www.cdc.gov
Influenza: il virus e le
sue strategie
Stefania Lauzi
• nel 2004 su
6.437.000.000
persone ¾ n.
58.772.000
morti
• 16.2% per
malattie
infettive e
parassitarie
L’influenza
“normale”
nell’uomo
provoca 250500 mila
vittime
all’anno nel
mondo
Famiglia Orthomyxoviridae
Linda Stannard, Department of Medical
Microbiology, University of Cape Town
5 generi
Influenzavirus A
Influenzavirus B
Influenzavirus C
¾ molte specie
> uomo
tipo A, tipo B, tipo C
NP, M1
sottotipi solo per tipo A
Thogotovirus
artropodi
Isavirus
salmonidi
HnNn
•
•
•
•
•
Virus type
Host species (if not
human)
Geographical origin
Strain number
Year of isolation
•
HA and NA subtypes
Haemagglutinin subtype
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13
H14
H15
H16
Neuraminidase subtype
N1
N2
N3
N4
N5
N6
N7
N8
N9
Influenzavirus A
Particelle altamente pleomorfe
• Forme filamentose nei campioni
clinici (300nm lunghezza)
• Forme sferiche (100nm diametro)
in seguito a passaggi in laboratorio
• Sopravvive per diverse
settimane in acque (di
mare) fredde e fino a 2
settimane nella polvere
(se l’essiccamento è
graduale)
• Poco resistente al
calore (inattivato in 30’
a 56°C e in pochi
secondi a 70°C) e a
molti disinfettanti
Influenzavirus A
• Virus con envelope
• Glicoproteine e
proteine dell’envelope
– rapporto HA:NA ¾
4-5:1
– rapporto M2:HA ¾
1:101-102
• Genoma
– polarità negativa,
ssRNA
– Segmentato, lineare
¾ 8 segmenti di
acido nucleico
Horimoto et al., 2005
Influenzavirus A
• Ribonucleoproteine (RNP)
RNA estremità 3’ e 5’ non codificanti e altamente conservate
Influenzavirus A genoma
Bouchier & Palese, 2008
Il ciclo replicativo
1. adesione e
endocitosi
2. uncoating e
trasporto nel nucleo
3. replicazione RNA
virale
4. sintesi proteine virali
5. localizzazione
nucleare (5a) e
modificazioni posttraduzionali (5b)
delle proteine
6. assemblaggio
7. budding
www.ncbi.nlm.nih.gov
Taubenberger & Morens, 2006
Fattori di virulenza
Basler & Aguilar, 2008
La fasi iniziali dell’infezione
• HA riconosce il recettore cellulare e determina le fasi
iniziali dell’infezione
Racaniello, 2009
Recettori
cellulari
• mucoproteine e glicolipidi contenenti gruppi
terminali costituiti da acido N-acetil
neuraminico (NANA = acidi sialici)
• molto diffusi su diversi tipi cellulari e in
numerose specie animali
La fasi iniziali dell’infezione
Matrosovich et al., 2004
• NA aumenta l’infettività virale degradando la mucina
(secrezioni respiratorie) e permettendo al virus di
raggiungere l’epitelio respiratorio
HA Influenza A virus (H1N1) del 1918
Bouchier & Palese, 2008
Adesione mediata da HA
Tipo di recettore cellulare
specie
acidi sialici legati a una molecola di galattosio
con un legame α 2,6 (NeuAcα2,6Gal)
• uomo (trachea)
• suino (trachea)
acidi sialici legati a una molecola di galattosio
con un legame α 2,3 (NeuAcα2,3Gal)
• volatili (intestino),
• suino (trachea)
• uomo (bronchioli, alveoli)
Specie specificità virale
dipende soprattutto dalla presenza
dell’aminoacido
• Gln226; Gly228 ¾ virus aviari
• Leu226; Ser228 ¾ virus umani (H2, H3)
• Asp190 (H1 umano) oppure Glu190 (aviare)
Specie specificità si modifica
Matrosovich, 2000
• Studiata HA di virus introdotti da volatili a mammiferi
– pandemie umane del 1957 (H2N2) e del 1968 (H3N2)
– European swine epizootic of 1979 (H1N1)
• Si sa che 6 aminoacidi sono altamente conservati nei
ceppi aviari (Ala138, Glu190, Leu194, Gly225, Gln226,
Gly228)
• Rispetto ai ceppi aviari identificate alcune mutazioni nei
ceppi umani e di suino che portano a riconoscimento
α2,6
– H2 e H3 singola mutazione Gln226→Leu,
– H1 doppia mutazione Glu190→Asp e Gly225→Glu
Specie specificità si modifica
Yamada et al., 2006
• Mutazioni presenti nei virus H5N1
umani rispetto a quelli aviari (sia
per virus clade1 e clade 2) che
portano a riconoscimento α2,6
– Asn182 →Lys
– Gln192→Arg
Specie specificità di HA è sufficiente?
Qi et al., 2009
• Isolati del 1918 presentano HA con specificità di
riconoscimento α2,6 (Glu190 →Asp; Gly225 →Asp)
oppure mista α 2,6/ α 2,3 (Glu190; Gly225 →Asp)
• Virus chimerici con HA tipica aviare ¾ sempre
patogeno per il topo, indipendentemente dalla
specificità di legame.
Altri fattori virulenza?
• Tropismo per macrofagi alveolari e cellule dendritiche?
Clivaggio HA
• Precursore HA0 ¾
clivaggio enzimatico ¾
subunità HA1 e HA2
Conferisce infettività al
virus
Racaniello, 2009
• importante ruolo siti di
clivaggio virali e enzimi
cellulari coinvolti
Siti clivaggio=patogenicità?
LPAI versus HPAI
Clivaggio HA
• Sito clivaggio “classico” aminoacido basico (arginina) tra
domini HA1 e HA2
• la quasi totalità virus
• LPAI dei volatili
• il precursore HA0 può essere scisso solo dalla tripsina o
da enzimi tripsino-simili
• la replicazione è limitata ai tessuti dove questi enzimi
sono presenti (epitelio del tratto intestinale e respiratorio)
e la sintomatologia clinica rimane localizzata a questi
distretti.
• isolamento del virus in uova
embrionate oppure in colture cellulari
ma solo con aggiunta enzima
(tripsina)
proteasi
Clivaggio HA
HPAI (H5, H7)
• molteplici aminoacidi basici a livello del sito di
clivaggio
• scissione del precursore HA0 da parte di proteasi
ubiquitarie (tra cui la furina) largamente presenti nei
tessuti dell’ospite
• la replicazione virale può avvenire in numerosi
organi determinando un’infezione generalizzata che
conduce a morte il soggetto.
HPAI H5N1 e H7N7 hanno
dato mortalità nell’uomo
A/Hong Kong/156/97 (H5N1)
isolato da bambino ha
molteplici aminoacidi
basici a livello del sito di
clivaggio
Clivaggio HA altri meccanismi?
• NA di influenza
A/WSN/33 (H1N1)
– Lys carbossil-terminale
in posizione 453 e
assenza sito
glicosilazione in
posizione 146
– lega il plasminogeno ¾
attivato a plasmina (da
attivatore plasminogeno
cellulare) ¾ clivaggio
HA0
Goto & Kawaoka, 1998
Clivaggio HA Influenza 1918
• clivato da enzimi ubiquitari?
– replica in MDCK senza aggiunta di tripsina (replicazione NA
dipendente, tripsina indipendente
– non replica al di fuori dell’apparato respiratorio nel modello
murino
• non ha sito polibasico
• è legato ad attività NA simile a NA di A/WSN/33
(H1N1)?
Chaipan et al., 2009
Clivaggio HA altri meccanismi?
• Proteasi batteriche determinano il clivaggio HA
– proteasi di Staphylococcus aureus (Tashiro et al.,
1987, Mancini et al., 2008)
– proteasi di Aerococcus viridans (Scheiblauer et al.,
1992)
Callan et al., 1997
King et al., 2009
Ingresso nella cellula e fusione
Racaniello, 2009
Fusione
• quando il pH nell’endosoma
si abbassa, viene esposto il
peptide di fusione
idrofobico presente
all’estremità N terminale di
HA2
M2
La proteina M2
forma il canale ionico che
contribuisce all’abbassamento
del pH nell’endosoma,
essenziale:
• per la fusione dell’envelope
• per il distacco di M1 da RNP
¾ RNPs possono essere
veicolati nel nucleo
M2 è il bersaglio di farmaci
antiinfluenzali “storici”
amantidina e rimantidina
(resistenze in H3N2)
Le fasi centrali della replicazione
Importante attività di PB1,
PB2 e PA nella
replicazione dell’acido
nucleico e nella sintesi
delle proteine virali
www.ncbi.nlm.nih.gov
RNA polimerasi RNA
dipendente
• cap snatching ¾ cap mRNA cellula viene “rubato” e inserito
nel proprio mRNA virale (PA)
Le fasi centrali della replicazione
Sintesi delle
proteine virali
Overlapping
reading frames
Racaniello, 2009
PB1
PB1-F2
Le fasi centrali della replicazione
Proteine precoci
Proteine tardive
NP
gene aviare acquisito da virus pandemici H2N2 e
PB1 H3N2
aumento gravità
malattia nei topi
Pappas et al., 2008
PB1-F2 1918 H1N1 e H5N1 aumento virulenza (attività proapoptotica in cellule immunitarie Conenello et al., 2007)
Glu627→Lys in PB2 di ceppi umani di
PB2
H5N1 e H7N7 e 1918 H1N1 aumento virulenza?
PA
Le fasi centrali della replicazione
NS1
• Regola la replicazione dell’RNA, tra cui blocca
uscita precursori mRNA cellulari dal nucleo =
massimizza la disponibilità di cap per sintesi mRNA
virale
• Inibisce la risposta antivirale della cellula
(antagonista produzione IFN tipo I)
• Previene la maturazione delle cellule dendritiche
umane e limita l’attivazione dei linfociti T
Jackson et al., 2008
NS1 di 1918 H1N1 e
H5N1 HPAI aumentano
la gravità malattia nei
topi
Le fasi centrali della replicazione
M1
• Importante per la fuoriuscita dal nucleo dei
RNP: si lega a RNP e a NS2
• M1 convoglia i diversi segmenti al di sotto
delle zone della membrana dove maturano le
particelle
HA
NA
NS2
NEP (Nuclear export signal) collega i fattori di
trasporto fuori dal nucleo cellulari con il
complesso RNPs attraverso il legame con M1
Fasi finali dell’infezione
NA utile per la diffusione del virus dopo la replicazione :
• Attività di clivaggio recettoriale (altrimenti a budding
completato il virus rimane legato a recettori acido
sialico) ¾ rilascio nuovi virioni
• Rimuove i residui di acido sialico dall’envelope virale
¾ previene l’aggregazione di particelle virali
Fasi finali dell’infezione
Moscona A. N Engl J Med. 2005
NA Influenzavirus A
•
•
•
Specie-specificità
pH ¾ attività virus umani
e suini a pH > di 4,5
mentre volatili anche <
pH 4,5
NeuAα2,3Gal oppure
NeuAα2,6Gal (specificità
dipende da aminoacido
in posizione 275)
il sito attivo della
neuraminidasi è
conservato
Il sito attivo è il bersaglio
dei nuovi farmaci antivirali
•Tamiflu (oseltamivir)
(resistenze in H1N1)
•Relenza (zanamivir)
Fattori di virulenza
Basler & Aguilar, 2008
Non dimentichiamoci perché fa paura
antigenic drift
strategia di sopravvivenza
a breve termine
antigenic shift
strategia di sopravvivenza
a lungo termine
Antigenic drift
• Mutazioni puntiformi con sostituzioni
aminoacidiche in HA o NA ¾ variazioni di
almeno due siti antigenici portano a nuove
varianti antigeniche, stesso sottotipo
– RNA virus tassi mutazione 1.000 volte maggiori di
virus a DNA
– Mutazioni <1% ogni anno
• H1N1 e H3N2 hanno mutazioni più frequenti rispetto a
Influenzavirus B
• Virus tipo A ¾ ogni 105 virus ¾ 1 con point mutation in
HA o NA
– Durante epidemie infezioni nel 10-20% della
popolazione, fino a punte di 40-50%
Difficile prevedere la comparsa di
nuove varianti antigeniche
Antigenic drift
A/Panama/2007/99(H3N2)
A/Fujian/411/2002
(H3N2)
Treanor, 2004
Antigenic shift
• Cambiamenti di uno o più segmenti genici
– quando due diversi virus infettano la stessa cellula può
verificarsi un riassortimento dei segmenti genici tra i due
genomi con formazione di un nuovo virus
• Cambiamenti maggiori, nuovo sottotipo
• Può essere responsabile di pandemie
Antigenic shift
Claas, 2000
Antigenic shift
Zhou et al., 1999
Mixing vessel
• Suino si può infettare con virus aviari e con virus
umani
Ito et al., 1999
• Nel suino si verifica riassortimento tra due o più virus
• Il suino può trasmettere virus influenza all’uomo
Comparsa virus pandemici
Ito et al., 1999
Claas, 2000
e il nuovo A (H1N1)?
Nava et al., 2009
• È un virus nuovo,
con caratteristiche
uniche
il nuovo A (H1N1)
Trifonov et al., 2009
Solovyov et al., 2009
Smith et al., 2009
Smith et al., 2009
• “sister relationship” con Sw/HK/915/04 che non si
può interpretare come evidenza di origine eurasiatica
del nuovo A (H1N1)
• Non sembra avere caratteristiche di virulenza o di
adattamento all’uomo a conferma di un virus di
origine suina che provoca nell’uomo lievi sintomi
Attività di NS1
Grazie per l’attenzione