Lo Sviluppo Delle Colonie in
E.Coli
Uno Sguardo Più Ravvicinato
Esaminando Le Colonie Di
E.Coli:
• E’ cresciuta la convinzione
che fossero tutt’altro che
semplici agglomerati di
batteri.
• E’ maturato un crescente
interesse nell’evoluzione delle
colonie di moltissimi
organismi
• E’ stato confermato l’alto
grado di intercomunicazione
tra i batteri
Lo sviluppo “multicellulare” della
colonia
Differenti ceppi e differenti specie danno
luogo a differenti tipi di colonie
La crescita della colonia e’ un
processo altamente regolato.
E’ nata l’esigenza di capire
come si potesse arrivare a
certi patterns.
E’ noto che le colonie sono strutture specifiche i cui
profili sono soggetti ad una determinazione ereditaria.
Le colonie infatti tendono ad assumere una
configurazione circolare,crescendo verso l’esterno e
aggiungendo nuove cellule lungo il perimetro.
Inoltre molto spesso,soprattutto in E.Coli, tendono a
seguire modelli di crescita sia concentrici che
radiali,o a settori.
Studi approfonditi ci suggeriscono modelli di crescita
determinati da regole e da una qualche forma di
controllo temporale.
Come E’ Possibile Studiare Questo
Fenomeno?
• Mediante l’uso di Trasposoni Mudlac per
visualizzare direttamente sulla piastra la
differente attivita’ genetica degl’individui
nella stessa colonia
• Mediante l’utilizzo del Microscopio
Elettronico a Scansione (SEM) per vedere
lo sviluppo morfologico della colonia nel
tempo
L’uso di trasposoni Mudlac e’ un ottimo metodo per
studiare in maniera quantitativa l’attività genetica delle
cellule di una colonia.
Questo trasposone ha al suo interno il gene lacZ che
codifica per la b-Galattosidasi,oltre a lacY per la
permeasi,e può creare opportune fusioni genetiche
all’interno dei batteri in cui e’ inoculato che pongono
l’attivita’ di questi geni sotto una varieta’ di sistemi
regolatori in grado di esprimerli.Se il tutto viene effettuato
su di un opportuno terreno,come X-Gal,si possono
utilizzare le macchie indotte dalla b-Galattosidasi per
visualizzare la storia dello sviluppo della colonia e certi
aspetti della sua organizzazione interna.
In questo modo si può vedere se avvengono cambiamenti genetici
all’interno di cellule di una stessa colonia,proprio perche’ questi
eventuali cambiamenti,o riarrangiamenti genetici, favoriscono la
replicazione e la successiva espressione di questi trasposoni.Infatti
questi possono inserirsi quasi in tutti i locus genici,rendendo
monitorabile l’espressione di molte funzioni durante lo sviluppo
della colonia.
Quando una colorazione istochimica per l’attivita’ della bGalattosidasi e’ applicata alla crescita di E.Coli in agar ,si vede che
che pigmentazione non e’ uniforme ed e’ capace di rivelare
l’organizzazione interna della colonia in differenti tipi cellulari.
Cosa Si E’ Scoperto Con
Questo Metodo?
Essenzialmente si e’ arrivati a 3
conclusioni:
1) Cellule Vecchie in Centro Cellule Nuove in Periferia
•
Utilizzando il trasposone Mudlac
e un ceppo con repressore per il
gene lac termosensibile (inattivo
a 40 °C e attivo a 32°C) si e’
sottoposto le colonie a differenti
temperature per differenti
intervalli di tempo.
22h a 40°
poi 47h a
32°
•
•
L’utilizzo di un terreno con XGal ha reso evidente lo sviluppo
sequenziale delle cellule.
Come si vede dall’immagine a
fianco le cellule piu’ giovani
vengono aggiunte alla periferia
della colonia, mentre quelle
vecchie rimangono al centro.
41h a 32°
poi 29h a
40°
71h a
32°
15h a 40° poi
56h a 32°
41h a 40° poi
48h a 32°
2) Esclusività Clonale
•
Sono visibili due differenti tipi di
colorazioni,una piu’ chiara (lighter) e una
piu’ scura (darker) ,che differenziano due
diversi tipi cellulari,provenienti da differenti
settori
•
E’ stato osservato che vi erano confini netti
fra differenti popolazioni clonali in contatto
tra loro.
•
Le distinzioni sono nette.
•
Non c’e’ assolutamente nessun miscuglio tra
questi due tipi cellulari.
•
Esistono all’interno della stessa colonia
differenti tipi cellulari che svolgono
differenti funzioni.
3)Organizzazione Clonale e Non-Clonale
• Esistono 2 tipi di
organizzazioni batteriche:
clonale e non-clonale.
• L’organizzazione clonale si
riflette in quei settori che si
estendono radialmente verso
l’esterno,in direzione della
periferia.
• L’organizzazione non-clonale
si riflette in strutture
concentriche,che cambiano
man mano che aumenta la
distanza dal centro.
Ogni settore consiste in una progenie che si espande verso
l’esterno che DISCENDE TUTTA DA UN PROGENITORE
COMUNE.
Cellule individuali provenienti da
diversi settori hanno DNA
differente.
Le cellule di un elemento concentrico hanno le
medesime caratteristiche di espressione
genetica,MA NON DISCENDONO DA UN
PROGENITORE COMUNE.
Le cellule di ogni anello sono
direttamente correlate a quelle
degl’anelli precedenti e seguenti,non
tra di loro.
Due diverse spiegazioni possono essere date come le
colonie si organizzano clonalmente o non clonalmente:
1) Non ci sono specifici meccanismi di controllo
coinvolti,ma la proliferazione cellulare ed il
metabolismo creano gradienti chimici e fisici che
generano zone concentriche e influenzano la
proliferazione clonale
2) Lo sviluppo dei batteri in agar coinvolge il
funzionamento di sistemi di regolazione morfogenetici
analoghi a quelli degl’organismi multicellulari
Non e’ ancora stato accertato.
Di sicuro non sembra solo un
processo dovuto alla creazione di
gradienti: e’ troppo complesso.
Da questi dati,la formazione
di una colonia e’ un processo
complicato,che richiede il
coordinamento dell’attivita’
di molte cellule.
Questo indica che la morfogenesi
geneticamente controllata e’ una
caratteristica abbastanza generale.
L’utilizzo della microscopia elettronica a
scansione ha permesso un esame esauriente
dello sviluppo della colonia di E.Coli in un arco
di tempo di 68 h,senza ricorrere a metodologie
troppo complicate sperimentalmente,ma
limitandosi ad una pura e semplice
osservazione,che comunque ha fornito
importanti indicazioni.
Si e’ potuto osservare infatti direttamente in
piastra lo sviluppo di un inoculo di 1 ml di
cellule di E.Coli ,incubate a 32°.
Cosa Si E’ Visto Esaminando La
Superficie Della Colonia?
• La colonia e’ organizzata in zone
concentriche differenti.
• Diverse conformazioni morfologiche sono
osservabili.
• Le colonie non sono fatte da cellule uguali
ma da cellule altamente differenziate.
• Le cellule secernono sostanze che formano
come una “pelle” sopra la superficie
dell’agar.
A Vari Tempi Compaiono Le Seguenti
Strutture:
• Un basso anello di depressione che marca il sito di
inoculazione
• Un anello con una rientranza più profonda che sposta la
sua posizione col l’accrescersi della colonia
• Una regione tra i due anelli ad altipiano che si espande
• Un rialzo al di fuori dell’anello a rientranza
• Un orlo piatto che si estende sul substrato (si puo’
presentare o meno)
Tutto Questo Ci Serve Per:
• Abbandonare la vecchia idea che la colonia e’ un
qualcosa di molto semplice,destinato a svilupparsi
come un uniforme ammasso di batteri.
• Aiutarci a comprendere di piu’ l’idea dei batteri
come esseri compresi in un contesto
multicellulare.
• Spingerci a cercare di capire come,mediante quali
molecole,questi organismi,comunicano tra di loro
e si dispongono secondo certi schemi
apparentemente definiti.