Nella fosforilazione ossidativa il potenziale di trasferimento degli elettroni
del NADH e del FADH2 viene convertito nel potenziale di trasferimento del
gruppo fosforico dell’ATP.
Quando due coppie redox coniugate sono presenti nella stessa soluzione, il trasferimento
di elettroni dal donatore di elettroni di una coppia all’accettore di elettroni dell’altra
coppia dipende dalle affinità relative dell’accettore di elettroni di ciascuna coppia.
Il potenziale di riduzione standard (E0) è una misura (in volt) di questa affinità e viene
determinato in un esperimento di questo tipo:
Gli elettrochimici hanno scelto come standard di riferimento
la reazione:
H+ + e- Æ 1/2 H2
L’elettrodo su cui ha luogo questa semireazione (detto semicella) viene arbitrariamento considerato con un potenziale
di riduzione pari a 0,00 V.
Quando l’elettrodo ad idrogeno viene collegato a un’altra
semi-cella in cui le specie ossidata e ridotta sono presenti in
condizioni standard (1 M o 1 atm), gli elettroni tenderanno a
fluire verso la semicella con il potenziale redox più elevato.
Per convenzione la semi-cella con la tendenza più forte ad
acquistare gli elettroni viene indicata con un valore (in volt)
di E0 positivo.
Come per la definizione di ΔG’0, i biochimici definiscono lo stato standard
per le reazioni di ossido-riduzione a pH 7,0, ed esprimono il potenziale sotto
forma di E’0, il potenziale di riduzione standard a pH 7.
Un potenziale di riduzione standard negativo indica che una sostanza ha
un’affinità per gli elettroni più bassa di quella dell’H2.
Un potenziale di riduzione standard positivo indica che una sostanza ha
un’affinità per gli elettroni più alta di quella dell’H2.
La variazione di energia libera standard è correlata alla variazione nel
potenziale di riduzione dalla relazione:
ΔG’0= -nFΔE’0
n = numero di elettroni trasferiti;
F = variazione di energia libera generata da 1 mole di elettroni e da un
cambio di potenziale di 1 volt.
La differenza di potenziale di riduzione (ΔE’0) nella catena respiratoria è di 1,14 V
a)
b)
1/2 O2 + 2 H+ + 2 e- Æ H2O
NAD+ + H+ + 2 e- Æ NADH
quindi:
c) 1/2 O2 + NADH + H+ Æ H2O + NAD+
E’0 = + 0,82 V
E’0 = - 0,32 V
ΔE’0 = + 1,14 V
L’energia libera per questa reazione è
ΔG’0= -nFΔE’0= -52,6 kcal/mole
Un ΔE’0 positivo, come un ΔG’0 negativo, identificano una reazione esoergonica in
condizioni standard.
Schema essenziale della fosforilazione ossidativa
L’ossidazione e la sintesi di ATP sono accoppiate mediante flussi protonici
transmembrana.
I mitocondri (in verde) formano una rete all’interno di un fibroblasto
I mitocondri ossidano i combustibili carboniosi per produrre energia cellulare.
Questa trasformazione richiede il trasferimento degli elettroni attraverso grandi
complessi proteici, alcuni dei quali pompano protoni, generando un gradiente protonico
che favorisce la sintesi di ATP.
Gli elettroni sono incanalati verso accettori universali di elettroni
La fosforilazione ossidativa ha inizio con l’ingresso degli elettroni nella catena
respiratoria.
La maggior parte di questi elettroni è il frutto dell’azione di deidrogenasi che li
raccolgono dai processi catabolici per poi incanalarli verso accettori universali di
elettoni: i nucleotidi piridinici (NAD+ o NADP+) o flavinici (FMN o FAD)
Gli elettroni passano attraverso una serie di trasportatori legati alla membrana
Ubichinone
Anche detto coenzima Q è un
benzochinone con una catena
laterale isoprenoide molto lunga.
L’ubichinone è idrofobico e quindi
liberamente diffusibile nel doppio
strato lipidico della membrana
mitocondriale interna. In questo
modo può agire da ponte fra
trasportatori di elettroni meno
mobili nella membrana.
I citocromi sono proteine contenenti ferro
Il gruppo prostetico dei citocromi è il gruppo eme.
I citocromi sono proteine con un caratteristico elevato assorbimento della luce
nel campo visibile dovuto al gruppo prostetico eme, contenente ferro
Spettri di assorbimento del citocromo c
nella forma ossidata (in rosso) e nella
forma ridotta (in blu).
Le proteine ferro-zolfo
Nelle proteine ferro-zolfo il ferro è associato ad atomi di zolfo inorganico e/o
ad atomi di zolfo di residui di cisteina della proteina (centri Fe-S)
Il potenziale di riduzione standard del ferro nei centri Fe-S dipende dal tipo
di centro e dalle specifiche interazioni che ha con la proteina in cui è inserito.
Centro Fe-S semplice
Un solo ione Fe è circondato da 4 residui di cisteina
Centro 2Fe-2S
Centro 4Fe-4S
La ferredossina
Una proteina con un centro 2Fe-2S
Metodo per la determinazione della sequenza dei trasportatori di elettroni
In presenza di un donatore di elettroni e di O2 è stato valutato l’effetto di inibitori del
trasferimento degli elettroni sullo stato di ossidazione di ogni trasportatore.
In blu: composti ridotti
In rosso: composti ossidati
Separazione dei componenti funzionali della catena respiratoria
Via seguita dagli elettroni per passare da NADH, succinato, acil-CoA e
glicerolo 3-fosfato all’ubichinone (Q)
NADH:ubichinone ossidoreduttasi - Complesso I
(anche detta NADH deidrogenasi)
NADH + Q + 5H+matrice NAD+ + QH2 + 4H+citosol
Complesso II : da succinato a ubichinone
Succinato
Il complesso II è la succinato deidrogenasi, il solo enzima del ciclo dell’acido
citrico ad essere legato alla membrana mitocondriale interna.
Il complesso II contiene due tipi di gruppi prostetici e almeno 4 proteine diverse.
Si pensa che gli elettroni passino dal succinato al FAD e poi attraverso
i centri Fe-S all’ubichinone
Il complesso di citocromi bc1 - ComplessoIII
(o citocromo reduttasi)
Il complesso è un dimero
formato da monomeri identici,
ciascuno con 11 differenti
subunità.
Struttura di un monomero
Il centro funzionale ha tre subunità: il citocromo b
(verde) con due gruppi eme (bH e bL, in rosso chiaro),
la proteina ferro-zolfo di Rieske (viola) con un centro
ferro-zolfo (giallo); e il citocromo c1 (blu) con un
gruppo eme (rosso)
Unità dimerica funzionale del Complesso III
Il complesso III accoppia il trasferimento degli elettroni dall’ubichinolo (QH2) al
citocromo c con il trasporto protonico dalla matrice allo spazio intermembrana.
Il citocromo c1 e la
proteina
di
Rieske
sporgono
verso
la
superficie e possono
interagire
con
il
citocromo c nello spazio
intermembrana.
QH2 + 2 Cyt coss + 2 H+matrice Q + 2 Cyt crid + 4H+citosol
Il complesso ha due
distinti siti di legame per
l’ubichinone, QN e QP.
Il ciclo dell’ubichinone
Sul lato esterno della membrana due molecole di QH2 vengono ossidate a Q a livello del
sito QP, rilasciando 4 protoni nello spazio intermembrana.
Ciascuna molecola di QH2 dona un elettrone (tramite il centro Fe-S di Rieske) al
citocromo c1 e un altro (tramite il citocromo b) lo dona a una molecola di Q a livello del
sito QN, riducendo l’ubichinone a QH2 in due tappe successive.
Questa riduzione utilizza due protoni prelevati dalla matrice.
Complesso III
Il funzionamento del Complesso III permette il passaggio da un
trasportatore a due elettroni (l’ubichinone) a trasportatori a un solo
elettrone (i citocromi b562, b566, c1 e c) e spiega la stechiometria della reazione
con 4 protoni che traslocano per ciacuna coppia di elettroni che viene
trasferita al citocromo c.
Il risultato netto è:
QH2 viene ossidato a Q e 2 molecole di citocromo c vengono ridotte.
Citocromo C
Il citocromo c è una proteina solubile nello
spazio intermembrana.
Quando il suo gruppo eme accetta un
elettrone dal Complesso III, il citocromo c
si sposta verso il Complesso IV per donare
l’elettrone a un centro rameico binucleare
di questo enzima.
Subunità della citocromo ossidasi - Complesso IV
La parte centrale del Complesso IV
possiede tre subunità.
La subunità I (giallo) ha due gruppi
eme, a e a3 (rosso) e uno ione rame, CuB
(sfera verde). La subunità II (blu)
contiene due ioni rame (sfere verdi)
complessati con i gruppi -SH di due
residui di Cys in un centro binucleare,
CuA, che assomiglia ai centri 2Fe-2S
delle proteine ferro-zolfo.
Questo centro binucleare e il sito di
legame del citocromo c sono collocati in
un dominio della subunità II che sporge
verso lo spazio intermembrana.
Non è stato ancora chiarito il ruolo
della subunità III (verde)
Il centro binucleare di CuA
Gli ioni rame si distribuiscono
equamente
gli
elettroni.
Quando il centro è ridotto, gli
ioni rame possiedono le
cariche formali Cu1+Cu1+;
quando è ossidato, possiedono
cariche Cu1,5+Cu1,5+ .
Attorno agli ioni rame sono
compresi : due His (blu), due
Cys (giallo), un Asp (rosso) e
una Met (arancione).
Il Complesso IV trasporta gli elettroni dal citocromo c
all’ossigeno molecolare riducendolo ad H2O
Il Complesso IV si è evoluto in
modo da catalizzare una reazione
redox in cui la molecola di O2 viene
ridotta contemporaneamente da 4
elettroni, senza la formazione di
intermedi ridotti incompleti (es.:
anione superossido O2-) altamente
reattivi.
Flusso degli elettrononi e dei protoni attraverso i quattro
complessi della catena respiratoria.
Teoria chemioosmotica
(Peter Mitchell, 1961)
L’energia che deriva dal flusso di elettroni attraverso la catena respiratoria è
utilizzata per pompare protoni (H+) dalla matrice mitocondriale verso lo spazio
intermembrana.
Si genera un gradiente di pH - la concentrazione di H+ è maggiore nello spazio
intermembrana che nella matrice.
Si genera un gradiente elettrico - la matrice è negativa rispetto allo spazio
intermembrana.
L’energia potenziale elettrochimica generata è chiamata forza motrice
protonica.
Quando i protoni fluiscono all’indietro attraverso
interna tramite un enzima legato alla membrana
vengono uniti a formare ATP.
la membrana mitocondriale
(ATP sintasi), l’ADP e il Pi
Circa 3 H+ devono attraversare l’ATP sintasi per ciascuno degli ATP sintetizzati
Teoria chemioosmotica
Il numero di protoni pompati fuori per coppia di elettroni trasportati è 10 per il
NADH e 6 per il succinato.
Il numero di protoni richiesti per la sintesi di una molecola di ATP è di 4, di cui
uno è utilizzato per trasportare Pi, ATP e ADP attraverso la membrana
mitocondriale.
Si sintetizzano 2,5 molecole di ATP (10/4) quando il donatore di elettroni è il
NADH e 1,5 (6/4) quando il donatore è il succinato (FADH2).
La forza motrice protonica
Modello chemioosmotico
F1ATPasi
La subunità γ rompe la simmetria
dell’esamero
α3β3:
ciascuna
subunità β è distinta in virtù della
sua interazione con una differente
faccia di γ.
Distinguere le tre subunità β è
cruciale per il meccanismo di
sintesi dell’ATP
Fo contiene il canale protonico del
complesso
Meccanismo di sintesi dell’ATP
Uno degli atomi di ossigeno dell’ADP attacca l’atomo di fosforo di Pi per formare un
intermedio pentacovalente, che a sua volta forma ATP e rilascia una molecola di H2O.
Diagrammi delle coordinate di reazione dell’ATP sintasi e di un tipico
enzima.
Nella reazione catalizzata dall’ATP sintasi la maggiore barriera energetica è il rilascio
dell’ATP dall’enzima e non la sua formazione.
I siti di legame per i nucleotidi della ATP sintasi non sono equivalenti
La subunità γ passa attraverso il centro dell’esamero α3β3 e forma siti di legame per i
nucleotidi nelle subunità β distinti l’uno dall’altro
Diverse conformazioni delle subunità β
Una subunità β può essere nella conformazione serrata (T), che lega l’ATP con grande
avidità.
Una seconda subunità β sarà nella conformazione lassa (L), che lega l’ADP e il Pi.
L’ultima subunità β sarà nella conformazione aperta (O)
La rotazione della subunità γ interconverte le tre subunità β favorendo la
sintesi di ATP
Sistemi di trasporto presenti nella membrana mitocondriale interna portano ADP e Pi
nella matrice e consentono all’ATP appena sintetizzato di uscire nel citosol
Il potenziale di membrana è ridotto
dallo scambio ADP/ATP, che risulta
nel trasferimento netto di una
carica negativa fuori dalla matrice.
Lo scambio ADP/ATP ha un costo
energetico;
circa
un
quarto
dell’energia
ricavata
dal
trasferimento di elettroni lungo la
catena respiratoria è consumata per
rigenerare
il
potenziale
di
membrana che si perde per il
trasferimento dell’ATP nel citosol.
Per l’ossidazione del NADH citosolico nei mitocondri, sono necessari sistemi
navetta
Lo shuttle del malato-aspartato
Lo shuttle del glicerolo 3-fosfato
Questo sistema navetta differisce da quello malato-aspartato in quanto
trasporta equivalenti riducenti dal NADH (via ubichinone) al Complesso III e
non al Complesso I.
Per ogni coppia di elettroni che arrivano all’ossigeno dal NADH sono prodotte
2,5 molecole di ATP.
Per ogni coppia di elettroni che arrivano all’ossigeno dal FADH2 sono prodotte
1,5 molecole di ATP.
Le vie che producono ATP sono regolate in modo coordinato
La fosforilazione ossidativa è regolata sulle necessità
energetiche della cellula
In condizioni fisiologiche il trasporto degli elettroni è
strettamente accoppiato alla fosforilazione.
Gli elettroni non scorrono attraverso la catena
respiratoria se contemporaneamente non viene
fosforilato l’ADP a ATP.
Il fattore più importante nel determinare la velocità
della fosforilazione ossidativa è la concentrazione di
ADP.
La regolazione della velocità della fosforilazione
ossidativa (e quindi del consumo di O2) da parte dei
livelli di ADP viene chiamata controllo respiratorio.
Le vie che producono ATP sono regolate in modo coordinato
Le concentrazioni di ATP e ADP
controllano non solo le velocità di
trasferimento degli elettroni e della
fosforilazione ossidativa, ma anche
quelle del ciclo dell’acido citrico,
dell’ossidazione del piruvato e della
glicolisi
Generazione di calore mediante disaccoppiamento mitocondriale
Il gradiente di protoni può essere
cortocircuitato
per
produrre
calore.
Il tessuto adiposo bruno, mediante
la
proteina
disaccoppiante
termogenina, è specializzato in
questo processo di termogenesi.
I cloroplasti convertono l’energia luminosa in energia chimica
Gli elettroni ad alta energia presenti nei cloroplasti vengono trasportati attraverso due
fotosistemi. Durante questo tragitto, che genera potere riducente, viene sintetizzato ATP
in modo analogo alla sintesi di ATP mitocondriale.
Nei cloroplasti gli elettroni sono energizzati dalla luce.
Rappresentazione schematica di un cloroplasto
Gli eventi primari della fotosintesi avvengono nelle membrane tilacoidali
La fotosintesi
Il ciclo dell’acido citrico ossida a CO2 i combustibili carboniosi per generare elettroni ad
alta energia.
Il flusso di questi elettroni ad alta energia genera una forza motrice protonica attraverso
l’azione della catena di trasporto degli elettroni.
Questa forza motrice protonica viene utilizzata dalla ATP sintasi per formare ATP.
Per generare elettroni ad alta energia le reazioni alla luce della fotosintesi utilizzano
l’energia dei fotoni.
Questi elettroni vengono utilizzati direttamente per ridurre il NADP+ a NADPH e
indirettamente attraverso una catena di trasporto degli elettroni per generare una forza
motrice protonica tra le due facce della membrana.
Un prodotto collaterale di questa reazione è l’O2.
La forza motrice protonica favorisce la sintesi di ATP attraverso una ATP sintasi,
omologa a quella che interviene nella fosforilazione ossidativa
Nelle reazioni al buio il NADPH e l’ATP formati dall’azione della luce favoriscono la
riduzione della CO2 a composti organici più ridotti
Le reazioni alla luce della fotosintesi
L’energia luminosa viene assorbita e
utilizzata per estrarre elettroni
dall’acqua al fine di generare NADPH
e per far fluire protoni attraverso la
membrana tilacoidale.
Questi protoni ritornano attaverso la
ATP sintasi per formare ATP
La clorofilla
Le molecole di clorofilla (tetrapirroli con
uno ione magnesio centrale) assorbono la
luce in modo molto efficiente i quanto sono
polieni (composti che contengono reti di
legami singoli e legami doppi alternati).
Un elettrone eccitato a salire in uno stato
ad alta energia dall’assorbimento di un
fotone può trasferirsi verso accettori di
elettroni vicini.
Nella fotosintesi un elettrone eccitato
abbandona una coppia di molecole di
clorofilla associate nota come coppia
speciale.
Fitolo
Una molecola di fitolo, un alcol a 20 atomi di
carbonio molto idrofobico, è esterificata a una
catena laterale acida della clorofilla a.
E’ necessario che due fotosistemi distinti assorbano fotoni perché il flusso di
elettroni da acqua a NADP+ sia completo.
Movimento degli elettroni e dei protoni nei tilacoidi dei cloroplasti
Nel fotosistema II delle piante verdi
l’eccitazione del P680, una coppia
speciale di molecole di clorofilla,
determina il trasferimento di elettroni
al plastochinone.
Gli elettroni vengono ripristinati
dall’estrazione di elettroni dall’acqua
in un centro contenente 4 ioni
manganese. In questo centro viene
generata una molecola di O2 per ogni 4
elettroni trasferiti
Il plastochinolo prodotto a livello del
fotosistema II viene riossidato dal
complesso del citocromo bf, che
trasferisce
gli
elettroni
alla
plastocianina,
una
rame-proteina
solubile
Movimento degli elettroni e dei protoni nei tilacoidi dei cloroplasti
Dalla plastocianina gli elettroni entrano
nel fotosistema I
Nel fotosistema I l’eccitazione di una
coppia speciale P700 rilascia elettroni
che fluiscono alla ferredossina, un
potente riducente
La ferredossina -NADP+ riduttasi, una
flavoproteina localizzata sul versante
stromatico della membrana, converte il
NADP + in NADPH.
Trasferimento elettronico dall’acqua al NADP+ nella fotosintesi
Questa reazione endoergonica è
resa possibile dall’assorbimento
della luce ad opera del fotosistema
II (P680) e del fotosistema I
(P700).
Viene
generato
un
gradiente
protonico mentre gli elettroni
attraversano il fotosistema II, il
complesso bf e la ferredossina-NADP+
riduttasi.
Confronto tra la fotosintesi e la fosforilazione ossidativa
Nella fotosintesi il trasferimento di
elettroni indotto dalla luce fa fluire protoni
nel lume tilacoidale.
I protoni in eccesso effluiscono da lume
attraverso la ATP sintetasi per generare
ATP nello stroma
Nella fosforilazione ossidativa il flusso di
elettroni lungo la catena di trasporto degli
elettroni pompa protoni fuori dalla matrice
mitocondriale.
I protoni si muovono quindi dallo spazio
intermembrana nella matrice attraverso la
ATP sintetasi per generare ATP nella
matrice.
Cavolo d’Oriente
Trasportatori di elettroni nella membrana mitocondriale interna
delle piante