DECRETI, DELIBERE E O R D I N A N Z E MINISTERIALI
kIINIS'I'EKO DELLE RISORSE
AC,KICOI,E, ALIMEYTARI E FORES'I'A1,I
discipliii:~ i i i i1i;iicri;i di piihblico iiiipicgo. ;i iioi.tii;i
dcll'ii~.i. I dcll;i I c ~ g c23 r)iiohi.c 1003. i l . 42 l :
MINIS'I'EIIO 1)i:L.l-E RISORSE
A<ìRICOL.Il, ALIMENTARI E I-ORES7'AI.I
ISPI'TTORATO C E N T R A I E REPRESSIONE FROIII
Vi3ii 1';ii.i. lidel rcsio clccrciti-legge l i oiiohrc 1935.
11.20.M. ct)ii\criiio ~ i c l l ;I~c g c IS iii:~r/o 1926. 11. 502.
r i ~ ~ ; i i d ; i i i la
i c i-cprchhioiic clcllc l'i-cicli iicllii pi.cp;ir;i/ioiic c
1121 c ~ i ~ i i ~ i i c i (li
c i ososi:i~i/c cli L I \ < ) :igr;ii.io c cli procloiii
:igrari.
c l'iiri. IOS del rcgol:irneiiio pcr I ' ~ c ' c ~ ~ / i odcllo
iic
siesso i-cgio d ~ i . i . c i t i - l c ~iip~i'ii\;iio
g~.
coli regio dccrcia I "
luglio 1076. n . I i O l . i c 1 ~ i ; i l i prchcri\.oiio clic Ic aii;ilihi
occoii-ciiii in applicn/ioiic tlcllc ~ioriiiccoli icii~ilc1ic.1 rcgio
decrcio-lcqgc
- - c iicl re-ol;iiiicliio di ci;cc~i/iciric 3~icldctii
dovraiiiio c.;>ci-cc..;cs~~iic
dai I;ibor;iic)i-i iiic;iric:ili coi1 i
iiic~cicli di ; i ~ i ; i l i h i prc\c].iiii c1:i c l ~ ~ e \ i oI l i i i i ~ ~ c r oili.
conccrto con i l Rliiiisici-o dcllc liiiiiii;/c. i l I\..liiiisici-odcll;i
siinitii cd i l hlinisicro dcll'iric1iisiri;i. del coiiiiiicrcio C
dcil'niii-'iri:in;i to:
Visio i l ciccrcio lcgislaii\.o 3 ICI.>briiio 1993. 11.2 0 .
coriccrncriic noriiic per la rnzioiiali7za;lio1ic dell'organi//:rzionc dcllc nmniiiiisirii;lio~~ipiihhliclic c i.ci.isioiic dcll;i
L'i511 i cicci~cii iiiiiii~~ci-i;~Ii
IS I~iglic) 1075. pt11~13Iic;iko
iiclla ( ; r r i : < , l / r r ( '//ic.i~r/<.
11. 3 1 J tlcl I I ;igo>io 1075. c i0
\ c i i c ~ i i l l1070.
~ ~ p~ihh1ic:i~o
11cIl:i ( ; ~ r : : ~ ~ / ; i r ' ( ' ~ j i 11.
~ i SI
~r/i~
Approvarione dei «l\letodi di analisi per il roiitrollo ufficiale
tlcgli aliniciiti per uniniali - Supplemento n. 9)).
DETEilMINAZIOhT: DELL'?i.?UTOSSINA 81 - YLETODO A
PER CROhiATOGFAPIA H O N O D I K E N S I O N ~ SU ST2ATO S O L T I L E
Il !rs:o Jcl p~cnro '1. j c o c q r campo
'
d j a p p i i c 3 ~ o r i c i- rornriisro
i u i rcs:o irgircnre:
i . Scopo e cmpo di upplicazionc
Il metodo permette di determinare i1 tasso CI ai?a:ossina B, delle matcrrc prime e dei mangimi scrnplici. Questo maodo non si npplics. in prcsenzn .'i pslpc di agrumi. Il Iimi!c inieriore dd dosaggio b di 0.01 mglkg ( l 0 ppb).
In presenza di sosrmze intcrierenti c5c iritralciano I= dctcrrilinazicni. occarrc :!perere !'malisi secondo 11
metodo 6 (cromstograiia 1iqu:da ad al'). pressione\. '
DETERMINAZIONE D E L L ' A F U S O S S I N A 31 - METODO B
PER CROMATOGRAFIA LIQUIDA .AD ALTA R I S O L U Z I O N E
1.
Scopo e cynpo di a p p l l c a z i o ~
Vicnc >~opostoUn mctcdo per :a deccm:na;ione dei1'~rlarossins 3, ne-li iiimenr! di .SO
inirnde. !nc!usi quelli contenenri polpe ai agmrni. Il iirnrre minimo di dcrcrminazione t
0.001 rnpkg ( l ? p 9
L.
Principio
11 campione viene a r n r r o con cloroiomtc. L'csrr~rrne ;ilmro cd rin'ailcuou e puniicaw su
m m c c i di ilonsil e ?i su umrccia ai C,,. La se?amrone iinaie c ieterminazionc sono otrenure per ~ ~ r n a c o p t liqui&
ia
~d alti nsoluzlone (HPLC) usando una coicnna C,,in i u e
inveno, x g u i n da una w o n e di denvauzzazione ?sc-colonna con soluzione ~ c q u o s adi
lodio e rivelazione per fluorrscenu
Le niicoiosriit: sono sostanze molto <ossic.ie. La deceniinuione
si deve n e p i r c sono
cappa per htmi adibita a questa scopo. Spcciaii prcuuzioni si devono ?rendere quando le
:ossine si n o n n o ailo stata ;ecco 1 causa della loro nacum elenrostauu e la cendenu a disperdeni ncll'area di lavoro.
l
Clomicrmlo. s u b l i i z x c con 05 %-!
10.1
5.2
Mctanoio. p d o H P L C per !a ?reTanz:c::e
3
So!venti cluenn . d i prc?an-c
uimuoni.
.-.
i..
:
./O
di ~ranolo.In peso. Vedere osscrrolione si punto
&!la
miscela i 1 piinto 5 6 .
p c ~ nrirn?
o
,:ell'uso. zoo:irr ~c.r,.sarli medinrire %a-o
.V-?. . L3. csmnos;uor,e &!ia iase
della ccionna HPLC ti-ica.
m33i::
iri
5 ~ ~0S I C T - moc.iii~itaa seconda s e : ! ? c a r z n e n s u r ? ~
S C I U Z ~ ~~C Z
- U O S P s i a i a i: !oc!%. .i3pu113":
1 3 $i .scio a W J x! ;i iccya. .\giare
mediante sgucore maqneuco ccr d m e z o 30 minuu e iilmre acuaveno iii~v a memorana
(4.1-Thtefigrre !a saiunone sanira da:ia liire r>cr ?ievcnire ericru awuu 1 !-i:oie-carione.
3.!0.
S r n i c c a C,, f W a w
3.i l .
Gas iriene.
SE?-?PX',
o e~uivalentc
3cr 5 ~ r n - i o ~ o t o
3.12.
Soluzione sunaard di Iflamy!na B,. in ciomfomio. concenranonc 10 yyml. Controllare ia
concennuione deila soluzione come segue : determinare lo spettro ai assorbimento della soiuzione ira 330 e 370 nm mediante spetuotoromem (413); rnisunm I'auor8Pnza (A) ai
rnasstmo vicino a 363 nrn : calcoinre la conccntnzione di aflacoarina B* in micrognmmi per
milliiim di soiuzione mediante la fomuia :
312 x A x 1000
13391
A
conccnnuione (plyrni)
-
2300
_
3.! 2.1. Soluzione sundud stock in aflatosstna B, in ciorofonnio.
Trasierire quantitauvamente 2.5 rnl della soluzione sondam di aflatorstna B, (3.11) in un
mauacuo u n w da 50 m1 porundo a volume con doroiormio (3.1). Conservare questa so!urione. ben chiusa ed i m i t a in un foglio di alluminio, in un posto trexo (4 "C) al buio.
3.13.
Soluuone di ulibrazionc di ulatossina 8 , per
HPLC
'VS. :Per la preparazione di questa soluzione w r e veuena prtvenuvarncnte iavau con acido
(vedi al punto 4, apparecchiacun).
3.13.1. Soluzione di calibnzione, 4 ng/ml.
k i u condizionare per qualche ora a t t m p c n m a ambiente la soluzione sunrlard stock
(3.121) a r n i a in un foglio di alluminio. Trasferire 400 pi di quau soluzione (200 ng di d a tossini B,)in un pallone uruo da 50 m1 ed evaponuc la soiuzione fino a secchezza per m e n o
di una corrente di gas inerre (3.1 I). Sciogliere il m i d w orrenuw con cim 20 m1 della misceia
acqua-acetone e mizceia- bene, p o n r e quindi a wlumc.
3.132 Soluzione di caiibraz~onc3 nglml.
Trasienrt q u a n a m w a m r e 7 5 m1 della soluzione di calibnuone (3.13.1) in un rnamcno da
10 mi 2 p o m a volvme con la rnmela acqua-acerone (333) e mzscelare bene.
Trasferire quantitatiwnente -i m1 dcl!a soluzione di c d i b r a o n e V.13.1) in un micnrcio da
50 m1 e ponarc a voiwne con la miscela acqua-acerone (353) e mixelue bme.
Quata soiuzionc viene wtn uiclie d u m t s i'uiaiisi per W L C come smdrrd di riferimento
per le inioioni ri~etinve(5-9.
Trasienm q u n n u i j m e n u 2
.5 m1 deila soluzione di ulibratrone (3.13.1) in ~n ~=rutracciocii
10 mi e p o m r a volume con la rnisceia acq~a-acetone(353) e miueiare bene.
3.14.
Fidi icz:rnsntc una nilncia delle ailarossine BI, FS Gi e Gt la cui concmmztone è app;ossimacivamente di 1, 0.5, i e 0.5 &m1 rispetsivomente in 1 mi di cioroiomio.
Irasienrc il contenuru ae1ia fida i.3.14) ia una provena con uppo di v e m o in una fiah con
tappo a vltr. Trasienre .+O
di questa soiuzione in uii mauacuo da 10 rnl o in una provena
con xn uppo di v e m (invati con acido). U~apararcil clomfomio mediane una comnte di gas
inerre (3.1 1) e ridi~aogiierein 10 m: della niscrlia acqua-acerone (333).
c o ; i ~ i i i odi'confem.a (6).
3.15.
Reagena per la
3.15.!.
soiuziont acquosa sacura di clomro di soaio.
prova
3.152 Solfato ai socio aniaro. granularc.
Arrcnxicxr : L'uso di vctrena non lavata con ac~dipu8 causare perdite di tflatossina in soluzione acquose Panicolare attenzione necessiuno la vemria nuova, le p i v P ~ t c u re la
veuena dei dispenwton automauci come ad esempio le fiale degli au~ocampionacori.Per
qucsrt ragione la vemria da usare con le soluzioni acquose di itlatosstna domi esrm immersa
in acidi diluiti (ad esempio acido solforico 2 moiill) per parecchie ore e sciacauau poi 'bene
con acqua distillata per rimuovere ogni mccia di acido (ad esempio m mlce e controllo con
canine al cornasolc). in pratica, questo tratramento è necessario per i macncct a ionao tondo
(4.4), pailoni un& cuindn graduui iiaie e provette per soluuoni di uiibrazione ed esrnru
iinaii (in puricolare. fialene per autocarnpionaton) e pipene Pasteor se usau per il prelievo di
soluzioni di ulibtuione o di estratti.
Seuccio con icri da 1.0 mm di diarnerm ([SO R 563.
.a.gucor meccanico.
Evaponcorc. mance da vdoco. munito di pallcne a fondo condo da 1SC-250 mi.
Appareccniamn p?: cmmatograiia liquida ad alta risoiuzicne, ini.'trore con un a.molgimcnro a
spirale aciarro Gcr iniezione & 150 N. Vcdrrr le isrniuoni della d i m cosaunnce per il paniaie
e cornpleco ncrnpimtnro de!l'awolgrmenro a spiraie.
Coioana a~alitica,per XPLC: C:, impaccaca. grznuli da 3 o 5 W.
Pompa a pulsazioni libere pcr I'effipuone -5:-colonna
&!la scluzicr:~di iodio
Tu50 a T per vo!urne morto Valco zcm. accaio inossidabile (1/:6" x 0.75 mni).
~:srer.a(u =azione 3 spiraic : tcflcn o acciaio ir.ossidabilc. Le dimtnsiori da 3 000 x 0.5 mm
a 5 0UC x C.5 mrn scno risultate anpmpizrt in ccmbinarrone con cclonr?c ILPLC da 5 o j
P.
;un.
8 2 ~ 2d
0 acqua con ccxnosraro regoiaco a 50 "C. c;pzce di una rego!azior.e iii rcrnperar-in
supcnorc a 0.1 'C.
Rivelarcrc a fluomcenzs. re.piacc <la !urig!iczia d'onda di 365 nm di eccirztione ed a 435
nm & emissioric i c r smrncnro a f i i a ~:ilizzare un film con lungnezza d'onda m a r ~ o r edi
%O nm). Devono essere possibili nvelaziani di dmcno 0 2 5 ng di dhrossina BI. Una leggera
crrnmprssionr: ~ u m
h c r e consigliahilc (ad esempio per mezzo ài rcsmzione o connessione
dcll'uscira del rivelarore con una spirale di ttslon o acciaio inossidabile) d!o scopo ai evitare
i o m z i o n e di boiie d'ana nei13 fotocellula
Kegisrr~:orc con siunpanrc.
Fiirro di carta picghemro di diari?em 24 cm del upo Macherry-Nagcl 617 1/4 o equivalente.
Film a rncnlbiana con porusià 0.15 <n. ( H A W 04700) Millipore o quivalente.
acua da 500 m1 con nppo a smeriglio.
Colonna di veuo (diunecm interno urca I nlunghezza circa 30 cm) con ser5acoio superiore
da 50 mi.
Rubineno di rrareride resisunu al cioroiomio (per esempio Bio-nd 7328017. Anal+chcm
..il 4075. J.T. Baker 4514 o q u i n i e c u ) .
Siringa chimicamente raisrcnrc. capacità 10 rnl.
Siringa idonea per iniezioni in HPLC di 2.50
a.
Miamsiringa da 100 M per la preparzzione delle soluzioni di u l i ~ n z i o n e(conauiiarc
m,dianu peum che I'accunrem un enau il 1 @/o).
Pailonani tanti da 10 m1 con uppo a smeriglio.
S p e o i o t o n e m . idoneo per misure nella regione W.
hpparcccnianin per la prova di conferma (6).
Imbuco separarore da 100 mi. lavato con aciai. con rubinetto in reflon.
Preparazione dei campione
Maamre
(42).
campione in n o d o che esso passi aaravenc
i1
I
fori da ! mm di luce del setaccio
Ponione di cimpione per l'analisi
Pcwrc 50 g del campione in esame in una beuta (4.16).
Esuuione
Agpungcre 25 g di cclite (3.8). l i 0 ml di c!omtomio (3.1) e li mi ai acqiia. Tappare la k u u
ed agitare per 30 minuti su agitatore meccanico (43). Filtrare su cana da iiltm pregiemu
(4.14). Raccogiiere 50 mi dei iilrnco. Per campioni che nchiedono diluizioni pre!cvare un'aiiquora del iilrraro e diluire fino a 50 ml con :lororormio in rnoao ch: la conccnrnzione di
aflacossina 9, non supcn i 4 cglmi.
Punficazionr (il 9mce3imenro non aovra suoire signiiicat~veirirermz!oni)
Artnnzicne
:
pmtecgere aacgwumeri:e
seguenu ac:rrgnirriii :
i1
laboraro~odove xcnc eseguiw l'analisi dalla luce diurna con
i
I) Fogli assorbenti raggi UV sulla iicesm in presenza i i luce irtcnuaca (ev~tareia luce
airena del ocle) :
1) cencit
O
pentane in combinazione con luce aruiiciaie (sono iaonei ancne
i NDI
fluore-
scenti).
- ic soiuzioni
contenenti &o<ossina debbono essere protette ii piu posjt~rie daila luce
(tenere ai buio con fogli di alluminio).
5.4..
P l u r i f i c a z i o n e c o n florisil SEP-PAIC
j.4.! .l. Preparazione dell'assemblngpo coionna-camccia
Anacclre un nibtnerto (4.13) al pmDo più cono delia cartuccia di flonsii !?.8) (vedi figura !).
Lavare h ctmiccia e rirnuorcre l'aria con i @ m1 Oi clomiomio facendone passare 8 m1 armv m o la a m c c i a con l'aiuto di una siringa (4.19). Collepre il gambo i u n p della cartuccia alla
colonna (4.17) e far p w r e i nmmenu 2 m1 deila camccia aila colonne. Chiudere il rxbioetro.
Rimuovere la siringa.
Agsiungcrc il fiknro nccolto in 5 3 al13 colonna-camccia già assemblarc e sczncarc per
p v i u Lavare con 5 m! di clomfomio (3.1) x p i a da 20 m1 di mccar.oio (3.2). Scarra:e gli
eluati. h r n t c aumrc opcnzioni I'wemblaggio colonna-cusuccrs non d m rinxnexr a secco.
Eluire l'darossina P, con -rO m1 della mrscela aceronc-acqua (35.1) e raccogiicre l'intero
eluaso nel pillone & 1-50 m1 dell'evrporatore mcanu (4.4). G n c c n m r r i'eluaro nelì'evapnmre a 90-50 * C sino a i termine de!la diiciliuione dcli'acerone (NB:A queno punto rimangono ncl pallone circa 0 5 m1 di liquido. Prove sperimenali hanno dirnmmto che un'ulteriore
evaporazione i opportuna e che nei rimanenti OS ml di liquido non C'S sipiiioriva rnccia di
acnoite. Residui di zcetone p o a b b c m C~'YE;E
perdite di aflatossina B, nella urniccia C,,).
m u n g e r e 1 rnl di m e m e i o (57). agitare i1 pailone allo scopo di diwivere I'aflarossina sulle
p r e t i nel pallon: aggrungere 4 m1 di acqua c mixeixc. Disinserire e s c k u r e ia cartuccia.
La- la colonna di v e m con xqu e conscrwia per la succrissivc purificazone su C,,.
5.41.
Purficazione su SE?-PAK C,,
C o i l e y un mbineao (4.i8) al gambo più cono di una carv~cndC,8 (3.10) (vedi f i p r a i ).
Gnla camccia rimii<n.trtdo l'aria e hcrnd:! p s a x rapidamcntc 10 m1 di m t m o l o ( 3 2 )
via rubincnq con I'aiilw della siringa (4.19) (le h l l e d'aria nella cartuccia scno -sibili come
u
Aspirare LO m1 di acqua C
macchie di luce sul fa& dmmenci u ~ e m m grigusm>).
inni+passare 3 mi nella amiccin (nel passagpo h rnec~noloaa acqua mare Lnuoduaoni di
ma nelin carmcaa). Coilegut !i gambo più lungo 4dla cartuccia dia coiorna di veuo (4.1 7 ) e
iar passare i rimancnn 1 iiil dalla camicca aifa coionna. Chiudere il tubtnmo. Rimuovere la
siriqga
Twferirr quancàuvamcnre I'esmno ncrolm in j.4.12 nella colonns di wrm (4.17) !avarido
due volte il rnaanccio con 5 n11 de!!a rnucch acqw-mcmoio ( 3 3 2 ) e scaricare per ,gtavlci.
L'insieme colonna-camccxa non a e w nmaricrc mai secco. (Se ie Colle d'ma si sviluppano in
pmsxmiri della anuccia i n t m m o e r c il flusso e picchierrare la sornmrtà della-colonna p r
nrnuuvtt-c le bo!te d'aria Poi continuzre). Eluire con -5 mi cella miscela acqw-meunolo.
Scaricare I'eluaco. E l u i z i'aflamssina 8,con 50 m1 cella miccela acquatacctone (3:53), e nccogliere !'intero eiuato in un paiioncino riatlro da 50 mi. ?or,zre a volume con a c a u ed aptarc :
q u c a soluzione i usata per la cmmaropiia (5.3.
r?ttenrronc: Generairnen:e ncn è necasaria la fiimzionc di qilesco estratta finaie. In caso
conmi-io non usare iiIm di cell~iosaperché cauxrcboero peraite di diatossica
m a pcr -se.mpio, film di rtflon.
(Vedi figun 1 per la mesw in opera aell'apparecchiamraI. ?rima ucil'uso :ar ionaizionare per
un tempo suificientc lo srrurncnco.
Le veiociti di flussa inaicau per i solventi ed i reagcnu posr-coionna sono inaic~uve.Esse
pouono essere variate in dipendenza del upo ai colonna disponibile.
I picchi dciiz zflvrc~sina8. iiil,cndo.:g daila rcmpznrdn, quindi si dovn effcn~arc una
compenswone della dcnva (vedi f i ~ ~ 3).
r a Ii::cliar.do ad intervakli repo!aii una quantiu iisw
ac!lo sundard di nicnmento ai aihross;r,o (3.153)(p-r esempio ogni tre inierior,~).I valcri dei
ctcchi di afkrossina 9,u.i due successive iriezionz di sunaard possono cssere correm uando
il vaiore medio dei esultari. sempreche 1 1 differc:ia ira i aue valori dellc nsposre sia molto
p;cco!n !< 10 %). Perci5 ciebbono essere iane iniezioni senza interruzioni. Se è nrceswna
un'inremuione. I'uItiina iniezione prima dell'inremuione e la prima iniezione dopo I'ir.temzionc devono csxre cocsidemie s i t n k u di riicrimento (3.133). Daro che la CUM di caiibnnone è lineare e passa pcr I'oripnc. le quuiuci di +rIzrossina B, nei iampioni s m t u sono
detennintte diremmmte eferendosi agli srandar4s adiacenti.
S.S.;.
Messa in i u n z i o n e della p o m p a H F L C
ReguIare la pompa HPLC ( 4 4 per avere un flusso di 0.5 o 0 5 mlimin per una colonna
(4.6) usando h iase mobiie indicnu al punro 3.6.
H P L C r i s p e ~ v a m m t e di ;un o 3
5.52
Messa in f u n z i o n e della p o m p a p o s r - c o l o n n a
Regolare la pompa (4.7) in modo h avere un flw di 0 2 4 . 4 mllmin aella soluzione acquosa
satura di iodio (3.7). Come guida approssimauva : Fliissi di circa 0.4 o 0 2 mllmin circa sono
consigliru in combinu~onecon flussi della fase mobile (3.6) di 0.: o 0.5 mllmin rispcnivammu.
553.
Rivelatore a fluorescenza
-
-
365 nm ed un emissione
Regolare il rivelatore e fluorrrcenza (4.1 1) ad un eccitazione
435 nm @er saummti a filai. lunghezza d'onda > 400 nm). Regolare I'anenuacore del nvelamre in n o d o da o r n e r e . per 1 ng di afiatmsina B,. tira 1'80 '/o di deflmione dell'inten
scala del pennino dcl rcgismrorr.
55.4.
Inicttore
Inieaare. per mue le soliuiopi, 270 pl sependo sempre le indicazioni della di:ra cosmtince
dello strumento.
55.5.
C o n r r o l l o del!a s e p a r a z i o n e crornarografica
Inietun la soluzione di ccnnollo crom3tografico (3.14.1). L valli dei picchi donebbero essere
meno dél 5 % della wmmx del!r ~!rcrrcdei picchi ~dlactnu.
55.6.
C o n r r o l l o de!ia ;:abilita
del sistema
Prima di cgni serie di anaiisi inirnare npenirnmenu Io mndard di rifenrncnro (3.143) sino ai
nggtungimenro della ~cabilicàdel vaiore delle aree dei picchi (WL>:
la n:posta dei picchi per
I'aflarossina B, tn d ~ iniezioni
e
consccuuve d o m essert meno dei 6 '/o. Procedere s e n u
nurdo con il conmi!o della lineanri) (55.7).
53.7.
C o n r r o i l o della linearira
Icicture le solunoni di u i i b n z o n c dcil'zllarolsina E, (3.13.1-3.13.4). Ogni 5 inierioni uwre lo
sundard di rifcnmento (3.133) per la cofrc-ione della denvi nella risposu ( N B . in 90 minuu
i valcri ael picchi degli sundards di rifenmrnto non devono differire più del 10 '10). Correggere per la deriva sczorido le indicazioni del!e formule ai punto 7. il p ' i c o di ulibrazione
dovrebbe essere lineare e p a a r e pcr l'origine e n m 1 x l'errore sundard del viiore di Y
sumalo. I valori t m t i non devono diffenre pii dei 3 % dei valon teonci. Se qvanto richiesto
è soddisf;:to, pmseguirt senza riurdo. Se non. iaenuficam e quinai correggere le cause dcll'anomdia prima di conilnuare.
8
.
I n i e z i o n e dei c ~ m p i o n i estrar::
Inierrrrc gli csuatri dc! campioni purifiuu ;S.+-). Dopo ogni aue campioni csrntti nperrre
I'iniezione de!lo swnclard ai nfenmenro (3.13.3) secondo a i e sequenz : strndard di nicnmento. cstnno. ntntro. sundard di niecmento. =strano. estratto. sondard di nfeiimento. ecc.
b.
.%va
di conferma
.Aggiungere 5 ml Bella soluz:onc Ci clomro di w I i o (3.ij.l) :Il'cstratto :inzie otrcnuro ai ;;Unto
5 . 4 2 Estrarre 3 voite con 2 rnl di clorotornio (5.1) per I rninuro. sacco U n irn~uroscpracore (424.1).
102
SraOiir;;czionr
drl clom~iomioG.1)
Lc canttcnsuchc ai assorb:mento dcllr cartuccia di flonsil
I* oossono a m o i m x vengono
uwu aim subrlizzaron diversi aail'alcol Cio s, puo venhcare :n accordo al punto 1 0 3 quindo
non e disponibile i l ciororomio indicato
La correm appiiczione del metodo d o r i essere veriiiau iacenao npCNCe anaiisi su mitendi
di riferimento cenifiuti. Se quesu non sono disponibili. i'idoncicà del metodo si verificheri
con alm prove di recuperi e f f e m u su umpioni di conuollo. 1-1 deviazione della media dal
valort reale. espressa come percentuale del valore reale. non d o r i porsi fuon d a limiu
- 20 %. 10 %.
2 1 -4- 1 lN-4
.
p
(;:\/'/l,
----- -.
-. ..
.
---
1.1. \ ( ; i l l< l ',l l 1)l l i \
-- .-.
p
-
-..- --
1. F a x mobile
1
1.i HiiI l ( \ i \ i l i\4
- .. . -. .. .... ..
. . -
-
. .
.-
.yc I 11'
..-.
8. Giunco a T
9 . Bagno con conrroiio ccrmosuuco
10. Awolgtmento di reazione a soinle
1 1. Rivelarore di fiuorescenra
17 Tubo di nsrnngimcnro
1.:
Scuico
14. Regisuarore. inreprore
I Pompa
3. Valvola d'iniezione
4. Pmcolonna (saivocolonna)
5. Colonna amlitiu HPLC
6. Soluzione urux di iodio
7. Pompa del mgente
Figura 2 : Diagramma d i / I u o del sistema a i mmarografia liauidc (CL) C drnvarizza.
ixonr post-colon?ta con iodio
I
medio degli s u n d u b di riicrimenco adiacena
I
I
I
I
I
I
I
L
smdud di
nfenmento
a a a o (o
cnlibnnte)
amtu, (o
aiibnnoc)
-rempo
strndord di
esmno (o
ctiibnnte)
riferimento
Figura 3 :Compmrazionr per la dcn'va nrika ruposta d i afIazossina B, all'inir=lonc drllo
sra&rd
d i rijmmrnto (3.:53) ad intervalli rcgoian
.
;c~~:c~/~(/!t~
. ..
.
. ..
il.
92
. .
DETERMINAZIONE DELLA FIBRA GREZZA
Scopo e campo di applicazione
Questo metodo rende possibile la determinazione nei mangimi della quou di sostanza organica,
e u n u da lipidi. insolubile in mezzi acidi e dcalini e convmzionalmenu denominata fibn grezza.
L
Principio
il campione sgnwto, quando necessario. i rnauo in s q w n r a con soluzioni bollmri di acido solforico e idrorsido di poassio a dcrerminau conceaazioni. 11 miduo è sepanw per filuazione su filtro
di Y~POMtrrizzam. irvaro. sccuro. pcsuo ed incenerito tn 475 e 500 *C I
iperdita di peso, dopo
incenerimento. coirisponde aih fibra grrrrr p m t e nel campione in esame.
3 5 Annschiumi (per esempio n-omnolo).
33. Aiuto-filaazione (Glite H 5 o equivnirnte) rnrraw a 500 "C per
4
ore (8.6).
3.4. Acemne.
35. Etere di perniio (per e m p i o 40-60*C).
ial& per ii v1Nmmto dei campione in esame con l i soluzione di acido solfonco o di idrarnto di potassio, muniu di un supporto per il aogiolo f i l m n u (42) e di un condono con la valvola a
più vie per lo scarico del liquido e per il collegamento al vuoto e possibilmente ad un sistema di ana
comp-
4.1. Uniu
Prima deli'tw. ogni giorno, pmisaldare per cinque minuu l'acqua della caldaia annessa ail'uniù
per il Iavrggio del residuo per il pmtx;ildamrnto dei reacrivi.
4 1
Crogiolo di v e m Elwnu, capauù 50 m1 con seno di veuo filtrante sinterizzato di porosici 40-90
p.condizionata a 300 'C per b m cempo. e raffreddato prima dell'w.
43.
Cilindro dcl!n capacità di aimcno 270 m! parante un refrigennte a ricadere per l'ebolliuone.
4.4.
SWa di esicurionc con t m o s u t o .
4.5. Forno a muffola ccn termosuto.
4.6. Uniu di csrrrrione a freddo consistente di un suppono per il crogiolo filtrante (4.2) e muniu di
condom con valvola per il vuoto e per !o scarico dei liquidi.
4.7.
Anelli di connessione in gomma per collegire all'uniù a caldo (4.1) il crogiolo (4.7 e il cilindro (43)
e per colle^ all'unrtà di esazione's ireddo (4.6) il crogiolo.
P.con la precisione di 1 mg. l g del campione prepurto e i n d u r l o nel cropoio (42) (veaere
le osrervuioni 8.1, 8 2 e 83) ed W u n p r e I g di auto-filaazione (33).
Sistemare il crogiolo nell'uniù a caldo ( 4 2 1 collepdo poi 11 cilindro (43). I n w d u m nel cilindro a
crogiolo. già collegiri. I50 m1 di acido solforico (3.1) prenscaidato vicifio al punto di ebolliuonc e
poche gocac di murdiiumr (32). P o m il liquido all'ebolliuone entro 5 I
2 minuu e far bollire
in modo vigcrcno csarrarncnte per M mrnun.
Aprire la valvola di scarico e filmre L'acido solforico sono vuoro (4.1) aanverso il crogiolo iiluante.
G w e il miduo raccolto sul crogiolo tre volte conxcucive con wrzioni di acqua bollente. Irnpicgindone ogni voltn 30 mi. cercare di eliminare sono vuoto il liquido fino a secchezza d o w ciascun
lavaggio.
Disinserire il vuota e inuodum l50 ml di idmuido di potassio (3.7) prenscaldaro vicino ai punto di
ebollizione, nel cilindro e crogiolo collegati. aggiungere poche gocce di antixhiuma (32). Portare il
liquido all'ebollizione 5 i 2 minuu e hre bollire in modo vigoroso cwnamente per 30 minuti.
Filtnrc.e ripetere le operazioni di lavaggto m e per il narramento con acido solforico.
D ~ p oil lavaggio finale e I ' c s ~ ~ c u z i o nsctto
c
vuoro. scollegarc il crogtolo contenente il residuo e
collegarlo all'uniti di es-mione a freddo.(4.6). Applicare il vuoto e lavare il residuo nel crogiolo 3
volte con aceronc (3.4). impiegandone ogni vo!u I5 mi. Dopo ciascun lavaggio fare scn?pre in modo
che rutto il miriuo sia raccolto sui tiltro. manrcrlendo il vuoto fino a cot?lpicta eliminazioni dell'acetonc.
Erriccarc il cro_pioio in sruf~a 130 " C fino a p n o cosuiitc. Raffrtddarlo poi in essiccarorc e pesnrlo
npldarncnte. T m f e n r e il civpicio in muifola cd iiiccnenre il C-nicnii:~a 475-500 "C per almcno
30 minuti. sirio a peso c c s u n u .
Dopo ogni incencnrncnto rafficddare il crogiolo pnrna in mu!fola e poi in essiccltorc pnma della
pc=m
Eseguire una prova in bi-nco con soio i reatr:vi. L n perdica di peso risultane dopo I'inccncnmenro
non deve supcrarc i 4 me.
6.
W c o l o dei risultati
I1 contenuto percenrualc di fibn grezza nei campione
C
dato dall'csprnsione :
b-c]x !O0 a
dove
a
b
C
--
-
massa del campione in g.
perdita della massa dopo inccnerimcnro a 475-500 'C de! icsiduo del campione cssiccato a
1 3 0 ° C in g.
perdita della massa dopo incenenmen:~ del residuo del bianco essiccato a 130 'C in g.
La diffcrcnu rn due d r ; c n i i i u i c r . i parnllelnincnri. effc:tuarc SU!!^ srcs-o campionc non deve eccedere :
- O3 valore a;;r>ixto pcr coatcnuto
- 3 % sul risultato piG c1cv;:o. per
8.
in fibrs g ~ e a ap i i basso Icl 10 O i s .
conrenutn in fibn g r c - 3 u y a l c o maggore di 10 %
Osservazioni
8.1. ! rnanp~rnicontcncnti piu dc! 13 7'0 di lipidi greu: dcò'mno esscx, p n n a dell'andisi. s p s . . u ccn
etere di pc:rolio (35). A u i e scopo. porre il crogiolo (42) contenente il campione pesato ncll'unicà di
estrarione a freddo (4.6). applicare il vuoto a lavare per rre voite consecutive con 30 m1 di etcrr di
petroiio (3.5). Mantenere il cropoio sotto vuoto fino a c o r r . p l ~ ueliminuionc del solvente dal
campione. r ms!cnrlc poi nel!'uniu di estrazione a czldc (4.1) e continuze corn: desairro al punto
$2. I rn:n_Pim!. conrcncnri lipidi :ne non posscno esscx cr:;a::i aireranicrite con etcre Gi petrolio (3.5).
debbono csjiri j p s s a t : ccmc indic~roa! puqto 8.1 e sgrassau un'alrre vo!m dopo ebo:lizioiic con
acido.
Dcpo e~ollizionccon acido e succcssiio ia\aQio. collepre il croglolo nell'uniu di esrrazione a
treado (4.6) e lavario trc vqlte ccn acctonc irr.p:csan6ont opiii voici 30 mi. b v a w poi con e::rc di
octra!io sempre 3 voite con a!iq:ic:c di 30 rnl. Manrencre i! campicnr sono vuoro fino a completa
eliminazione drl solveri[i C continuare I'anaiisi come axscntro a! pznt.3 5 iniziando con il t n t o men;o con iiross!do di porsss:~.
6.3. Sc i m-noimi cnnrciioono p:u ucl 5 ' / o di carOrtiari. rnp:essi ccsic carbonxo di C-lcio. porre il
c:c;gioio con:cncntc il campionr ( 4 2 ) nc!l'~n:W di csrrazione a caids (4.:) e iavarc il campionc rrc
voitr con acido ciurtarico :;.a) u s a d o aiiauorc ci 30 m!. Enpo ciascurz aadizionc !src:ar- npcsarc il
car~pi.;n: pc: almcnc 1 minuro prima dclii fiitrazicnc. Lvn:c una volu con acqua t poi isnrinuarc
come acscr.tto i l punto i.
8 4 Se viene i m p i e p : ~un appirccckio
3 piu pos:: {.5urrsi c:ogtoi, posti nella s t e w u , i ~ r ia caldo) Zon
drvc csscre escguira nclia srcssa scrit di analisi la rlcrcrminizionc in aoppio dc!lo stesso carnc:onc.
6 . 5 Se dcpo eDo!i::iont. diffic!!e iilr:~re I. sciuriont actda o basica. inrrodurre aria compressa a;tnvcrso
:i concorro a: sc2,ico ùell'unira a caics ~ i c s : p c n d o poi IJ iilrrszione.
X.5
L3 remperaru:a ai inccnerimcnto non icvc suctrar: i .;(!O 'C siio scopo di allunpre la vici dei filtri
ci ve:ic or: crogioli. E\,i:art con arrenziorie (i; procunri sbaiz: :cmici d:irance i cicli di risc:.iaamento e raitreadamcnro ai ;:ogio11
METODO
1.
DI CALaM.B DEL W R E EHKRGETICO DEGLI ALZ#ENTI COIBOSTI
DESTINATI AL POLLAME
Maodo di caicolo cd cspnssionc dei valore cncrgaico
Il valore energetico degli alimenti composti desinati al pollame è. calcolare secondo la formula che segue,
in base alle percentuali di alcuni componenti analitici degli alimenti; il valore b espresso in megajoules
(Mj) di energia,rneraboliuabile (EM).correti8 in azoto. per chilogrammo di alimento composto:
M J /kg di EM
amido
= 0.155 1 X % proteina greggia
+ 0.343 1 X
+ 0.1301 X % zuccheri totali (espressi in snccarosio).
Z sostanze grasse gregge + 0.1669
X %
1. Tolleranze applicabili ai valori dichiarati
Se, a scguito dei controlli ufficiali. si constata una diiferuizn di valorc encrgetico dell'alimento in piu o in
meno fra il risultato dei controllo e il valore energetico dichiantto. viene applicata una tolleianza minima
di 0.4 M j /kg di EM.
3.
Espressione del risulurro
Prcvia applicazione della formula suiridicata. i l risultsto oitenuto i approssimato al primo dccimale
4.
Maodi di prelievo dei campioni c maodi d'anaiisi da appli-c
11 prelievo del campione dc!l'alimcnto coniposco e il dosaggio dei tenori dei componenti analitici impiegati
nel merodo di calcolo sono effetruati rispettivamente secondo i mctodi di prclievo dei campioni e i metodi
di analisi per il controllo ufficiale degli alimeiiti per animali.
Si devono applicare:
- per il dosaggio delle sostanze grasse gregge: il procedimento B dcl mcrodo di cui al D.M.5.10.1984
suppl. n. 7 , GU 30.11.1984. n. 330;
-
per il dosaggio dell'mido: il metodo pol%imerrico di cui ai D.M.18.07.1975 suppl. n. 7. GU
12.08.1975, n. 214.