avvio processo di tracciabilità
7 - certificazione di prodotto
8 - adeguamento dei disciplinari di produzione
9 - maggiore identificazione del vino con il territorio
10 - formazione degli addetti aziendali con riferimento al marketing
11 - comunicazione. aziendale rivolta ad operatori di mercato ed opinion leader
12 - comunicazione aziendale rivolta ai consumatori
13 - comunicazione istituzionale rivolta ad operatori di mercato ed opinion leader
14 - comunicazione istituzionale rivolta ai consumatori
15 - altro
110
In sintesi, secondo gli intervistati, le azioni più importanti che dovranno essere attuate a sostegno
delle singole innovazioni sono:
 valorizzazione dei vitigni di Friularo, Pattaresca, Gruajo e Cabernet Lispida (sia per ampliare
l’offerta produttiva, sia come fonte di geni in programmi di miglioramento genetico): le varie
forme di comunicazione, anche per far conoscere meglio il legame del vino con il territorio;
 selezione di vitigni più resistenti agli stress: il contenimento dei costi di produzione in vigneto
attraverso anche l’eventuale sostituzione dei vitigni esistenti con quelli selezionati; inoltre tutte
le varie forme di comunicazione;
 lotta alla botrite sulla vite di Raboso Piave mediante diradamento del grappolo: essenzialmente
la diminuzione dei costi di produzione in vigneto;
 analisi dei tessuti per valutare gli stress nutrizionali: anche in questo caso fondamentalmente il
contenimento dei costi di produzione in vigneto;
 individuazione di lieviti autoctoni per la vinificazione di uve locali: le indicazioni più numerose
riguardano la contrazione dei costi di produzione in cantina e le varie forme di comunicazione.
Ne esce quindi una strategia orientata principalmente sul contenimento dei costi di produzione e
sulla comunicazione.
5. CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE
Solo nel caso di tre innovazioni è stato possibile formulare una valutazione economica abbastanza
precisa sulla base dei dati raccolti. Riguardo alla stabilizzazione dei vini bianchi con la proteasi
prodotta dal fungo Sclerotinia minor è stato determinato un beneficio concreto la cui entità, stimata
intorno ai 10 milioni di euro annui soltanto per il Veneto, è in grado da sola di coprire ampiamente i
costi complessivi di tutto il progetto ValViVe. Invece non è stato apprezzato alcun beneficio
relativamente alla produzione di Raboso Piave di qualità con lievito autoctono poiché l’unica
conseguenza ipotizzata è un ulteriore consolidamento del suo mercato. Infine per la lotta alla botrite
sulla vite di Raboso Piave mediante diradamento del grappolo, anche qualora si verificassero tutte
le condizioni più favorevoli (tempestività del trattamento diradante e miglioramento qualitativo del
prodotto), si avrebbe comunque un risultato negativo prodotto dalla consistente diminuzione di
valore della produzione complessiva conseguente alla sua forte riduzione quantitativa.
Per quanto riguarda le altre ricerche i risultati relativi alla valutazione economica non sono
altrettanto univoci. Gli esiti delle ricerche sono ancora lontani dall’essere concretamente trasferibili
agli operatori e pertanto non è possibile valutarne il beneficio economico diretto. Peraltro sul piano
111
qualitativo sono stati considerati dagli operatori variamente positivi e con ricadute economiche in
taluni casi potenzialmente promettenti. D’altra parte la realizzazione delle ricerche, da un lato,
fornisce un contributo all’avanzamento della conoscenza utile per garantire al sistema produttivo
una posizione di leadership nell’innovazione e ricerca di nuovi risultati, dall’altro, la base per
ulteriori sviluppi applicativi.
BIBLIOGRAFIA
AA.VV. : Using the partial budget to analyze farm change (Maryland Cooperative Extension – University of
Maryland).
AA.VV.: Guida all’analisi costi- benefici dei progetti di investimento (Fondi Strutturali, Fondo di Coesione e ISPA);
Preparata per: Unità di Valutazione, DG Politica Regionale e Coesione, Commissione Europea; 2003.
AA.VV: I percorsi della ricerca scientifica e la diffusione dell’innovazione – Il caso dell’agricoltura piemontese; INEA
2007.
Alberigi Quaranta A.; Giovannini A.; Rago S.: Sulla valutazione degli investimenti per ricerca e sviluppo (L'Industria –
n. 3, 1982).
Burton A.WEISBROD: Costs and Benefits of Medical Research: A Case Study of Poliomyelitis; “The Journal of
Political Economy”, 1971.
Craig Chase: Using partial budgets to make decisions (Iowa State University – University Extension; maggio 2010).
Mishan E.J. : L’abc dell’analisi costi benefici – Tratto da “Mercurio”: Anno XV, n. 2 febbraio 1972.
112
Allegato A – Obiettivi risultati e ricadute
Unità di ricerca
(Responsabile)
Prof.ssa LUCCHIN
Obiettivi della ricerca
Risultati raggiunti
Ricadute nel breve periodo (competitive)
Ricadute nel medio e lungo periodo (pre-competitive)
Caratterizzazione molecolare del germoplasma viticolo veneto
mediante la rilevazione di polimorfismi di sequenza per una rapida
identificazione dei vitigni
Identificazione delle varietà di vite attraverso marcatori microsatelliti
Applicazione della genomica funzionale allo studio dell’interazione
vitigno-ambiente e caratterizzazione di geni coinvolti in vie
metaboliche correlate alla qualità della bacca
Individuazione di quattro vitigni autoctoni (Friularo, Pattaresca,
Gruajo, Cabernet Lispida) ad alto contenuto di resveratrolo
Valorizzazione dei vitigni di Friularo, Pattaresca, Gruajo e Cabernet
Lispidasia, sia per ampliare l'offerta produttiva di vini locali, sia come
fonte di geni in programmi di miglioramento genetico
Avvio di un accurato studio funzionale dei geni che controllano la
sintesi deglii stilbeni, i cui risultati potranno consentire
l'individuazione delle varianti geniche di maggiore interesse per la
resistenza agli stress
Selezione di vitigni più resistenti agli stress
Prof. VALLE
Caratterizzazione molecolare del germoplasma viticolo veneto
mediante la rilevazione di polimorfismi di sequenza per una rapida
identificazione dei vitigni
Prof. PEZZOTTI
Studio dell’interazione vitigno-ambiente mediante l’applicazione della Si è osservato che il 10% del trascrittoma è utilizzato dal genoma per
genomica funzionale, con particolare riferimento alla relazione che
risposte ed arrangiamenti plastici (plasticità fenotipica)
intercorre tra il genotipo del clone 48 di Corvina e il territorio
veronese, le sue caratteristiche fisico-chimiche e le peculiari pratiche
agronomiche in esso utilizzate
Messa a punto di una procedura di analisi per la determinazione
della cv di viti locali
Identificazione delle cv di vite e delle eventuali differenze tra varianti Messa a punto di una procedura di analisi per la determinazione
locali dello stesso vitigno mediante l'utilizzo delle basi nucleotidiche della cv di viti locali
del DNA
Scelta forma di allevamento, orientamento del filare e portainnesto in
relazione alle caratteristiche del vino che si vuole ottenere (maggior
contenuto in polifenoli, in zuccheri riduttori, ecc.)
Analisi dei tessuti per stimare l'andamento della stagione produttiva
in relazione agli eventi atmosferici e quindi per intervenire con
pratiche di "viticoltura assistita"
Prof. RAMINA
Studio degli effetti dei trattamenti ormonali sulla compattezza del
grappolo, con particolare riferimento alla cv Raboso Piave
Individuazione di una miscela ormonale, composta da gibberelline ed
auxine, dimostratasi particolarmente idonea per il diradamento dei
grappoli della cv Raboso Piave
Lotta alla botrite sulle vite di Raboso Piave mediante diradamento
del grappolo realizzato utilizzando la miscela ormonale individuata
Prof.ssa ZOTTINI
Identificazione di geni la cui espressione è modulata in funzione di
differenti condizioni di disponibilità dei principali nutrienti e che sono
relativi a vie metaboliche (zuccheri) che influenzano la qualità
dell’uva
Effettuate prove di stress nutrizionale attraverso l’uso di substrati con
diverse carenze di elementi nutritivi
Messa a punto di un sistema di valutazione, attraverso l’analisi dei
tessuti, degli stress nutrizionali in atto nella vite
Prof. CURIONI
Stabilizzazione proteica dei vini bianchi mediante lo sfruttamento
delle potenzialità di un fungo fitopatogeno (Sclerotinia minor)
Individuazione di un enzima proteolitico (proteasi), prodotto dal fungo Sostituziomne della bentonite con la proteasi prodotta dal fungo
Sclerotinia minor, in grado di stabilizzare efficacemente i vini bianchi Sclerotinia minor, per la stabilizzazione dei vini bianchi
Prof. GIACOMINI
Identificazione dei ceppi di lievito più adatti alla produzione di vini
veneti
Selezione di un lievito autoctono per la produzione di Raboso Piave
di particolare qualità
Produzione di Raboso Piave di particolare qualità utilizzando il lievito
autoctono selezionato
Costruzione di protocolli per la vinificazione personalizzati, mediante In fase di attuazione con particolare riferimento alla presenza
lo studio delle condizioni ottimali di sviluppo microbico nel mosto e
dell’azoto
nel vino
Produzione di un sistema di etichettatura genetica dei ceppi coinvolti I ceppi di lievito autoctoni isolati sono tutti geneticamente identificabili Rintracciabilità dei ceppi di lievito autoctoni isolati fino alla fase di
nella sperimentazione in grado di contribuire alla realizzazione della fino alla fase di filtrazione ed imbottigliamento
filtrazione ed imbottigliamento
rintracciabilità tecnologica del prodotto vino
113
Individuazione di lieviti autoctoni per la vinificazione di uve locali,
evidenziando le condizioni ottimali d’uso con riferimento alla quantità
di azoto necessaria e gli aromi prodotti con quella quantità
Allegato B – Partial budget (tipo)
Partial budget: (obiettivo ricerca)
Azienda (nominativo e indirizzo): ……………...…………….……………..…………………………………….………………...……………………………...……………… (data rilevazione: ……………………..)
…………………………………………………………….. ……………...…..….…………….....……........……………....................................……………………………………………...………………………………
Problematiche relative all'implementazione della tecnica (anche con riferimento al rischio)
1 - ……………………
2 - ……………………
3 - ……………………
……………………….
Effetti positivi
Effetti negativi
Valore
A.1 - Nuovi redditi
Valore
B.1 - Mancati redditi
€
€
€
€
€
€
€
€
€
a.1.1 a.1.2 a.1.3 a.1.4 a.1.5 ……….
……….
……….
……….
Totale
€
A.2 - Costi non sostenuti
€
€
€
€
€
€
€
€
€
b.1.1 b.1.2 b.1.3 b.1.4 b.1.5 ……….
……….
……….
……….
Totale
€
B.2 - Nuovi costi
€
€
€
€
€
€
€
€
€
a.2.1 a.2.2 a.2.3 a.2.4 a.2.5 ……….
……….
……….
……….
€
€
€
€
€
€
€
€
€
b.2.1 b.2.2 b.2.3 b.2.4 b.2.5 ……….
……….
……….
……….
Totale
€
Totale
€
Totale generale (A)
€
Totale generale (B)
€
Utile / Perdita = Totale generale (A) - Totale generale (B) = € ……………………………….
114
Allegato C – Questionario-intervista
Azienda
Data
Ruolo del'intervistato
Produzione vinicola media degli ultimi tre anni (hl) (1)
(1) Solo per le aziende vitivinicole
1)
Conoscenza degli obiettivi generali del progetto
nulla (N)
modesta (M)
buona (B)
- identificazione dei vitigni attraverso il loro corredo genetico
- studio dell'interazione vitigno-ambiente ed individuazione dei geni legati alla qualità dell'uva
- miglioramento del processo di vinificazione con particolare riferimento alla stabilizzazione dei vini bianchi ed alle performance di
lieviti e batteri nella fermentazione
- valutazione economica delle innovazioni realizzate ed individuazione delle strategie di marketing per la loro valorizzazione
2)
Valutazione sintetica delle innovazioni realizzate (con riferimento sia alla caratterizzazione del prodotto
sia all'ammodernamento dei processi di vinificazione) ed interesse alla loro applicazione
A) Ricadute nel breve periodo (competitive)
valore
interesse
- messa a punto di una procedura di analisi per la determinazione
delle cv di viti locali
N
M
B
N
M
B
- scelta forma di allevamento, orientamento del filare e portainnesto
in relazione alle caratteristiche del vino che si vuole ottenere (maggior
contenuto in polifenoli, in zuccheri riduttori, ecc.)
N
M
B
N
M
B
- analisi dei tessuti per stimare l'andamento della stagione produttiva
in relazione agli eventi atmosferici e quindi per intervenire con pratiche
di "viticoltura assistita"
N
M
B
N
M
B
- sostituziomne della bentonite con la proteasi prodotta dal fungo
Sclerotinia minor, per la stabilizzazione dei vini bianchi
N
M
B
N
M
B
- produzione di Raboso Piave di particolare qualità utilizzando il
lievito autoctono selezionato
N
M
B
N
M
B
- rintracciabilità dei ceppi di lievito autoctoni isolati, fino alla fase
di filtrazione ed imbottigliamento
N
M
B
N
M
B
- valorizzazione dei vitigni di Friularo, Pattaresca, Gruajo e Cabernet
Lispidasia, sia per ampliare l'offerta produttiva di vini locali, sia come
fonte di geni in programmi di miglioramento genetico
N
M
B
N
M
B
- selezione di vitigni più resistenti agli stress
N
M
B
N
M
B
- lotta alla botrite sulla vite di Raboso Piave mediante
diradamento del grappolo con una miscela ormonale
N
M
B
N
M
B
- messa a punto di un sistema di valutazione, attraverso l’analisi
dei tessuti, degli stress nutrizionali in atto nella vite
N
M
B
N
M
B
- individuazione di lieviti autoctoni per la vinificazione di uve locali,
evidenziando le condizioni ottimali d’uso con riferimento alla
quantità di azoto necessaria e gli aromi prodotti con quella quantità
N
M
B
N
M
B
B) Ricadute nel medio e lungo periodo (pre-competitive)
115
3)
Ripartizione percentuale del fatturato per aree di mercato (totale = 100%)
% locale
4)
% nazionale
% europeo
Ripartizione percentuale del fattuirato per canale di vendita (totale = 100%)
% vendita diretta (1)
% GDO
% ristorazione
% piccolo dettaglio
% ingrosso
% altro (2)
(1) Direttamente in azienda, per posta, via internet.
5)
% extra-europeo
(2) Se si complila la casella "altro" specificare nello spazio accanto
Interventi attuati negli ultimi anni o in corso di realizzazione per aumentare la competitività del prodotto
aziendale
A) Azioni relative alla produzione
- reimpianto di vigneti con varietà più richieste dal mercato e di migliore qualità
- miglioramento delle tecniche di vinificazione e di invecchiamento
- introduzione di nuove linee di prodotto
- contenimento dei costi di produzione (in vigneto, in cantina e nella distribuzione del prodotto)
- altro (specificare)
B) Iniziative relative alla comunicazione
- mediante la stampa
- mediante la televisione
- mediante la cartellonistica
- mediante internet
- mediante la partecipazione a fiere
- mediante l'organizzazione di visite aziendali
- mediante altro (specificare)
C) Azioni riguardanti il mercato
- contenimento dei prezzi di vendita (anche attraverso vendite promozionali)
- maggiore identificazione del vino con il territorio
- incremento del prodotto imbottigliato con marchio aziendale
- rinnovamento del packaging
- rinnovamento dell'etichetta
- vendita per posta
- vendita per via telematica
- riorganizzazione della componente aziendale amministrativa con particolare riferimento al marketing
- miglioramento della professionalità degli addetti
- ristrutturazione delle attività di logistica
- realizzazione indagini di mercato
- diversificazione delle aree e dei canali di vendita
- integrazione commerciale con altre aziende di produzione
- altro (specificare)
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A) Ricadute nel breve periodo (competitive)
E
M
E
E
M
E
E
M
E
E
M
E
E
M
E
E
M
E
E
# messa a punto di una procedura di analisi per la determinazione
delle cv di viti locali
M
E
E
M
E
E
M
E
E
M
E
E
M
E
E
M
E
E
E
M
E
Altro (1)
istituzionale
rivolta
ai
M
E
Comunicazione
consumatori
Comunicazione istituzionale rivolta
operatori di mercato ed opinion leader
ad
ai
Comunicazione
aziendale
rivolta
consumatori (etichetta e/o altro)
Comunicazione aziendale rivolta ad operatori
di mercato ed opinion leader
con
aziendali
Formazione degli addetti
riferimento al marketing
Maggiore identificazione del vino con il
territorio
Adeguamento dei disciplinari di produzione
Certificazione di prodotto
Avvio di un processo di tracciabilità
Contenimento dei costi di produzione in
cantina
Contenimento dei costi di produzione in
vigneto
Sostituzione dei vitigni non corrispondenti
Adeguamento dei prezzi di vendita
Indicare cinque azioni ritenute utili per valorizzare sul mercato
le innovazioni realizzate con il progetto ValViVe (specificando
per ognuna di quelle scelte il grado di importanza attribuitole)
( E = elevato; ME = molto elevato)
Indagine di mercato
6)
E
M
E
altro
# scelta forma di allevamento, orientamento del filare e portainnesto
in relazione alle caratteristiche del vino che si vuole ottenere (maggior
contenuto in polifenoli, in zuccheri riduttori, ecc.)
altro
# analisi dei tessuti per stimare l'andamento della stagione produttiva
in relazione agli eventi atmosferici e quindi per intervenire con pratiche
di "viticoltura assistita"
altro
# sostituziomne della bentonite con la proteasi prodotta dal fungo
Sclerotinia minor, per la stabilizzazione dei vini bianchi
altro
# produzione di Raboso Piave di particolare qualità utilizzando il
lievito autoctono selezionato
altro
# rintracciabilità dei ceppi di lievito autoctoni isolati, fino alla fase
di filtrazione ed imbottigliamento
altro
B) Ricadute nel medio e lungo periodo (pre-competitive)
# valorizzazione dei vitigni di Friularo, Pattaresca, Gruajo e Cabernet
Lispidasia, sia per ampliare l'offerta produttiva di vini locali, sia come
fonte di geni in programmi di miglioramento genetico
altro
# selezione di vitigni più resistenti agli stress
altro
# lotta alla botrite sulla vite di Raboso Piave mediante diradamento
del grappolo con una miscela ormonale
altro
# messa a punto di un sistema di valutazione, attraverso l’analisi
dei tessuti, degli stress nutrizionali in atto nella vite
altro
# individuazione di lieviti autoctoni per la vinificazione di uve locali,
evidenziando le condizioni ottimali d’uso con riferimento alla
quantità di azoto necessaria e gli aromi prodotti con quella quantità
altro
(1) Se si compila una casella della colonna "altro" specificare nel corrispondente spazio
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