Profilo microbiologico di prodotti
dell’itticoltura toscana
Dott.ssa Roberta Nuvoloni
Dip. Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti di OA
Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA
Variabilità delle popolazioni microbiche in relazione a:
- diverse realtà ambientali, stagione
- composizione chimica dei tessuti
- fase del ciclo riproduttivo
1) MICROFLORA INIZIALE : associata al pesce in vita,
rispecchia quella ambientale.
CBT cute e branchie:
Sulle branchie: Pseudomonas spp.,
102-104 acque fredde
Aeromonas spp.,
103-106 acque calde
Moraxella spp.;
Nell'intestino: Vibrio spp.,
Alcaligenes spp.,
Flavobacterium spp..
Dott.ssa Roberta Nuvoloni - Dip. Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti di OA
Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA
2)MICROFLORA SAPROFITICA: influenzata soprattutto dalla
temperatura, mesofila o psicrofila.
3)BATTERI PATOGENI E TOSSIGENI: sui pesci in vita o
contaminanti durante le fasi di lavorazione in condizioni
igieniche inidonee: C. botulinum nelle conserve,
Vibrionaceae e L. monocytogenes nei prodotti pronti per il
consumo.
Dott.ssa Roberta Nuvoloni - Dip. Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti di OA
Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
Evoluzione del profilo microbiologico di orate
allevate in mare conservate sotto ghiaccio
Progetto di ricerca
di interesse nazionale PRIN 2004
Nuvoloni R., Pedonese F., D’Ascenzi C.,
Orlandi M., Gerardo B., Rindi S.
Dott.ssa Roberta Nuvoloni - Dip. Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti di OA
Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
Progetto di ricerca di interesse nazionale PRIN 2004
•Valutare:
l’evoluzione nel tempo delle microflore
associate ad orate allevate in mare, conservate
per 21 giorni sotto ghiaccio
presenza di batteri potenzialmente patogeni
7 campionamenti presso lo stabilimento “Spezzina
Itticoltura s.r.l.” di La Spezia
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Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
Progetto di ricerca di interesse nazionale PRIN 2004
3 orate analizzate subito dopo la pesca, le rimanenti
conservate sotto ghiaccio a 2±2°C ed analizzate dopo 3,
7, 10, 14, 17 e 21 giorni
Per ognuno dei pesci in esame prelevati sterilmente:
•Campione di cute antero-dorsale
•Campione di muscolo stessa sede anatomica
•Pool degli archi branchiali
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Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
Progetto di ricerca di interesse nazionale PRIN 2004
Carica batterica totale (Plate Count Agar) 30°C per 72 ore
Batteri produttori (H2S+) e non produttori (H2S-) di idrogeno
solforato (H2S) (Iron Agar) 25°C per 48-120 ore
Pseudomonas spp. (Pseu Agar Base+CFC) 25°C per 48 ore
Aeromonas spp. (Aero Medium Base+ Ampicillin Selective
Supplement) 37° per 48 ore
Listeria monocytogenes (ISO 11290-1/DAM 1 )
Vibrio spp. (MPN 37°C per 24 ore, TCBS2% a 37°C per 24 ore)
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Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
CUTE
•CBT presente ad un livello iniziale di 3 Log → 8,05 Log ufc/g al 21° giorno
•Valori analoghi o leggermente superiori per Pseudomonas spp.
•Range analogo in H2S•H2S+ quantità minime al giorno 0 →aumentano di 6 Log
•Aeromonas spp. continua ad aumentare →incrementi ridotti
CUTE
0 gg.
3 gg.
7 gg.
10 gg.
14 gg.
17 gg.
21 gg.
CBT
3,55±0,19
3,81±0,27
4,85±0,79
5,68±0,92
7,19±0,35
7,56±0,35
8,05±0,26
H2S+
1,63±0,99
2,28±1,17
4,29±1,00
5,54±1,10
6,11±1,76
7,14±0,87
7,11±0,98
H2S-
3,13±0,76
3,36±0,84
4,59±0,92
6,01±0,87
7,14±0,54
7,67±0,22
7,96±0,39
Pseudomona
s spp.
3,46±0,69
3,76±0,79
5,35±0,92
6,60±0,49
7,73±0,40
8,24±0,40
8,30±0,53
Aeromonas
spp.
2,14±0,56
2,23±0,69
2,64±0,63
3,53±0,92
4,35±0,47
4,77±0,56
4,82±0,79
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Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
BRANCHIE
•Andamento simile a quello della cute
•CBT raggiunge 8,11 Log ufc/g
•Pseudomonas spp. valori maggiori alla CBT
•H2S- andamento analogo a CBT
•H2S+ valori inizialmente bassi →aumenta di 6 Log
•Aeromonas spp. valori iniziali leggermente superiori a quelli della cute →5,57
Log ufc/g
BRANCHIE
0 gg.
3 gg.
7 gg.
10 gg.
14 gg.
17 gg.
21 gg.
CBT
3,65±0,28
4,06±0,61
4,93±0,44
5,82±0,87
7,07±1,04
7,51±0,83
8,11±0,85
H2S+
1,97±1,06
2,86±0,77
4,90±0,90
5,98±1,65
6,86±2,16
7,09±1,99
7,19±0,82
H2S-
3,14±0,66
3,60±0,69
4,75±0,65
5,89±0,85
6,83±0,76
7,35±1,00
7,99±0,91
Pseudomona
s spp.
3,54±0,34
4,12±0,44
5,70±0,71
6,93±0,54
7,67±0,87
8,30±1,05
8,29±0,81
Aeromonas
spp.
2,77±1,00
2,97±0,86
3,44±0,67
4,14±1,10
4,77±0,75
5,27±0,59
5,57±0,40
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Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
MUSCOLO
•Muscolo parametro giudicato fondamentale per la determinazione dell’evoluzione
dello spoilage in rapporto alla shelf-life
•CBT inferiore a quella corrispondente di cute e branchie → 6,04 Log ufc/g il 21°
giorno
•Pseudomonas spp. : sviluppo simile o superiore a CBT
•H2S- e H2S+ : andamento simile a cute e branchie ma valori inferiori
•Aeromonas spp.: presenti in quantità di diversi Log inferiori rispetto alle
altre categorie microbiche
MUSCOLO
0 gg.
3 gg.
7 gg.
10 gg.
14 gg.
17 gg.
21 gg.
CBT
0,90±0,65
1,65±0,77
3,18±0,71
4,12±1,93
4,97±0,46
5,72±0,74
6,04±0,84
H2S+
0,32±0,57
0,71±0,58
2,46±1,00
3,77±1,20
4,53±1,32
5,53±1,11
5,60±1,06
H2S-
0,72±0,61
1,27±0,46
2,37±1,46
4,11±1,17
4,98±0,58
5,72±0,73
5,95±0,82
Pseudomonas
spp.
1,10±0,26
1,51±0,46
3,12±1,47
4,43±0,60
5,72±1,05
5,99±0,84
6,15±0,82
Aeromonas spp.
1,16±0,34
1,11±0,22
1,27±0,41
1,45±0,41
1,85±0,67
3,03±0,55
2,78±1,09
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Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
• ICSFM: limite di accettabilità per i pesci
freschi è 107 ufc/g
• Chang et al.: limite di accettabilità nel
muscolo 106 ufc/g
• Campioni invernali (T° acque: 10,5-11°C):
in cute e muscolo cariche batteriche generalmente più
basse nelle fasi finali di conservazione.
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Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
Limite microbiologico di accettabilità : 14°- 17° giorno di
conservazione
Pseudomonas spp.
Appare essere la categoria microbica
dominante, raggiungendo valori simili o
addirittura più elevati dei corrispondenti
valori di CBT
In accordo con Koutsoumanis e Nychas (1999)
che identificano Pseudomonas spp. come
principale agente degradativo in orata e boga
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Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
H2S +
Larga parte della microflora, aumenta di 6
log in cute e branchie e di 5 nel muscolo
durante il periodo di conservazione
Possono subire l’azione competitiva di altri
microrganismi come Pseudomonas spp.
(Koutsoumanis et al., 1999) valori iniziali
bassi
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Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
Aeromonas spp.
Tra i batteri alteranti del pesce durante la
conservazione in ghiaccio svolge un ruolo
anche se di entità più limitata rispetto a
Pseudomonas spp. e H2S +
Non importanti solo nello spoilage
Patogenesi non completamente chiara.
Valori oltre 5 log nelle branchie a 21 gg di
conservazione.
All’identificazione genotipica: A.hydrophila, A.caviae
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Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare
conservate sotto ghiaccio
Vibrio spp.
Scarsa presenza di vibrioni alofili
Presente in quantità abbastanza elevate
all’inizio del periodo di conservazione,
diminuisce progressivamente fino al 21°
giorno
All’identificazione genotipica: V.(Listonella) anguillarum, V.
harveyi, V.rotiferianus, V.diazotrophicus, V. ordalii
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PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA
Il genere Aeromonas
•Bastoncelli diritti, mobili o immobili, non sporigeni,
Gram negativi, con dimensioni di 0,3-1,0 x 1,0-3,5
μm, anaerobi facoltativi, ossidasi positivi
•Famiglia Aeromonadaceae
•Habitat: ubiquitario e autoctono in tutti gli ambienti
acquatici
•Specie patogene e ambientali
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PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA
Il genere Aeromonas
•6 specie su 18 considerate
patogene
•fattori di virulenza come
emolisine, citotossine,
enterotossine, proteasi,
leucocidine, fosfolipasi,
endotossine, fimbrie
•psicrofilia → capacità di
resistere e moltiplicarsi alle
basse temperature, soprattutto
A. hydrophila
A. hydrophila
A. caviae
A. veronii biovar sobria
A. veronii biovar veronii
A. jandaei
A. schuberti
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PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA
•l’Organizzazione Mondiale della Sanità ha inserito
Aeromonas nell’elenco degli agenti enteropatogeni
emergenti (anni ’80)
•setticemia primaria e secondaria in soggetti
immunocompromessi,
•serie infezioni localizzate in individui sani
•forme di peritonite, meningite, infezioni oculari ed
ossee
•manifestazione più comune: la gastroenterite
•meccanismi di patogenesi complessi e multifattoriali
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PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA
Il genere Vibrio
•comprende 70 specie.
•Bacilli Gram negativi, diritti o curvi;
•dimensioni: 0,5-0,8x1,4-2,6 µm;
•aerobi-anaerobi facoltativi;
•asporigeni;
•mobili per flagello polare;
•metabolismo ossidativo/fermentativo;
•ossidasi-positivi,eccetto V. metschnikovii;
•crescita stimolata da NaCl, indispensabile per V.
vulnificus e V. parahaemolyticus allo 0,3%;
•sviluppo tra 10° e 30°C; NaCl variabile da 5% a
30%.
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PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA
VIBRIONI PATOGENI:
1)Vibrio cholerae:
- agente eziologico del colera
- ingestione di acqua e alimenti contaminati
- sintomatologia enterica molto grave
- 200 sierogruppi, antigeni O ed H (costanti)
- antigene non O1: diarrea sporadica ed infezioni
extraintestinali
- antigene O1 :ceppi produttori enterotossina colerica
(classico, El Tor, O139)
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PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
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VIBRIONI PATOGENI:
2)Vibrio parahaemolyticus:
- antigeni O, H, K
- su Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar non fermenta
glucosio, colonie verdi
- forme gastroenteriche per ingestione di prodotti poco
cotti o crudi
- D.I:105ufc/g
- ceppi Kanagawa positivi :Thermostable Direct
Hemolysin
- ceppi Kanagawa negativi :TDH-Related Hemolysin
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PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA
VIBRIONI PATOGENI:
3)Vibrio vulnificus:
- produzione di citolisine, proteinasi,
- infezione di ferite, setticemie
- talvolta forme gastroenteriche
collagena
4)Vibrio alginolyticus:
- incerta patogenicità in forme gastroenteriche
- talvolta responsabile di otiti ed infezioni di ferite
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PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA
VIBRIONI AMBIENTALI:
1)Vibrio harveyi:
- in ambiente marino e di estuario.
- crescita : NaCl dal 3 al 10%, tra 30°e 40
- gelatinasi positivo
- patogeno per molto animali marini, epidemie ad
elevata mortalità in allevamenti di gamberi
2)Vibrio (Listonella) anguillarum:
- crescita tra 30° e 35°C
- su TCBS colonie gialle
- patogeno per i pesci, causa malattia
setticemica
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PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI
DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA
VIBRIONI AMBIENTALI:
3)Vibrio ordalii:
-nello stesso gruppo di Vibrio (L) anguillarum
-non cresce né a 30° né a 35°C
-non cresce in presenza di NaCl allo 0,2%
-non cresce su TCBS
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP:
IN ORATE ALLEVATE
Progetto di ricerca
di interesse nazionale PRIN 2007
Nuvoloni R., Pedonese F., D’Ascenzi C.,
Forzale F., Gerardo B., Rindi S
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
progetto di ricerca di interesse nazionale (PRIN 2007)
Cooperativa “ La Peschereccia s.r.l.” di Orbetello,
Grosseto
Le orate sono pescate:
• con metodi tradizionali – nasse e bertovelli:
• “pesca da posta” con tramagli e reti calate la sera;
• “pesca ai lavorieri”, nei tre canali di comunicazione tra
laguna e mare,sfrutta lo spostamento naturale del
pesce;
• “pesca delle valli venete”, prevede la semina del pesce
in laguna,quando ha raggiunto taglie adeguate, dopo
l'accrescimento in gabbie.
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Allevamento “Spezzina Itticoltura s.r.l.” di La Spezia :
semi-intensivo, i pesci sono allevati:
• in gabbie sotto costa (in-shore)
• in gabbie in alto mare (off-shore)
L'alimentazione è automatizzata, il mangime arriva
tramite condotte subacquee dai silos a terra alle gabbie.
Gli avannotti sono acquistati da aziende specializzate e
seminati in primavera.
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Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Raccolta dei campioni
Campionamento, a cadenza settimanale, per un totale di
40 pesci
prelevati sterilmente campioni di 4 matrici:
•Cute
•Muscolo
•Branchie
•Contenuto intestinale
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Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Determinazione quantitativa di Aeromonas spp.
spp
diluizioni scalari in Acqua Peptonata Alcalina (APW,
Oxoid)
Cute, branchie e intestino: da 10-1 a 10-4
Muscolo: da 10-1 a 10-3
•omogeneizzazione con Stomacher 400 Circulator (Pbi
International)
•semina per spatolamento su terreno Aeromonas Agar
Base + Ampicillin Supplement (Oxoid) (terreno di Ryan),
per la ricerca di Aeromonas spp., con incubazione a 30°C
per 24 ore
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Determinazione quantitativa di Aeromonas spp.
spp
campioni dal 20% dei pesci→determinazione quantitativa
anche su:
•Aeromonas Starch DNA Agar Base + Ampicillin
Supplement (Biolife)
•GSP Agar (Pseudomonas Aeromonas Selective Agar
according to Kielwein, Glutamate Starch Phenol Red
Agar) (Fluka) + Ampicillin Supplement (Oxoid)
Stesse modalità di semina e incubazione
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Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Preidentificazione di Aeromonas
spp.
spp
Crescita caratteristica sui terreni
utilizzati
Aeromonas Agar Base (Ryan)
Aeromonas Starch DNA Agar Base
GSP Agar
Colonie dall’aspetto tipico →
prelevate, purificate e messe in
collezione a -80°C
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Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Preidentificazione di Aeromonas
spp.
spp
Test preliminari:
•colorazione di Gram
•test del metabolismo ossidativofermentativo (O/F)
Test succesivi:
•sensibilità al fattore vibriostatico
O129 (Oxoid)
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Preidentificazione di Aeromonas
spp.
spp
Test preliminari:
•colorazione di Gram
•test del metabolismo ossidativofermentativo (O/F)
Test succesivi:
•sensibilità al fattore vibriostatico
O129 (Oxoid)
•utilizzazione del Trealosio in
Phenol Red Broth Base (Difco)+
Trealosio all’1%
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Preidentificazione di
Aeromonas spp.
spp
Test succesivi:
•sviluppo in Gelatin Agar
senza cloruro di sodio
•sviluppo in Gelatin Agar al
3% di cloruro di sodio
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Risultati presenza
di Aeromonas
spp.
Cooperativa “La
Peschereccia
s.r.l” di Orbetello
VALORI
MUSCOLO
CUTE
BRANCHIE
INTESTINO
MEDIA
1,00
3,14
4,12
2,22
DEVIAZIONE
STANDARD
-
1,18
1,31
1,15
VALORI
MUSCOLO
CUTE
BRANCHIE
INTESTINO
MEDIA
1,00
2,93
3,23
1,80
DEVIAZIONE
STANDARD
-
1,47
1,95
1,59
VALORI
MUSCOLO
CUTE
BRANCHIE
INTESTINO
MEDIA
1,00
2,79
3,18
1,78
DEVIAZIONE
STANDARD
-
1,57
1,70
1,13
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Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Risultati presenza
di Aeromonas
spp.
“Spezzina
Itticoltura s.r.l.” di
La Spezia
VALORI
MUSCOL
O
CUTE
BRANCHIE
INTESTINO
MEDIA
1,00
3,05
4,13
1,86
DEVIAZIONE
STANDARD
-
0,74
0,71
0,96
VALORI
MUSCOLO
CUTE
BRANCHIE
INTESTINO
MEDIA
1,00
2,00
3,77
1,83
DEVIAZIONE
STANDARD
-
0,24
0,26
0,99
VALORI
MUSCOLO
CUTE
BRANCHIE
INTESTINO
MEDIA
1,00
2,42
3,81
1,93
DEVIAZIONE
STANDARD
-
0,21
0,23
1,08
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Risultati preidentificazione
102 ceppi testati (64 Orbetello, 38 La Spezia)
riportabili a Aeromonas hydrophila : 24 ceppi Orbetello
14 ceppi La Spezia
38
ossidasi positivi, aerobi-anaerobi facoltativi, resistenti al fattore vibriostatico O129, sviluppano sia in
assenza che in presenza del 3% di sale (oppure in assenza ma non con il 3 % di sale), utilizzano il
trealosio, crescono con colonie tipiche nei terreni colturali utilizzati.
riportabili ad Aeromonas spp.: 31 ceppi Orbetello
17 ceppi La Spezia
48
profilo tipico per la maggior parte, ma non per tutte le prove eseguite, più spesso: mancata capacità
di sviluppare con colonie di aspetto tipico su uno dei terreni colturali impiegati, St o GSP, e/o
mancata capacità di utilizzare il trealosio
probabili Vibrio spp.: 7 ceppi Orbetello
6 La Spezia
13
ceppi sensibili al fattore vibriostatico O129
non Aeromonas, non Vibrio: 3 ceppi
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Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana
PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Risultati preidentificazione
102 ceppi testati (64 Orbetello, 38 La Spezia)
3%
13%
37%
A. hydrophila?
Aeromonas spp.?
Vibrio spp.?
non Aeromonas non Vibrio
47%
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Risultati identificazione genotipica
PCR genere-specifica
- estrazione con DNeasy blood and Tissue Kit (Qiagen)
- Primers: 5’-AGTACTTGCTACTTTTGCCG-3’ (senso)
5’- AAGGCCCGAAGGTCCCCT-3’ (antisenso)
- Condizioni di amplificazione :
94 °C per 5 minuti
35 cicli:
•
94 °C per 1 minuto
•
60 °C per 1 minuto
•
72 °C per 1 minuto
-72 °C per 5 minuti
- Prodotto di amplificazione atteso: 120 bp
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Risultati identificazione genotipica
Su 72 ceppi sottoposti a PCR genere-specifica
solo 5 sono risultati non riportabili ad Aeromonas spp.
120 bp
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Determinazione quantitativa di Vibrio spp.
spp
Diluizioni in APW fino a 10-4, seminate su Thiosulfate
Citrate Bile Salt Agar e Trifeniltetrazolio cloruro-TTCTryptone Soya Agar per spatolamento di un'aliquota di
0,2 ml. Incubazione a 30°C per 24 ore.
Determinazione qualitativa di Vibrio spp.
spp
La soluzione madre, diluita 1:10, incubata per 24 ore a
30°C, poi seminata per ansata su TCBS e TSAT ed incubati
a 30° C per 24 ore.
•Con il TSAT sono stati saggiati 2 pesci per ogni serie, in
totale il 20%.
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Preidentificazione di Vibrio spp.
spp
•COLORAZIONE DI GRAM: i vibrioni sono Gram negativi.
•ATTIVITA' OSSIDASICA: i vibrioni risultano positivi.
•TEST O/F: I vibrioni sono O+/F+.
•SENSIBILITA' AL FATTORE VIBRIOSTATICO O129: la crescita dei
vibrioni è inibita nell'area circostante il dischetto.
•SVILUPPO IN ASSENZA/PRESENZA DI NaCl AL 3%:
I vibrioni crescono solo in presenza di NaCl, eccetto V. cholerae e V.
mimicus.
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Risultati presenza
di Vibrio spp
Cooperativa “La
Peschereccia s.r.l” di
Orbetello
VALORI
MUSCOLO
CUTE
BRANCHIE
INTESTINO
MEDIA
1,00
2,32
3,60
1,80
DEVIAZIONE
STANDARD
-
0,96
1,03
1,08
MUSCOLO
CUTE
BRANCHIE
INTESTINO
MEDIA
1,00
3,83
5,09
4,61
DEVIAZIONE
STANDARD
-
1,37
1,45
1,63
VALORI
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Risultati presenza
di Vibrio spp
Cooperativa “La
Peschereccia s.r.l” di
Orbetello
MUSCOLO
CUTE
BRANCHIE
INTESTINO
MEDIA
1,00
2,81
4,24
2,25
DEVIAZIONE
STANDARD
-
0,95
0,64
1,24
MUSCOLO
CUTE
BRANCHIE
INTESTINO
MEDIA
1,00
2,68
5,18
3,09
DEVIAZIONE
STANDARD
-
1,14
0,37
2,41
VALORI
VALORI
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Conclusioni
• Il muscolo è un tessuto normalmente sterile.
• La cute ha una contaminazione più elevata:
•per il contatto con l'ambiente
•il muco protettivo è un substrato
favorevole allo sviluppo microbico
• Le branchie risultano maggiormente contaminate e:
•valori elevati in “Spezzina Itticoltura” per Vibrio spp.
forse per il tipo di allevamento semi-intensivo
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
Risultati preidentificazione di Vibrio spp
•Individuazione di ceppi riportabili a Vibrio spp..
•Individuati ceppi capaci di crescere in assenza di NaCl,
possibili V.cholerae e V. mimicus.
•La crescita in assenza di NaCl e' stata riscontrata con
una certa variabilita' anche in altre specie (V.
navarrensis, V. metschnikovii, V. fluvialis, V.
anguillarum, V. furnisii
•Tuttavia la maggioranza dei ceppi non sono capaci di
sviluppare in assenza di NaCl (V. vulnificus, V.
parahaemolyticus, V. harveyi, V. ordalii)
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE
•Reg. CE 2073/2005, “Criteri microbiologici applicabili ai prodotti
alimentari”: “al momento non si rileva la necessità di fissare criteri specifici per
V. vulnificus e V. parahaemolyticus patogeni nel pesce e molluschi”,
raccomanda l'istituzione di codici di condotta per garantire le buone prassi
igieniche;
•Nota Min. Sal. 5/10/2006, relativa all'identificazione dei fattori di tossicità di V.
cholerae non-O1 e non-O139, per i quali si devono ricercare i geni stn/sto, V.
alginolyticus non rappresenterebbe un pericolo per i consumatori, V. vulnificus
non deve superare 103 ufc/g.
•Parere ISS n° 31646 del 8/06/2005 relativo allo svolgimento di controlli
microbiologici per la ricerca di V. parahaemolyticus afferma che è necessaria,
dopo l'identificazione , la ricerca mediante PCR del gene ToxR ed in caso di
positività, l'ulteriore ricerca dei geni TDH e TRH correlati alla produzione di
tossine.
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PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP:
IN ORATE ALLEVATE
• Stiamo procedendo all’identificazione genotipica dei ceppi di
Vibrio spp.
• Tutti i ceppi dopo l’identificazione genotipica di genere verranno
inviati a Torino per l’identificazione di specie
• Sono initinere prove per verificare l’antibiotico-resistenza dei
ceppi isolati
I risultati ottenuti possono dare un contributo al monitoraggio
della presenza di Aeromonas spp. e Vibrio spp. nei prodotti della
pesca.
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GRAZIE PER L’ATTENZIONE!!!
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