DIVERSITA’ FENOTIPICA E
GENOTIPICA di N. meningitidis
Paola Stefanelli
MIPI-ISS-Roma
[email protected]
Neisseria meningitidis
¾Colonizza il faringe nel 10% della
popolazione sana
¾Occasionalmente causa malattia:
incidenza 1-2/100000 a >500/100000
¾Naturalmente competente per la
trasformazione
¾↑ variabilita’ genetica
Incidenza di Malattie Invasive da
Meningococco in Italia
0.4
0.3
0.2
0.1
Anno
20
04
*
20
03
20
02
20
01
20
00
19
99
19
98
19
97
19
96
0
19
95
Casi per 100000
0.5
DIVERSITA’ FENOTIPICA
di N. meningitidis
SCHEMA DI TIPIZZAZIONE FENOTIPICA
Neisseria
gonorrhoea
A
(genere)
meningitidis
B
C W135 X
1 2a 2b 4 15
7 16
lactamica (specie)
Z
29E
es. B:14:P1.13
(sierogrouppo)
(sierotipo)
(sierosottotipo)
Distribution of N. meningitidis
Serogroups A,B,C,W135,Y
CB
BC
ABC
BC BC
CB
BC
BC BC
BC
BC
BCY
AB
ABC
A
AB
W
BC
AC
AC A
AW
A A
A
A
A
A A
A
A
A
A
AC
BC
BC
BC
Updated from Tikhomirov E et al. Meningococcal disease:
public health burden and control. World Health Stat Q 1997; 50: 171
BC
Variazioni nella proporzione di ceppi di
sierogruppo B e C circolanti in Italia
B
C
Altro
80
70
73.5
73.2
60
57.5
55.1
57.6
55
50
41.3
% 40
43.3
36.8
40
30
20
23.3
22.1
10
0
1994-2000
2001
* agg.al 30/06/05
2002
2003
2004
2005 *
Ceppi di sierogruppo B e C isolati da pazienti
appartenenti a classi di età ad alta rischio di infezione
B
C
40
35
N.° ceppi
30
25
20
15
10
5
0
2002
2003
2004
0-4 anni
2005*
2002
2003
2004
15-24 anni
2005*
Distribuzione geografica dei 6 fenotipi più frequenti
isolati in Italia 2002-2005*
B:15:P1.4
B:4:P1.4
B:14:P1.13
Bolzano
ce
nce
i
C:2a:P1.5
C:2b:P1.5,2
C:2b:P1.5
Frequenza
dei fenotipi
di gruppo B
B:14:P1.13
B:15:P1.16
60
B:15:P1.7,16
B:15:P1.7
B:4:NST
B:4:P1.4
B:4:P1.13
ALTRI (>80)
50
%
1994-2000
70
40
30
20
10
0
60
%
Frequenza
dei fenotipi
di gruppo B
2001-2005
50
B:14:P1.13
B:15:P1.7,16
B:15:P1.4
B:4:P1.13
B:4:P1.4
40
B:nt:nst
Altri(>50)
30
20
10
0
%
Frequenza dei
fenotipi di
gruppo C
1994-2000
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
35
%
Frequenza dei
fenotipi di
gruppo C
2001-2005
30
25
20
15
10
5
0
C:2a:nst
C:2a:P1.5
C:2b:P1.5
C:2a:P1.2,5
C:nt:P1.5
Altri (>30)
C:2b:nst
C:2a:P1.5
C:2b:P1.5
C:2b:P1.2,5
Altri (>20)
Cambiamenti nel fenotipo principale di
sierogruppo C
C:2a:P1.5
C:2b:P1.5
C:2b:P1.5,2
C:2b:nst
% ceppi di gruppo C
60
50
40
30
20
10
0
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Principali fenotipi per classi d’età 2004-05
Classe 0- 4
C:2b:nst :
8,6%
C:2b:P1.5:
6,2%
C:2b:P1.5,2 : 42,0%
Classe 5-9
B:15:P1.4:
9,5%
B:15:P1.13:
9,5%
C:2b:nst :
14,3%
C:2b:P1.5,2 : 28,6%
Classe 10-14
Classe 15-19
C:2a:P1.5 : 13,2%
C:2b:P1.5,2 : 26,3%
Classe 20-24
B:4:P1.4:
10,5%
B:4:P1.4:
10,5%
C:2b:P1.5,2 : 15,8%
Classe 25-44
B:4:P1.15:
B:15:P1.4:
C:2b:P1.5,2 :
10,3%
10,3%
17,9%
Classe >64
C:2b:P1.5,2 : 53,3%
C:2a:P1.5 :
17,6%
C:2b:P1.5,2 : 29,4%
35
30
25
N° ceppi
Aumento nel N°
di casi di malattie
invasive da
sierogruppo
C in Lombardia
C:2b:P1.5
C:2a:P1.5
C:2b:P1.5,2
Totale
20
15
10
Incidenza
0.35/100000
Inc. Naz. 0.13
0
2000
N° ceppi
0- 4 anni
~4/100000
Incid. Naz.
1.25
5
2001
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
2002
2003
2004
2003
2004
C:2b:P1.5
C:2a:P1.5
C:2b:P1.5,2
Totale
2000
2001
2002
Principali fenotipi attualmente (2004-05)
circolanti in alcune regioni Italiane
76 Ceppi
C:2b:nst :
10,5%
C:2b:P1.5,2 : 40,8%
C:2a:P1.5:
5,5%
C:2b:P1.5:
5.5%
16 Ceppi
B:4:P1.13 :
25%
B:4:P1.3,6:
12,5%
C:2b:P1.5,2 : 12,5%
3 Ceppi
B:nt:P1.14
B:nt:P1.5,2
C:1:P1.5,2
DIVERSITA’ GENOTIPICA
di N.meningitidis
N. meningitidis MLST
PCR MLST loci (1 kb)
7 housekeeping genes
Sequenza 400-500 bp
Database
http://www.neisseria.org
Sequenze
Multilocus Sequence Type (ST)
e.g ST41
Maiden et al.,
PNAS 1998
Sequence Types e Lineages identificati nei
ceppi di meningococco isolati in Italia
B:14:P1.13
B: 4:P1.13
B: 4:P1.4
ST44/Lineage 3
C: 2a:P1.5
P1.5,2
ST11/ET37 Complex
C:2b: P1.5
C2b:P1.5,2
ST8/A4 Cluster
ST1860/ET37 Complex
B:15:P1.7,16
ST32/ET5 Complex
Gene porA
Loop
I
VR1
M.E.
PERIPLASMA
II
III
IV
V
VR2 VR3
VI
VII
VIII
porA VR typing
Sierosottotipo
VR1
VR2
VR3
P1.13
7-2
13-2
35a
P1.4
7-2
4
37
P1.5
5
2(2-1)
36b
P1.5,2
5
2
36b
P1.7,16
7
16(16-2)
35
SWITCHING
CAPSULARE
Polisaccaride capsulare
OM
CtrA
CtrB
CtrC
ATP
CtrD
SynD
IM
UP
LipA
LipB
ADP
CMP-NANA
DAG
SynB
SynA SynC
N. meningitidis Serogroup B
tex
ctrD
ctrC
N. meningitidis Serogroup C
tex
ctrD
ctrC
N. meningitidis Serogroup Y
tex
ctrD
ctrC
[(α2→8)-N-acetylneuraminic acid]
ctrB
ctrA
synA
synB
synC
synD
galE
[(α2→9)-N-acetylneuraminic acid]
ctrB
ctrA
synA
synB
synC
synE
OatC
[6-D-Glc(α1→4)-N-acetylneuraminic acid(α2→6)]
ctrB
ctrA
synA
synB
synC
synF OatWY
N. meningitidis Serogroup W-135 [6-D-Gal(α1→4)-N-acetylneuraminic acid(α2→6)]
tex
ctrD
ctrC
N. meningitidis Serogroup A
]
tex
ctrD
ctrC
N. gonorrhoeae & N. lactamica
ctrB
ctrA
synA
synB
synC
synG OatWY
[(α1→6)-N-acetyl-D-mannosamine-1-phosphate
ctrB
ctrA
tex
sacA sacB sacC sacD
galE
Tipi di variazioni capsulari in NM
• On ↔ off “phase variation”
• Regolazione espressione
• Variazione strutturale
[ switching capsulare]
synE
synD
dnaJ
Y561
rfbA
rfbC
synB
synC
synB
synC
galE
rfbB
synA
ctrA
ctrC
ctrB
ctrD
tex
HphI(C)
HphI(A)
galE
rfbB’
rfbA’
rfbC’
synA
NMB
lipA
lipB
Switching capsulare
N. meningitidis B →C
PFGE patterns and
dendrogram of
similarity for each
phenotype and
corresponding ST
PENICILLINA E RIFAMPICINA :
GENOTIPI di N. MENINGITIDIS
SENSIBILITA’ ALLA PENICILLINA
Negli anni 1994-2001 testati 471 ceppi.
36 ceppi (7,6%) sono risultati PenI:
18 di sierogruppo B (15 diversi fenotipi)
15 di sierogruppo C (10 diversi fenotipi) e
3 di altri sierogruppi
Negli anni 2002-2005 testati 396 ceppi.
160 ceppi (40,4%) sono risultati PenI:
27 di sierogruppo B (17 diversi fenotipi)
129 di sierogruppo C (11 diversi fenotipi) e
4 di altri sierogruppi
2003-2004 Valori di MIC per la penicillina per
sierogruppo
25
gruppo B
gruppo C
20
15
%
10
5
0
2 16 23 32 47 64 94 25 ,19 ,25 ,38
1
0
0
0
0
0
0
0
1 0
0
0
0, 0, 0. 0. 0. 0, 0, 0,
MIC
Fenotipi dei ceppi di gruppo C con diminuita
sensibilità alla penicillina
70
60
N ° ceppi
50
40
30
20
10
0
C:2a:P1.2
C:2b:P1.5
C:2b:P1.5,2
C:2b:nst
Totale 117 ceppi
Distribuzione per classi di età dei ceppi
PenI isolati nel periodo 2002-2005
45
40
35
% ceppi
30
25
20
15
10
5
0
0-4
5-9
10-14
15-19
20-24
25-44
45-64
65 +
Sierogruppo capsulare, MIC e sostituzioni aa
nel gene rpoB di ceppi di N.meningitidis RifR
POSIZIONE
MIC
SOSTITUZIONI
CORRISPONDENTE
SIEROGRUPPO RIFAMPICIN
CEPPO
AMMINOACIDICH NEL GENE rpoB di
CAPSULARE
A
E
E.coli
(mg/L)
745
870
888
978
694
899
901
944
>256
>256
64
64
>256
>256
>256
>256
C
C
C
B
C
C
C
B
Asp542→Val
Asp542→Val
Asp542→Val
Asp542→Val
His552→Tyr
His552→Tyr
His552→Tyr
His552→Asn
Asp516→Val
Asp516→Val
Asp516→Val
Asp516→Val
His526→Tyr
His526→Tyr
His526→Tyr
His526→Tyr
(SENSIBILITA` < 1µg/ml; RESISTENZA > 4 µg/ml)
rpoB (subunità β)
AA1
1392
*542
500 AA
Asp→Val
CLUSTER
I
*552
His→Tyr
His→Asn
700
II
III
PCR real time per l’identificazione contemporanea di
ceppi di N. meningitidis PenI e RifR
R
S
S
R
RR
A
S
R
B
Considerazioni
¾Il sierogruppo C dal 2004 e’ responsabile del 54% dei casi di
meningite meningococcica (introduzione vaccino anti MenC)
¾Aumento di ceppi di sierogruppo C intermedi alla penicillina
¾Il gruppo C e’ geneticamente piu’ omogeneo del gruppo B
¾ Studi sierologici e molecolari mirati all’individuazione di
antigeni vaccinali protettivi per MenB ancora orfano di un
vaccino “universale”