PLATELIA™ HSV 2 IgG
96 TEST
72821
DETERMINAZIONE QUALITATIVA DEGLI ANTICORPI
IgG ANTI-HSV 2 NEL SIERO O NEL PLASMA UMANO
MEDIANTE IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO
1. USO PREVISTO
Platelia™ HSV 2 IgG è un immunodosaggio ELISA indiretto per la
determinazione qualitativa degli anticorpi IgG anti-herpes simplex tipo 2
nel siero o nel plasma umano.
2. INTERESSE CLINICO
Il virus dell'herpes simplex (HSV) è un agente patogeno umano comune,
presente in tutto il mondo. Si distinguono due sierotipi: l'HSV-1 e l'HSV-2.
L'HSV-1 è principalmente associato alle infezioni della lingua, della bocca,
delle labbra, della faringe e degli occhi; mentre l'HSV-2 alle infezioni
genitali e neonatali. Tuttavia entrambi i virus possono causare infezioni
genitali e sempre più spesso l'HSV-1 viene riconosciuto come possibile
causa dei sintomi genitali. L'HSV viene trasmesso mediante contatto
diretto con le secrezioni di una persona infetta, sintomatica o
asintomatica. La maggior parte delle infezioni genitali viene trasmessa in
assenza di sintomi. L'infezione primaria da HSV può avvenire a qualsiasi
età e colpisce indistintamente neonati, bambini e adulti. Dopo l'infezione
primaria, l'HSV colonizza i neuroni sensoriali e l'infezione latente può
riattivarsi causando un'infezione clinica ricorrente.
Le donne che contraggono il virus HSV tipo-1 o tipo-2 durante la
gravidanza possono trasmettere il virus al bambino prima o durante il
parto. Le infezioni in utero possono causare aborti spontanei o parti
prematuri. Il rischio maggiore di infezione neonatale interessa i bambini la
cui madre abbia contratto l'infezione genitale durante l'ultimo trimestre di
gravidanza. Le infezioni congenite e neonatali possono essere causate da
un'infezione primaria o ricorrente, sintomatica o asintomatica della madre,
e possono causare infezioni della pelle, degli occhi o della bocca, ma
anche danni al sistema nervoso centrale nel neonato.
Nelle infezioni primarie da HSV, gli anticorpi IgM compaiono generalmente
fra il terzo e il settimo giorno dopo la manifestazione dei sintomi. Il titolo di
anticorpi IgM aumenta nelle successive quattro - sei settimane per poi
tornare generalmente a livelli non rilevabili dopo due mesi. Talvolta è
possibile rilevare anticorpi IgM anti-HSV nelle infezioni ricorrenti. Tuttavia,
la produzione e determinazione degli anticorpi IgM anti-HSV nei pazienti
con infezioni ricorrenti è meno prevedibile e può essere correlata alla
gravità dell'infezione stessa. Gli anticorpi IgG anti-HSV generalmente
compaiono a distanza di una o due settimane dalla manifestazione
dell'infezione e persistono a vari livelli per tutta la vita.
68
Per determinare gli anticorpi anti-HSV sono stati sviluppati numerosi
metodi sierologici, fra i quali la fissazione del complemento,
l'immunofluorescenza indiretta, la neutralizzazione su placca e il test
ELISA. Rispetto ad altri test sierologici, la tecnica ELISA può fornire un
elevato livello di specificità, sensibilità e affidabilità nella determinazione
degli anticorpi anti-HSV. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi
sierologici che consentono di stabilire lo stato immunitario nei confronti del
virus HSV, utilizza lisati virali come antigene. A causa delle significativa
reattività crociata esistente fra i virus HSV-1 e HSV-2 e della schiacciante
prevalenza di infezioni da HSV-1, è praticamente impossibile differenziare
in modo affidabile le infezioni HSV-1 da quelle HSV-2 con questi test (2).
Recentemente sono stati sviluppati test sierologici HSV tipo-specifico
basandosi sulla significativa differenza esistente fra la proteina gG-1
dell'HSV-1 e la proteina gG-2 dell'HSV-2 (2)
Il kit PlateliaTM HSV 2 IgG utilizza un frammento peptidico sintetico della
glicoproteina gG-2 immobilizzato su micropozzetti al fine di garantire una
migliore specificità e un'accurata distinzione fra l'infezione da HSV 1 e
quella da HSV 2.
3. PRINCIPIO
Platelia™ HSV 2 IgG è un test qualitativo per la determinazione degli
anticorpi IgG anti-HSV 2 nel siero o nel plasma umano mediante un
metodo immunoenzimatico ELISA indiretto.
I frammenti sintetici della glicoproteina gG-2 vengono utilizzati per
sensibilizzare la micropiastra. Come coniugato viene utilizzato un
anticorpo policlonale marcato con perossidasi specifico per le catene
gamma umane (anti-IgG). Il test prevede le seguenti fasi:
• Fase 1
I campioni dei pazienti e i controlli vengono diluiti in rapporto 1/21, quindi
distribuiti nei pozzetti della micropiastra. Durante questa incubazione di
un'ora a 37° C, gli anticorpi IgG anti-HSV 2 presenti nel campione si
legano al frammento peptidico sintetico della glicoproteina gG-2 adeso ai
pozzetti della micropiastra. Gli anticorpi non specifici non legati e altre
proteine seriche vengono eliminati dai lavaggi successivi all'incubazione.
• Fase 2
Il coniugato (anticorpo polyclonale marcato con perossidasi specifico per
le catene gamma umane) viene aggiunto nei pozzetti della micropiastra.
Durante questa incubazione di un'ora a 37°C, l'anticorpo monoclonale
marcato si lega al siero IgG catturato dal frammento della glicoproteina
gG 2. Il coniugato non legato viene eliminato dai lavaggi successivi
all'incubazione.
69
• Fase 3
La presenza di immunocomplessi (frammento della glicoproteina gG-2,
anticorpi IgG anti-HSV 2, coniugato anti-IgG) viene dimostrata attraverso
l'aggiunta di una soluzione di sviluppo enzimatica in ogni pozzetto.
• Fase 4
Al termine del periodo di incubazione a temperatura ambiente (+18 - 30°C),
la reazione enzimatica viene bloccata attraverso l'aggiunta di una
soluzione di acido solforico 1N. La lettura della densità ottica ottenuta con
uno spettrofotometro impostato su 450/620 nm è proporzionale alla
quantità di anticorpi IgG anti-HSV 2 presenti nel campione.
4. INFORMAZIONI SUL PRODOTTO
Le quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire
l'esecuzione di 96 test. Tutti i reagenti sono destinati all'uso esclusivo nella
diagnostica in vitro.
R1
Marcatura
Natura dei reagenti
Presentazione
1
Microplate Micropiastra (Pronta per l'uso): 12 strip
con 8 pozzetti divisibili, sensibilizzati con
frammento sintetico di glicoproteina gG-2
R2 Concentrated Soluzione di lavaggio concentrata (20x):
Washing Tampone TRIS-NaCl (pH 7,4),
Solution (20x) 2 % Tween® 20
Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
1 x 70 ml
R3
Negative
Control
Controllo negativo:
Siero umano negativo per anticorpi IgG
anti-HSV 2 e negativo per antigene HBs,
anti-HIV1, anti- HIV2 e anti-HCV
Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
1 x 0,75 ml
R4
Calibrator
Calibratore:
Siero umano reattivo per anticorpi IgG
anti-HSV 2 e negativo per antigene HBs,
anti-HIV1, anti- HIV2 e anti-HCV
Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
1 x 0,75 ml
R5
Positive
Control
Controllo positivo:
Siero umano reattivo per anticorpi IgG antiHSV 2 e negativo per antigene HBs, antiHIV1, anti- HIV2 e anti-HCV
Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
1 x 0,75 ml
70
Marcatura
Natura dei reagenti
R6
Conjugate
(51x)
Coniugato (51x): Anticorpo policlonale di
capra anti-catene gamma umane unito a
perossidasi di rafano
Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
R7
Diluent
Diluente per campioni e coniugato
(Pronto per l'uso): Tris-NaCl (pH 7,7), siero
di vitello fetale, rosso fenolo
Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
R9
R10
Chromogen Cromogeno (Pronto per l'uso):
TMB
3.3’.5.5’ tetramethylbenzidine (< 0.1%),
H2O2 (<1%)
Stopping
Solution
Soluzione bloccante (Pronta per l'uso):
Soluzione di acido solforico 1N
Pellicola adesiva per micropiastre
Presentazione
1 x 0,7 ml
1 x 80 ml
1 x 28 ml
1 x 28 ml
4
Per informazioni sulle condizioni di conservazione e sulla data di
scadenza, consultare le indicazioni riportate sulla confezione.
5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI
L'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle
buone prassi di laboratorio riportate di seguito:
• Non utilizzare reagenti scaduti.
• Non mischiare, né combinare reagenti provenienti da lotti diversi in uno
stesso ciclo.
OSSERVAZIONE: per la soluzione di lavaggio (R2, identificativo
etichetta: 20x color verde), il Cromogeno (R9, identificativo etichetta:
TMB color turchese) e la soluzione bloccante (R10, identificativo
etichetta: 1N color rosso) è possibile utilizzare lotti diversi da quelli
contenuti nel kit, a condizione che i reagenti siano strettamente
equivalenti e venga utilizzato un unico lotto in una stessa seduta
analitica.
OSSERVAZIONE: Inoltre, la Soluzione di Lavaggio (R2, identificazione
dell’etichetta : 20X di colore verde ) può essere miscelata con le altre
2 soluzioni di lavaggio incluse in vari kit di reattivi Bio-Rad
(R2, identificazioni delle etichette : 10x di colore blu o 10x di colore
arancione) una volta adeguatamente ricostituite, a condizione che
all’interno di una seduta analitica venga utilizzata solo una miscela.
71
• Prima dell'uso, attendere circa 30 minuti per consentire al reagente di
raggiungere la temperatura ambiente (18-30°C).
• Ricostituire o diluire con cura i reagenti evitando contaminazioni.
• Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (vapori acidi, alcalini e
di aldeide) o polvere potenzialmente in grado di alterare l'attività
enzimatica del coniugato.
• Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure elementi in vetro
perfettamente lavati ed asciugati con acqua deionizzata.
• Il lavaggio della micropiastra è una fase essenziale della procedura:
eseguire il numero di cicli di lavaggio raccomandato e assicurarsi che
tutti i pozzetti, una volta riempiti, vengano completamente svuotati. Un
lavaggio inadeguato può condurre a risultati inesatti.
• Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo di tempo compreso fra
la fine dell'operazione di lavaggio e la distribuzione del reagente.
• Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la
soluzione di sviluppo.
• La reazione enzimatica è particolarmente sensibile al metallo o agli ioni
metallici. Di conseguenza, evitare che gli elementi di metallo entrino in
contatto con le varie soluzioni contenenti il coniugato o il cromogeno.
• La soluzione di cromogeno (R9) deve essere incolore. La colorazione
blu indica che il reagente non può essere utilizzato, pertanto dovrà
essere sostituito.
• Utilizzare puntali diversi per ogni campione.
• Verificare l'accuratezza delle pipette e il buon funzionamento delle altre
strumentazioni.
ISTRUZIONI DI SICUREZZA E IGIENE
Il materiale di origine umano utilizzato nella preparazione dei reagenti è
stato analizzato e classificato non reattivo per l'antigene di superficie
dell'epatite B (HBs Ag), gli anticorpi per il virus dell'epatite C (anti-HCV) e il
virus dell'immunodeficienza umana (anti-HIV1 e anti-HIV2). Dato che
nessun metodo può garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti
infettivi, manipolare i reagenti di origine umana e i campioni dei pazienti
come potenzialmente infetti.
• Qualsiasi materiale, comprese le soluzioni di lavaggio, che entri
direttamente in contatto con campioni e reagenti contenenti materiali di
origine umana deve essere considerato potenzialmente in grado di
trasmettere malattie infettive.
• Indossare guanti monouso durante la manipolazione dei campioni e dei
reagenti.
• Non pipettare con la bocca.
72
• Evitare di rovesciare campioni o soluzioni contenenti campioni. Pulire le
superfici contaminate con candeggina diluita al 10%. Se il liquido
contaminante è un acido, neutralizzare le superfici con bicarbonato di
sodio, quindi pulire con candeggina diluita al 10% e asciugare con carta
assorbente. Il materiale utilizzato per la pulizia deve essere gettato in un
contenitore speciale per rifiuti contaminati.
• Dopo la decontaminazione, eliminare i campioni dei pazienti, i reagenti
contenenti materiale di origine umana, compreso il materiale e i prodotti
contaminati mediante uno dei seguenti metodi:
- immersione nella candeggina alla concentrazione finale di 5% di
ipocloruro di sodio per 30 minuti,
- oppure lavaggio in autoclave a 121°C per almeno 2 ore.
ATTENZIONE: non introdurre soluzioni contenenti ipocloruro di sodio
nell'autoclave
• Evitare qualsiasi contatto del Cromogeno e della Soluzione bloccante
con la pelle e le mucose (rischi di tossicità, irritazione o ustioni).
• La manipolazione e l'eliminazione dei residui chimici e biologici devono
essere eseguite attenendosi alle buone prassi di laboratorio.
• Tutti i reagenti forniti nel kit sono destinati all'uso esclusivo nella
diagnostica in vitro.
Xi - Irritante
Attenzione: alcuni reagenti contengono ProclinTM 300 < 1,5%
R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle
S28-37: In caso di contatto con la pelle, lavarsi
immediatamente e abbondantemente con acqua e sapone.
Indossare guanti adatti
6. PRELIEVO, PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI
CAMPIONI
1. Il siero e il plasma (EDTA, eparina o citrato) sono i tipi di campione
raccomandati.
2. Per la manipolazione, l'elaborazione e la conservazione dei campioni
ematici, attenersi alle seguenti raccomandazioni:
• Prelevare tutti i campioni di sangue secondo le precauzioni in uso.
• Per il siero, consentire la completa coagulazione dei campioni prima di
procedere alla centrifugazione.
• Assicurarsi che le provette siano sempre chiuse.
• Dopo la centrifugazione, separare il siero o il plasma dal coagulo o dai
globuli rossi e conservarlo in una provetta chiusa ermeticamente.
• È possibile conservare i campioni a una temperatura compresa fra +2 e
8°C a condizione che il test venga eseguito entro 7 giorni.
73
• Se il test non viene eseguito entro 7 giorni, o per motivi di consegna,
congelare i campioni a una temperatura di -20°C o inferiore.
• Non utilizzare campioni scongelati più di cinque volte. I campioni
precedentemente congelati devono essere miscelati bene (Vortex) dopo
lo scongelamento e prima del test.
3. I campioni contenenti 90 g/l di albumina o 100 mg/l di bilirubina non
coniugata, campioni lipemici contenenti l'equivalente di 36 g/l di
trioleina (trigliceride) e i campioni sottoposti ad emolisi contenenti fino a
10 g/l di emoglobina non influenzano i risultati.
4. Non riscaldare i campioni.
7. PROCEDURA
7.1 MATERIALE RICHIESTO, MA NON FORNITO
• Agitatore tipo Vortex.
• Lettore di micropiastre dotato di filtri 450 nm e 620 nm (*).
• Incubatore di micropiastre con regolazione termostatica impostata su
37±1°C (*).
• Sistema di lavaggio automatico, semi-automatico o manuale per
micropiastre (*).
• Acqua distillata o deionizzata sterile.
• Guanti monouso.
• Occhiali di sicurezza o antispruzzo.
• Carta assorbente.
• Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o
preimpostate per misurare e dispensare da 10 µl a 1.000 µl e 1 ml, 2 ml
e 10 ml.
• Cilindri graduati con capacità di 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1.000 ml.
• Ipocloruro di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio.
• Contenitore per rifiuti biologici.
• Provette monouso.
(*) Per informazioni dettagliate sulla strumentazione raccomandata,
consultare il nostro reparto tecnico.
7.2 RICOSTITUZIONE DEI REAGENTI
• R1: Prima di aprire la bustina di plastica, lasciare 30 minuti a
temperatura ambiente (18-30°C). Estrarre il vassoio, riporre
immediatamente le strip non utilizzate nella bustina e verificare la
presenza di essiccante. Richiudere con cura la bustina e conservarla a
2-8°C.
74
• R2: Diluire in rapporto 1/20 la soluzione di lavaggio R2 in acqua
distillata: ad esempio 50 mL di R2 e 950 mL di acqua distillata per
ottenere la soluzione di lavaggio pronta per l'uso. Preparare 350 mL di
soluzione di lavaggio diluita per una piastra da 12 strip in caso di
lavaggio manuale.
• R3, R4, R5: Diluire in rapporto 1/21 nel Diluente (R7) (esempio: 15 µL di
R3 + 300 µL di R7).
• R6+R7: Il coniugato (R6) è concentrato 51x e deve essere
omogeneizzato prima dell'uso. Diluire in rapporto 1/51 nel Diluente (R7).
Per una piastra, diluire 0,5 ml di Coniugato (R6) in 25 ml di Diluente (R7).
Per ottenere il volume necessario per due strip, dividere i suddetti
volumi per 5.
7.3 CONSERVAZIONE E VALIDITÀ DEI REAGENTI APERTI E / O
RICOSTITUITI
Il kit deve essere conservato a 2-8°C. Se viene conservato a 2-8°C prima
dell'apertura, ogni componente può essere utilizzato fino alla data di
scadenza indicata sull'etichetta riportata sul kit.
• R1: Dopo l'apertura, le strip mantengono la stabilità fino a 8 settimane,
se conservate a 2-8°C nella stessa bustina sigillata (verificare la
presenza di essiccante).
• R2: Dopo la diluizione, la Soluzione di lavaggio può essere conservata
per 2 settimane a 2-30°C. La Soluzione di lavaggio concentrata
conservata a 2-30°C, in assenza di contaminazione, mantiene la
stabilità fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta.
• R3, R4, R5, R6, R7: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i
reagenti conservati a +2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.
• R6+R7: Dopo la diluizione, la soluzione di lavoro del coniugato
mantiene la stabilità per 8 ore a temperatura ambiente (18-30°C) oppure
per 24 ore a 2-8°C.
• R9: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti
conservati a 2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.
• R10: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, il reagente
conservato a 2-8°C mantiene la stabilità fino alla data di scadenza
indicata sull'etichetta.
7.4 PROCEDURA
Seguire attentamente la procedura descritta di seguito e le buone prassi di
laboratorio.
Prima dell'uso, consentire al reagente di raggiungere la temperatura
ambiente (18-30°C).
75
Se si utilizzano pozzetti divisibili, prestare particolare attenzione durante la
manipolazione.
Utilizzare i controlli negativi, positivi e di cut-off in ogni ciclo per
convalidare i risultati del test.
1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione per i
controlli e i campioni dei pazienti.
2. Preparare la Soluzione di lavaggio diluita (R2) [ Fare riferimento alla
Sezione 7.2].
3. Estrarre il vassoio e le strip (R1) dall'involucro protettivo [Fare riferimento
alla Sezione 7.2].
4. Diluire i controlli R3 ed R5, il calibratore R4 e i campioni dei pazienti (S1,
S2…) nel Diluente (R7) per ottenere una diluizione in rapporto 1/21:
15 µl di campione e 300 µL di Diluente (R7). Vortexare i campioni diluiti.
5. Distribuire in ogni pozzetto 200 µl di controlli diluiti, del calibratore e di
campioni dei pazienti secondo lo schema riportato di seguito:
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
R3
R4
R4
R5
S1
S2
S3
S4
S5 S13
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
6. Ricoprire la micropiastra con la pellicola adesiva ed esercitare pressione
per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la micropiastra a
bagnomaria termostatato o in un incubatore a secco per 1 ora
± 5 minuti a 37°C ± 1°C.
7. Al termine del primo periodo di incubazione, rimuovere il nastro
sigillante adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un
contenitore per rifiuti biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la
micropiastra 5 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio (R2).
Capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente su carta
assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.
8. Preparare la soluzione di lavoro del coniugato (R6+R7) [Fare riferimento
alla Sezione 7.2]. Distribuire immediatamente 200 µl della soluzione di
lavoro del coniugato (R6+R7) in tutti i pozzetti. Agitare leggermente la
soluzione prima dell'uso.
76
9. Ricoprire la micropiastra con la pellicola adesiva ed esercitare pressione
per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la micropiastra a
bagnomaria termostatato o in un incubatore a secco per 1 ora
± 5 minuti a 37°C ± 1°C.
10. Al termine del secondo periodo di incubazione, rimuovere il nastro
sigillante adesivo. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore
per rifiuti biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra
5 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la
micropiastra e picchiettare delicatamente su carta assorbente per
rimuovere il liquido in eccesso.
11. Distribuire rapidamente in ogni pozzetto e al riparo dalla luce 200 µl di
Cromogeno (R9). Far sviluppare la reazione al buio per 30 ± 5 minuti a
temperatura ambiente (+18-30°C). Non utilizzare nastri sigillanti adesivi
durante questo periodo di incubazione.
12. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 100 µl di Soluzione
bloccante (R10) in ogni pozzetto. Utilizzare la stessa sequenza e lo stesso
ritmo di distribuzione utilizzati per la soluzione di sviluppo.
13. Asciugare accuratamente il fondo della piastra. Leggere la densità ottica a
450/620 nm mediante un lettore nei 30 minuti successivi alla reazione. Non
esporre le strip alla luce prima della lettura.
14. Prima della trascrizione dei risultati, verificare la corrispondenza fra la
lettura e il piano di distribuzione delle piastre e dei campioni.
8. CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
8.1 CALCOLO DEL VALORE SOGLIA (CUT-OFF) (CO)
Il valore di Cut-Off (CO) corrisponde al valore medio delle densità ottiche
(DO) dei duplicati del calibratore (R4):
• CO = media di DO R4
8.2 CALCOLO DEL RAPPORTO CAMPIONE
Il risultato per un campione viene espresso sotto forma di rapporto
mediante la seguente formula:
• Rapporto Campione = DO campione/CO
8.3 CONTROLLO DI QUALITA
Analizzare i risultati ottenuti da tutti i controlli per ogni micropiastra e per
ogni ciclo. Per la convalida del test, è necessario soddisfare i seguenti
criteri:
• Valori delle densità ottiche:
- CO ≥ 0,300
- 0,80 x CO < DO R4 Duplicato 1 < 1,20 x CO
77
- 0,80 x CO < DO R4 Duplicato 2 < 1,20 x CO
(La singola DO di ogni duplicato del calibratore (R4) non deve differire più
del 20% dal valore CO).
• Rapporti delle densità ottiche:
- Rapporto R3 (DO R3 / CO) ≤ 0,50
- Rapporto R5 (DO R5 / CO) ≥ 1,80
Se non vengono rispettati i criteri del controllo di qualità, la seduta
analitica dovrà essere ripetuta.
8.4 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Rapporto campione Risultato
Interpretazione
Rapporto < 0,90
Negativo Il campione è considerato non reattivo per la presenza
di anticorpi IgG anti-HSV 2.
0,90 ≤ Rapporto
< 1,10
Rapporto ≥ 1,10
Equivoco Il campione è considerato equivoco per la presenza di
anticorpi IgG anti-HSV 2. Il risultato deve essere
confermato da un altro test eseguito su un secondo
campione prelevato ad almeno 4 - 12 settimane di
distanza dalla data della prima analisi.
Positivo
Il campione è considerato reattivo per la presenza di
anticorpi IgG anti-HSV 2.
In caso di sospetta infezione, potrebbe essere utile condurre ulteriori test
sierologici, come la determinazione degli anticorpi IgM anti-HSV, per
confermare la diagnosi.
In caso di risultati vicini alla zona grigia si deve prestare una attenzione
particolare agli altri elementi del processo diagnostico.
8.5 GUIDA ALLA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI
Le reazioni non convalidate o non ripetibili spesso sono causate da:
• Lavaggi della micropiastra inadeguati.
• Contaminazione dei campioni negativi tramite siero o plasma con alto
titolo di anticorpi.
• Contaminazione della soluzione di sviluppo tramite agenti chimici
ossidanti (candeggina, ioni metallici...).
• Contaminazione della Soluzione bloccante.
9. EFFICACIA
Il kit Platelia™ HSV 2 IgG è stato valutato su 2 siti diversi su un totale di
751 campioni freschi o congelati. I risultati ottenuti con Platelia™ HSV 2
IgG sono stati confrontati con i risultati ottenuti con altri test EIA disponibili
in commercio.
78
9.1 PREVALENZA
Al fine di determinare la prevalenza degli anticorpi IgG anti-herpes simplex
tipo 2 nel siero umano, sono stati analizzati 180 campioni di sangue di
donne in gravidanza. I risultati ottenuti sono stati i seguenti: 155 sieri
negativi e 25 positivi. La prevalenza determinata mediante il test Platelia™
HSV 2 IgG si attesta intorno al 13,9% (25/180).
9.2 SPECIFICITÀ
La specificità è stata determinata su un totale di 558 campioni:
• Sul sito 1, un panel di 312 campioni di donatori di sangue, donne in
gravidanza e panel commerciali (CDC(A) /BBI(B)).
• Sul sito 2, un panel di 247 campioni di pazienti ricoverati.
Su entrambi i siti, i campioni sono stati selezionati sulla base dei risultati
negativi ottenuti con il test EIA disponibile in commercio e considerato lo
standard di riferimento.
Panel di
campioni
Negativo
Equivoco (1)
Positivo
Specificità
Sito 1
N = 312
305
2
5
(305/310)
[96,3%-99,5%]
Sito 2
N = 247
231
4
12
(231/243)
[91,5%-97,4%]
Totale
N = 559
536
6
17
(536/553)
[95,1%-98,2%]
98,4%
95,1%
96,9%
(1)
I risultati equivoci sono stati esclusi dal calcolo della specificità.
IC 95%: intervallo di confidenza 95%.
(A): Center for Disease Control, (B) BBI panel HSV con titoli diversi
9.3 SENSIBILITÀ
La sensibilità è stata determinata su un totale di 172 campioni:
• Sul sito 1, un panel di 135 campioni di donatori di sangue, donne in
gravidanza e panel commerciali (CDC(A) /BBI(B)).
• Sul sito 2, un panel di 57 campioni di pazienti ricoverati.
Su entrambi i siti, i campioni sono stati selezionati sulla base dei risultati
positivi ottenuti con il test EIA disponibile in commercio e considerato lo
standard di riferimento.
79
Panel di
campioni
Negative
Negativo (1)
Positivo
Sensibilità
Sito 1
N = 135
1
3
131
(131/132)
[95,8%-100%]
Sito 2
N = 57
0
0
57
(57/57)
[94,9%-100%]
Totale
N = 192
1
3
188
(188/189)
[97,1%-100%]
99,2%
100%
99,5%
(1)
I risultati equivoci sono stati esclusi dal calcolo della sensibilità.
9.4 PRECISIONE
• Precisione intra-saggio (ripetibilità):
Al fine di valutare la ripetibilità intra-saggio, un campione negativo, un
campione equivoco e un campione positivo sono stati analizzati 30 volte
durante lo stesso ciclo. Il rapporto (DO campione / CO) è stato
determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce
la media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di
variazione (%CV) per ciascuno dei tre campioni:
N=30
Campione
negativo
Media
DS
% CV
0,82
0,08
9,99%
Campione
equivoco
Campione
debolmente positivo
Rapporto (DO campione / Valore di cut-off)
0,97
0,10
9,87%
1,30
0,09
7,26%
• Precisione inter-saggio (riproducibilità):
Al fine di valutare la riproducibilità inter-saggio, un campione negativo e tre
campioni positivi (uno debolmente, uno mediamente e uno fortemente
positivo) sono stati analizzati in duplicato in due cicli al giorno per un
periodo di oltre 20 giorni. Il rapporto (DO campione / CO) è stato
determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce
la media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di
variazione (%CV) per ciascuno dei quattro campioni:
80
N=80
Campione
negativo
Media
DS
% CV
0,17
0,02
13,1%
Campione
debolmente
positivo
Campione
mediamente
positivo
Campione
fortemente
positivo
Rapporto (DO campione / Valore di cut-off)
1,56
0,16
10.2%
2,74
0,33
11,9%
3,44
0,38
11,0%
9.5 REATTIVITÀ CROCIATA
105 campioni con caratteristiche tali da determinare reazioni non
specifiche sono stati analizzati con il test Platelia™ HSV 2 IgG. I risultati
ottenuti vengono riportati nella seguente tabella:
Panel
Numero di
campioni
Equivoco (1)
Positivo
Conferma
risultati positivi
mediante
sierologia di
riferimento
VZV
10
1
2
2/2
CMV
10
0
3
3/3
EBV
10
0
1
1/1
Fattore reumatoide
13
0
4
4/4
Anticorpi eterofili
(HAMA)
10
0
2
2/2
Anticorpi antinucleo
(ANA)
14
0
2
2/2
HHV 6
9
0
2
2/2
81
Positivo
Conferma
risultati positivi
mediante
sierologia di
riferimento
1
8
8/8
10
0
2
2/2
Morbillo
9
0
1
1/1
TOTALE
105
2
27
27/27
Panel
Numero di
campioni
HIV
10
Parotite epidemica
Equivoco
(1)
I risultati equivoci sono stati esclusi dalla valutazione della reattività
crociata.
Tutti i risultati positivi al test Platelia™ HSV 2 IgG sono stati confermati dal
test EIA disponibile in commercio.
(1)
10. LIMITI DELLA PROCEDURA
La diagnosi dell'infezione da HSV può essere stabilita solamente sulla
base di una combinazione di dati clinici e biologici. Il risultato di un singolo
test di ricerca degli anticorpi IgG anti-HSV non costituisce una prova
sufficiente per la diagnosi dell'infezione da Herpes simplex virus.
11. CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE
Tutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema di
qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione
del prodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può
essere commercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione
prestabiliti. La documentazione relativa alla produzione e ai controlli di
ogni singolo lotto è conservata presso Bio-Rad.
82
8
REFERENCES
1. Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines 2002.
MMWR 2002:51 (No. RR-6).
2. Arvin, A, C Prober. Herpes Simplex Viruses. 876-883. In Murray, P, E Baron, M Pfaller, F Tenover, and
R Yolkenet (eds.). Manual of Clinical Microbiology. 6th Ed. ASM, Washington, D.C. (1995)
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