SESSIONE 2
BASI MOLECOLARI
DELLE FISIOPATOLOGIE
NEUROVEGETATIVE
Coordinatori L. Bubacco e F. Gambale
RELAZIONI SU INVITO
AGGREGATION OF POLYPEPTIDE CHAINS AND AGGREGATE
TOXICITY: THE HIDDEN FACE OF PROTEIN BIOLOGY
M.Stefani1
1
Department of Biochemical Sciences, University of Florence
Amyloid diseases are characterized by the presence, in the affected tissues and organs, of
intra- or extracellular fibrillar deposits resulting from the aggregation of one out of around 25
specific peptides and proteins. Such deposits are presently considered the main hallmark and
cause of tissue impairment and cell death underlying the clinical symptoms of the differing
diseases (1). Presently, a growing body of data support the idea that the toxic effects of the
aggregates result from the presence, among them, of pre-fibrillar assemblies preceding the
appearance of mature fibrils whereas the latter are considered the stable, substantially
harmless end-product of the process (1). Until 1998, it was commonly believed that
aggregation was a specific property of the few proteins and peptides found in the differing
amyloidoses due to some specific feature of their amino acid sequences. Indeed, we have
recently shown that physicochemical parameters of the amino acid sequence such as mean
hydrophobicity, net charge and propensity to beta structure may affect the rate of aggregation
of peptides and proteins from their misfolded/unfolded state (2). However, since 1998 an
increasing number of proteins unrelated to disease as well as of peptides as short as 4 amino
acid residues and of amino acid homopolymers have been shown to aggregate in vitro into
fibrillar assemblies undistinguishable from amyloid fibrils; this happens under partially
destabilising conditions where the secondary interactions are still maintained (1). More
recently, we have shown that such amyloid assemblies in their pre-fibrillar organization
display toxicity to cultured cells similarly to pre-fibrillar aggregates of peptides and proteins
associated with amyloid diseases (3). We have also shown that such assemblies impair cell
viability by affecting intracellular free calcium concentration and ROS levels, leading to cell
death by apoptosis or necrosis, as previously reported for peptides and proteins associated
with disease (4). Furthermore, our most recent data show that the same aggregates are toxic
even when microinjected into the nucleus basalis magnocellularis of the rat hippocampus.
Indeed, we have observed neuronal cell death in the injected nuclei comparable to that
previously reported following the microinjection of the same amount of aggregates of Abeta
peptides (5 and unpublished data). Overall, these results clearly indicate that most, possibly
all, peptides and proteins share the potential to misfold and aggregate into supramolecular
assemblies endowed with toxicity to living systems, from simple cultured cells to complex
organisms. These data support the idea that the ability to convert into a misfolded and
aggregated state is inherently present in the peptide backbone of peptides and proteins,
giving them potential to transform into generic toxins to living organisms. This previously
unsuspected, hidden face of peptides and proteins is a new way of viewing these otherwise
fundamental players of life.
1. Stefani M., Dobson C.M. (2003) J. Mol. Med. 81, 678-699.
2. Chiti F., Stefani M., Taddei N., Ramponi G., Dobson C.M. (2003) Nature 424, 805-808.
3. Bucciantini M., Giannoni E., Chiti F., Baroni F., Formigli L., Zurdo J., Taddei N.,
Ramponi G., Dobson C.M., Stefani M. (2002) Nature 416, 507-511.
4. Bucciantini M., Calloni G., Chiti F., Formigli L., Nosi D., Dobson C.M., Stefani M.
(2004) J. Biol. Chem. in press.
5. Giovannini M.G., Scali C., Prosperi C., Bellocci A., Vannucchi M.G., Rosi S., Pepeu G.,
Casamenti F. (2002) Neurobiol. Dis. 11, 257-274.
CARATTERIZZAZIONE
MORFOLOGICA
DI
AGGREGATI
AMILOIDI E LORO CITOTOSSICITÀ IN SISTEMI MODELLO
A. Relini1
1
Dipartimento di Fisica, Università di Genova, Genova
Alcune gravi malattie, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson ,
l’encefalopatia spongiforme e le amiloidosi sistemiche sono associate alla
deposizione nei tessuti di aggregati proteici in forma fibrillare. Questi
aggregati presentano una struttura comune caratteristica, detta amiloide, in
cui le catene polipeptidiche sono organizzate in foglietti beta. Comprendere
le diverse fasi del processo di aggregazione è importante , sia perché
evidenze sperimentali sempre più numerose indicano che il danno cellulare è
causato più dai precursori che dalle fibrille stesse, sia perché la capacità di
dar luogo a strutture amiloidi non è solo propria delle proteine coinvolte nelle
patologie ma riguarda in linea di principio ogni proteina, una volta
identificate opportune condizioni destabilizzanti.
Viene qui presentato lo studio, effettuato utilizzando il microscopio a forza
atomica, del processo di aggregazione in vitro delle proteine HypF (dominio
N- terminale del fattore di maturazione dell’idrogenasi) e acilfosfatasi, non
legate a patologie, di tre forme del peptide A-beta, coinvolto nel morbo di
Alzheimer; e della beta-2 microglobulina, coinvolta nell’amiloidosi associata
ad emodialisi; è inoltre analizzata la struttura delle fibrille di apolipoproteina
A-I ex-vivo associate ad amiloidosi sistemica. Per alcune di queste proteine
la morfologia degli aggregati è stata correlata con la loro tossicità, studiando
mediante tecniche di fluorescenza la permeabilizzazione della membrana di
liposomi da parte degli aggregati proteici al variare del tempo di
aggregazione. I risultati ottenuti mostrano notevoli analogie tra proteine
diverse, sia nella morfologia degli aggregati prefibrillari, sia nella loro
capacità di permeabilizzare la membrana, in accordo con la generalità del
processo di aggregazione.
COMUNICAZIONI ORALI
CU(II) SITE GEOMETRY OF THE OCTAREPEAT DOMAIN OF
PRION PROTEIN: A XAS STUDY
S. Morante1, R. González-Iglesias2, C. Potrich3, C. Meneghini4, W. MeyerKlaucke5, G. Menestrina3, M. Gasset2
1
Dep. Physics, Universitá di Roma “Tor Vergata” and IFNM, Roma, Italy;
2
Insto Química-Física “Rocasolano”, CSIC, Madrid, Spain; 3CNR-ITC,
Istituto di Biofisica,Trento, Italy; 4Dep. Physics “E. Amaldi”, Roma, Italy;
5
European Molecular Laboratory, c/o DESY, Hamburg,Germany
The cellular prion protein, the precursor of the major protein component of
prions, is a Cu(II) binding protein. Cooperative cation binding occurs in the
flexible and dynamic N-terminal protein domain that is characterized by a
highly conserved PHGGGWGQ octarepeat segment. The Cu(II) site
geometry in synthetic peptides containing multiple copies of the octarepeat
and in the α-like form of BoPrP (24-242) in complexes with the metal ion at
various equivalences has been studied using X-ray absorption spectroscopy
(XAS) at the Cu K-edge. Inspection of the near edge region of the spectra
(XANES) confirms that upon binding Cu(II) preserves its oxidation state.
Accurate analysis of the extended region of the XAS spectra (EXAFS) using
a multiple-scattering approach shows the occurrence of two types of
coordination geometries differing in the number of imidazole rings
coordinated to Cu(II). For BoPrP forms containing more than 3 octarepeats at
a half saturation of cation sites, Cu(II) is bonded to two imidazole rings
through nitrogen atoms, whereas in synthetic peptides containing lower site
multiplicity (1 or 2 octarepeats) at substoichiometric site saturation the first
Cu(II) coordination shell contains only one imidazole nitrogen. Increasing
Cu(II) site saturation from 0.5 to 0. 8 in synthetic fragments containing four
copies of the octarepeat an intermediate situation is generated. The modeled
geometries for alternative Cu(II) bindings provide a structural ground for a
positive cooperativity mechanism underlying the cation binding process.
EFFETTO STRUTTURANTE DEI LIPIDI SULL’α-SINUCLEINA: UN
MODELLO TOPOLOGICO
M. Bisaglia1, I. Tessari2, L. Pinato1, M. Bellanda1, E. Bergantino2, L.
Bubacco2 e S. Mammi1
1
Dipartimento di Scienze Chimiche – Università di Padova, 2Dipartimento di
Biologia – Università di Padova.
L’α-sinucleina umana costituisce il principale componente degli aggregati
intracellulari conosciuti come corpi di Lewy, caratteristica principale della
Malattia di Parkinson. Tale proteina risulta essere non strutturata in
condizioni fisiologiche, mentre, in seguito all’interazione con vescicole di
fosfolipidi, la parte N-terminale (residui 1-100) adotta una conformazione
elicoidale. Infine, nelle fibrille presenti nei corpi di Lewy, l’α-sinucleina
forma strutture ricche di foglietti β.
Per meglio elucidare l’influenza esercitata dall’α-sinucleina sulla
eziopatogenesi di disturbi neurodegenerativi, abbiamo affrontato uno studio
topologico, mediante risonanza magnetica nucleare, in un ambiente
membrano-mimetico costituito da micelle di SDS. L’analisi è stata svolta
analizzando gli effetti provocati sulla proteina in seguito all’aggiunta di
agenti paramagnetici in differenti posizioni delle micelle stesse. Tale studio è
stato ulteriormente implementato sfruttando la possibilità di produrre
campioni marcati all’15N della proteina. Misurando le proprietà di
rilassamento NMR dei nuclei 15N dello scheletro polipeptidico abbiamo
infatti potuto ottenere informazioni sui moti locali della proteina distinguendo
le regioni flessibili da quelle maggiormente strutturate. Il modello che emerge
dal nostro lavoro prevede la presenza di due eliche N-terminali posizionate
sulla superficie della membrana ed interrotte da una regione flessibile di una
decina di residui. Anche il dominio centrale della proteina, tra i residui 61-95,
adotta una conformazione elicoidale, ma esso si trova maggiormente inserito
all’interno della micella. I risultati ottenuti avvalorano l’ipotesi che la
conformazione elicoidale sia la forma non patologica della proteina correlata
al suo ruolo fisiologico tuttora sconosciuto.
POSTERS
AGGREGATION AND TOXICITY PROPERTIES OF NORMAL
AGING AND ALZHEIMER’S DISEASE AMYLOID BETA PEPTIDE
C. Canale1, S. Torrassa1, A. Relini1, A. Piccini2, M. Tabaton2 and A. Gliozzi1
1
Department of Physics, University of Genoa, Genoa; 2Department of
Neuroscience, Ophthalmology and Genetics, University of Genoa, Genoa
Aggregation of amyloid beta-peptide (A-beta) is a major cause of
neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Water-soluble A-beta oligomers
have been indicated as the main responsible of neuronal toxicity. However,
abundant accumulation of A-beta also occurs in brain of cognitively normal
elderly people, in absence of neuronal dysfunction. Thus, neuronal toxicity
could depend on the molecular composition, and not on the amount, of water
soluble A-beta oligomers.
We have detected the soluble A-beta species present in cerebral cortex from
cases with sporadic Alzheimer’s disease and cognitively normal elderly
subjects; three different fractions, all ending at residue 42, were identified.
These fractions (A-beta 1-42, A-beta 3-42, A-beta 11-42) were shown to be
present at different relative proportions in normal aging and Alzheimer’s
disease.
We used atomic force microscopy to compare the aggregation pathways of
the single A-beta fractions and their pathological and non-pathological
mixtures. Aggregate-induced liposome permeabilization was studied as a
function of aggregation time. Finally, aggregate toxicity was tested on a
neuroblastoma cell line using the MTT assay. We found that the Alzheimer’s
disease A-beta mixture shows a higher aggregation rate and cellular toxicity,
than those observed with normal aging peptides.
UN SOFTWARE GRAFICO ED INTERATTIVO PER LA RICERCA
DI MICRO E MINI SATELLITI IN SEQUENZE GENOMICHE
Valerio Parisi1, Valeria De Fonzo2, Filippo Aluffi-Pentini3.
1
Dip. Medicina Sperimentale e Patologia, Univ. Roma “La Sapienza”;
2
EuroBioPark, Univ. Roma “Tor Vergata”; 3Dip. Metodi e Modelli
Matematici, Univ. Roma “La Sapienza”.
Dal genoma dinamico alle mutazioni dinamiche, fino alla genetica dinamica1
si conosce ormai un numero crescente di casi importanti in cui il DNA è
alterato in modo più o meno sofisticato. Un esempio importante di
comportamento dinamico del DNA è costituito dai VNTR, ripetizioni
consecutive (TR), in numero variabile, di sequenze di trinucleotidi o
polinucleotidi.
L’importanza dei VNTR è ormai indiscussa, anche per la loro connessione
con numerose malattie, spesso neurodegenerative2, di cui le più famose ed
importanti sono la Corea di Huntington, la malattia di Creutzfeldt-Jakob,
varie sindromi da fragilità cromosomica, varie atassie spinocerebellari.
In questo contesto abbiamo ideato un algoritmo dedicato3, implementato in
linguaggio C, al fine di trovare tutti i TR significativi in tempi brevi (pochi
minuti) anche nelle sequenze lunghe milioni di basi, ossia la lunghezza
massima riportata dalle consuete banche dati.
Abbiamo adesso realizzato un programma in linguaggio Java che migliora
radicalmente la facilità d’uso e la flessibilità dell’algoritmo, in quanto
permette di effettuare localmente e interattivamente sia l’elaborazione di
ricerca sia la presentazione grafica dei risultati. Il programma può essere
usato sia come applet (che non richiede installazione ed è di uso immediato
su qualsiasi computer dotato di browser) sia come applicazione.
Una versione sperimentale è in http://bioinf.dms.med.uniroma1.it/JSTRING
1
De Fonzo V, Bersani E, Aluffi-Pentini F, Parisi V (2000) A new look at the challenging
world of tandem repeats, Med. Hypotheses. 54, 750-760
2
V. De Fonzo, E. Bersani, F. Aluffi-Pentini, T. Castrignanò, V. Parisi (1998) Are only
repeated triplets guilty?, J. Theor. Biol., 194:125-142
3
V. Parisi, V. De Fonzo, F. Aluffi-Pentini (2003) STRING: finding tandem repeats in DNA
sequences, Bioinformatics, 19:1733-1738.
INTERACTION OF BETA-AMYLOID PEPTIDE (25-35) AND LIPID
BILAYERS PROBED BY SPIN-LABEL ESR.
G. Di Santo, R. Bartucci and L. Sportelli
Laboratorio di Biofisica Molecolare, Dipartimento di Fisica and Unità
INFM, Università della Calabria, I-87036 Rende-CS
In order to get insight into the molecular mechanism behind beta-amyloid
toxicity in Alzheimer’s disease, we have studied the influence of Betaamyloid peptide (25-35) fragment on lipid membrane model systems by
spin-label Electron Spin Resonance (ESR) spectroscopy.
We focus on sonicated unilamellar vesicles (SUV) composed of: i) single
component lipids with either zwitterionic dipalmitoylphosphatidylcholine
(DPPC) or charged dipalmitoyl-phosphatidyglycerol (DPPG) polar heads,
ii) binary mixtures of either DPPC or DPPG with cholesterol (Chol) and
iii) ternary mixtures of DPPC/DPPG/Chol, i.e., compositions that mimic the
neuronal membranes. The study was carried out as a function of temperature,
label position along the lipid chain and aging of the peptide fragments.
We found that the insertion of externally administred positively charged
Beta-amyloid peptides to sonicated vesicles increases the spectral anisotropy
of chain spin labelled lipids, suggesting an increased ordering along the
phospholipid acyl chains. However, the extent of the interaction depends both
on the lipid composition and on the physical state of the phospholipid
vesicles as well as on the aggregation of the peptides. Indeed, the peptide
fragments reduce the segmental acyl chain motion in SUV of DPPC and
even more in SUV of DPPG. Moreover, the interaction is augmented when
cholesterol is present in the lipid matrix and even more in ternary mixtures of
DPPC/DPPG/Chol. Additionally, the influence is more marked for
temperatures up to those corresponding to the gel-to-liquid crystalline phase
transition of the lipid vesicls. Finally, the perturbation is much more evident
when the peptides are aggregated to form Beta-structured fibrils, i.e. when
they are aged for 48-72 h.
The results suggest that the interaction between Beta-amyloid peptide
aggregates and neuronal membranes could be implicated in Alzheimer’s
disease.