corso di
CHIMICA ANALITICA DEGLI INQUINANTI
Laurea specialistica - Scienze Ambientali Università di Bologna - Ravenna
Docente : Daniele FABBRI
Parte VIII
1 - analisi inquinanti organici
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
1
SELETTIVITA’ : esprime la capacità di un metodo analitico di determinare un particolare
analita senza interferenza dai componenti della matrice, ovvero di discriminare fra analita e
sostanze strutturalmente simili. (Il termine specificità è spesso usato come sinonimo).
La presenza di eventuali interferenti può essere riconosciuta attraverso l’analisi di opportuni
bianchi (matrice, matrice fortificata con un sospetto interferente, …).
L’interferente può:
 far ritenere che l’analita sia presente quando invece è assente (falso positivo);
 impedire l’identificazione dell’analita (falso negativo);
 influenzare il dato quantitativo.
La selettività’ può essere conseguita nella varie fasi della procedura analitica:
 selettività nel trattamento del campione. I potenziali interferenti sono eliminati nella
fase di trattamento del campione. Esempio: scelta opportuna delle condizioni di estrazione in
fase solida (SPE), cromatografia di affinità, polimeri ad impronta molecolare, estrazione con
un chelante, ecc.
 selettività nel sistema di separazione cromatografica. I potenziali interferenti
eluiscono in tempi diversi dall’analita. Scelta opportuna delle condizioni di analisi GC e HPLC,
GC multidimensionale (GCn).
 selettività nel metodo di rivelazione. L’analita è determinato preferenzialmente rispetto
agli interferenti che co-eluiscono. In spettrometria di massa possono essere usate tecniche
molto selettive. Esempio: HRMS (alta risoluzione), SIM (selected ion monitoring), SRM
(selected reaction monitoring, in MS/MS).
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2
All’aumentare del numero di passaggi gli errori possono aumentare ed il segnale diminuire, ma
a vantaggio di un aumento del rapporto segnale/disturbo.
intensità
S/N
segnale
noise
1
2
3
4
passaggi
dell’analisi
RG Cooks, KL Busch, J.Chem.Educ. 59(1982)926.
Esempio tipico : la MSn comporta una diminuzione dell’intensità del segnale all’aumentare di
n, ma con un deciso aumento del rapporto segnale/disturbo.
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3
gascromatografia capillare - CGC (GLC)
sistema di
iniezione
gas di trasporto
fase mobile
rivelatore
stazione dati
R
I
intervallo di utilizzazione
colonna
capillare
FID
NPD
ECD
forno
AED
MS
fg
rivelatore
termoconducibilità TCD
ionizzazione di fiamma FID
cattura di elettroni ECD
emissione termoionica NPD
fotometrico di fiamma
emissione atomica AED
selettività
universale (gas)
universale (idrocarburi)
specifico RX (organoalogenati)
specifico N e P (pesticidi)
specifico P e S (pesticidi)
elemnto specifico (TBT, RHg)
spettrometria di massa - EI, PCI, NCI, MSn, HRMS…
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pg
ng
logIDL-LOD
4 - > ng
6/7 - <ng
2/3 - pg
5/7 - pg
4 - < ng
mg
ID
tr
tr
tr/sp
tr/sp
tr/sp
* tr: tempo di ritenzione; sp: specificità della tecnica
4
HPLC high performance liquid chromatography
sistema di
iniezione
fase mobile
liquido
rivelatore
I
R
stazione dati
colonna
rivelatore
indice di rifrazione
assorbimento UV-vis- DAD
fluorimetria Fl
emissione atomica ICP-AES
selettività
universale
cromofori (fenoli, IPA, der.)
fluorofori (IPA, derivatizz.)
elemento specifico (R-As)
sensibilità
ID
bassa
tr
buona
tr / spettro UN
elevata
tr / sp
spettrometria di massa - ESI, APCI, ICP-MS, MSn
* tr: tempo di ritenzione; sp: specificità della tecnica
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5
Campi di applicazione
ionici, ionizzabili, polari
POLARITA’ analita
ESI
peptidi
APCI
moderatamente polari
non polari
proteine
sterodi
GC-MS
VOC, IPA, POPs
PESO MOLECOLARE analita
volatili, semi-volatili
Composti polari-ionici derivatizzabili: X-CH3, XSiMe3, X-CO-CF3 Fenoli, acidi grassi, steroli, zuccheri,
amminoacidi, alcaloidi (metaboliti)
Macromolecole  degradazione chimica, pirolisi
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6
spettrometria di massa
Lo scopo analitico della spettrometria di massa è quello di convertire il campione
in prodotti misurabili indicativi delle molecole originali. I prodotti sono ioni le cui
masse (o i rapporti massa su carica) e abbondanze relative costituiscono lo
spettro di massa.
Lo spettrometro di massa
separa gli ioni secondo il loro rapporto massa su carica m/z.
Introduzione
del campione
conversione in una forma
adatta alla ionizzazione
GC-HPLC
sorgente
ionica
vuoto
analizzatore
di massa
Elaborazione
dati
Collettore.
Rivelatore
di ioni
accelerarli
formare ioni gassosi
dell’analita
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Separarli nello spazio (deviandoli
su traiettorie )
o nel tempo (traiettorie uguali in
tempi ) in base al
rapporto m/z (energia,velocità,
momento).
Misurare la loro
abbondanza relativa.
Elettromoltiplicatore
7
CARATTERISTICHE DI UNO IONE
MASSA
Mz+
Viene espressa in unità di massa atomica.
unità di massa atomica u (chiamata anche dalton, Da) : 1/12 della massa di un atomo di 12C.
1 u = 1 Da = 1.6605 10-24 g.
Massa media (o chimica): calcolata usando le masse atomiche medie (pesate sugli isotopi naturali di ogni
elemento).
Massa atomica media Am dell’elemento A che in natura ha n isotopi, ciascuno con massa Ai e abbondanza
naturale Pi:
Am = P1A1 + P2A2 + … + PnAn
Massa nominale: calcolata usando il numero intero della massa dell’isotopo predominante di ciascun
elemento.
Ioni diversi che hanno la stessa massa nominale sono detti isobari.
Massa monoisotopica: calcolata dalle masse degli isotopi predominanti di ciascun elemento.
La misura della massa esatta di uno ione con sufficiente accuratezza definisce in modo univoco la
composizione elementare dello ione.
La massa esatta viene determinata con strumenti ad alta risoluzione (HR).
CARICA
unità di carica è la carica dell’elettrone e. e = 1.602 10-19 C.
Carica totale q = numero delle cariche z • carica dell’elettrone e: q = z • e
RAPPORTO MASSA/CARICA
Rapporto massa su carica m/z: se massa espressa in u e carica in e, unità thompson (Th). Numero
adimensionale se m/z espressa in numero di massa e numero di carica.
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8
esempi
L’unità di massa atomica è un’unità di misura ibrida. Indica una scala relativa il cui riferimento è
l’atomo 12C a cui è stato assegnato il valore di 12u esatte.
L’atomo 12C ha massa 12.00000…u.
L’atomo di 35Cl ha una massa 2.91407 volte più grande del 12C quindi la sua massa atomica è 12 x
2.91407 = 34.9688 Da.
La massa esatta del 35Cl è :
34.9688 Da (numero decimale)
35
La massa nominale del Cl è : 35 Da.
(numero intero)
La massa atomica media è utilizzata nei calcoli stechiometrici.
Br
Massa media = P181Br + P279Br = 0.4931 x 80.9163 + 0.50069 x 78.9183 = 79.904u
Le masse monoisotopiche sono utilizzate in MS per indicare le masse molari.
Br2
La massa di Br2 è 158u per convenzione, anche se la specie più abbondante ha massa 160u.
79Br79Br
158u
51%
“peso molecolare” in MS 158
79Br81Br
160u
100%
ione più abbondante 160
81Br81Br
162u
49%
CH3Br
Massa media : 12.011 + 3x1.008 + 79.904 = 94.939u
Massa nominale: 12 + 3x1 + 79 = 94u
Massa monoisotopica (12C1H379Br): 12 + 3x1.0078 + 78.9183 = 93.9417u
Gli ioni CO+ , N2+ e C2H4+ sono isobari: hanno masse nominali uguali (28 Da), ma masse esatte diverse:
CO+
27.994914 u
N2+
28.006146 u
+
C2H4
28.031298 u
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9
Caratteristiche di un analizzatore di massa
Limite di massa : valore più alto di m/z che può essere misurato. Applicabilità.
Trasmissione : rapporto tra il numero di ioni che raggiungono il rivelatore e il numero di ioni
prodotto nella sorgente. Sensibilità.
Potere risolutore (risolutivo) : capacità di separare ioni con m/z vicini. Prestazioni analisi
qualitativa.
Risoluzione R: quando due picchi, il più piccolo dei quali ha altezza h, di massa m e m+Dm,
sono separati da una valle che ha un’altezza pari al 10% di h, allora
R = m / Dm
(10% valley definition)
m
Dm
R = m / Dm
h
5%h
10%h
Altre definizioni:
Per i quadrupoli si usa la 50% valley definition di R.
La risoluzione per un picco isolato è la larghezza del picco (Dm) a un altezza x% dell’altezza del picco. Spesso si usa X%=
50% e la Dm è chiamata FWHM (full width at half-maximum).
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10
RISOLUZIONE
Doppia focalizzazione
HRMS
fino a 105
Singola focalizzazione
settore magnetico
< 104
Quadrupolo
Q
 103 (unitaria)
Per il quadrupolo la R è variabile lungo l’intervallo di massa (Dm è costante), per l’analizzatore magnetico è
costante (Dm variabile: aumenta all’aumentare delle masse).
Picchi adiacenti sono distinguibili se i loro rapporti d’intensità sono minori di 1:10.
Per separare CO+da N2+è necessaria una risoluzione :
R = 27.994914 / (28.006146 - 27.994914) = 2493
Per separare gli ioni molecolari del tridecilbenzene (C19H32+, 260.2504) dal
fenilundecilchetone (C18H28O+, 260.2140) è necessaria una risoluzione :
R = 260 / (260.2504 - 260.2140) = 7100
All’aumentare della massa aumenta l’utilità informativa della composizione elementare, e
aumentano le richieste di risoluzione e accuratezza.
Per aumentare la risoluzione bisogna diminuire la dispersione del fascio ionico (es.riduzione
fenditura), il che determina una riduzione della sensibilità (meno ioni raggiungono il
collettore).
Per un analizzatore magnetico ha R = 1000.
Per uno ione di massa 100,0000 Dm = 0.1, per uno ione di massa 1000,0000 Dm = 1.
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11
Picchi isotopici
Una molecola contiene n atomi di un elemento che ha due isotopi di abbondanza naturale a e b.
L’abbondanza relativa dei picchi isotopici segue una distribuzione binomiale:
(a + b)n = an + nan-1b + [n(n-1)/2!]an-2b2 + …
L’abbondanza relativa della molecola che ha k isotopi del tipo a è :
[n!/k!(n-k)!]akbn-k
Per più elementi le relazioni sono del tipo
(a+b)n(c+d)m…
Esistono programmi per il calcolo o figure per le abbondanze relative di cluster isotopici
www.sisweb.com/mstools.htm, www.shef.ac.uk˜chem/chemputer/isotopes.html
Elementi A+1
C, O, N.
Il rapporto di intensità A+1/A dà informazioni sulla composizione elementare dello ione (es. numero
massimo di atomi di C; massimo perchè al picco A+1 possono contribuire altri ioni, impurezze, etc.).
A+1/A = nb
Per il 13C b = 1.08%, con deviazioni di ~ 2% (20 ‰) a seconda della fonte. Per comodità si usa il valore
1.1%, tenendo conto del piccolo contributo del 2H (b = 0.015%).(Infatti, considerando 1.5 H per atomo di C
si ha per A+1 : 1.08% + 1.5x(0.015%) = 1.1%).
Lo ione monoisotopico non è necessariamente il più abbondante. Esempio molecole organiche:
se la molecola ha più di 91 atomi di C, lo ione A+1 (per 13C) è più iintenso è più intenso dello ione A.
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12
pattern isotopici
Cl
2 Cl
3 Cl
Br
2 Br
3 Br
4 Br
Cl+2Br
Cl+3Br
2Cl+Br
Cl+Br
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4 Cl
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Picchi isotopici
Esempio:
(a + b)n = an + nan-1b + [n(n-1)/2!]an-2b2 + …
per 35Cl e 37Cl a = 1 e b=0.32. Se una molecola ha n = 2 atomi di cloro la probablilità delle combinazioni
35Cl35Cl, 35Cl37Cl(37Cl35Cl) e 37Cl37Cl è, rispettivamente, 1x1, 2(1x0.32), 0.32x0.32, quindi le abbondanze
relative sono: 1 : 0.64 : 0.10.
(a + b)2 = a2 + 2ab + b2 = 12 + 2x1x0.32 + 0.322 = 1:0.64:0.10
•Esempio:
(a+b)n(c+d)m
CCl2Br2: 0.51 x (1: 0.64 : 0.10) = 0.51, 0.32, 0.051, -----, -----,
1.0 x (1 : 0.64 : 0.10)
=
0.49 x (1 : 0.64 : 0.10) =
intensità relative per M, M+2, M+4, M+6, M+8
------, 1.00, 0,64, 0,10, -----,
------, -----, 0.49, 0.31, 0.049
0.38, 1, 0.89, 0.32, 0.04.
•Esempio: A + 1
per il nitrobenzene C6H5NO2, l’intensità relativa di A+1 rispettto A è:
15N
6 x 1.08% = 6.48 %
1 x 0.37% = 0.37 %
2H
17O
5 x 0.015% = 0.07 %
2 x 0.04% = 0.08 %
totale: 7.0%.
13C
Esempio. A+2
Esempi: abbondanza di A+2 rispetto A (100%) per Si e S:
Si1 3.4 % Si2 7.1 % Si3 11%
S1 4.4 % S2 8.8 % Si3 13%
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14
Per composti con peso molecolare < 1000 (relativamente basso: LMW) la risoluzione è
sufficiente per separare ioni che differiscono solo per la composizione isotopica
Esempio ione monoisotopico dallo ione satellite che contiene un 13C.
La richiesta di risoluzione aumenta all’aumentare del peso molecolare, e per composti
a peso molecolare elevato (HMW) i picchi isotopici potrebbero non essere separati.
Esempio:
C35H48N8O11S
C284H432N84O79S7
aprotina
ione monoisotopico
satellite 13C
Risoluzione
788.3152 Da
789.3186 Da
786
ione monoisotopico
satellite 13C
Risoluzione
6507.0318 Da
6508.0352 Da
6485
La risoluzione richiesta per separare ioni molecolari non è influenzata dal numero di cariche
sulle ione:
[C284H432N84O79S7]7+
aprotina
ione monoisotopico
satellite 13C
Risoluzione
929.5760 Da
929.7193 Da
6487
Per uno ione con 10 cariche la separazione di massa apparente fra
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12C
e 13C è di 0.1 Da.
15
OE ioni a elettroni dispari (contengono un elettrone spaiato)
EE ioni a elettroni pari (tutti gli elettroni sono appaiati).
Gli EE sono più stabili degli OE .
Numero di anelli e insaturazioni:
Numero totale di anelli e doppi legami per uno ione (C, Si, …)x(H, F, Cl,..)y(N, P,…)z(O, S,…)n
n = x - ½ y + ½ z +1
Per ioni a numero pari di elettroni, n può essere seguito da “ .5”.
Esempio: ione benzoile C6H5-CO+: N = 7 - 2.5 = 5.5. (N = 5  4 doppi legami + 1 ciclo).
Regola dell’azoto:
se il peso molecolare di un composto è un numero dispari, la molecola contiene un numero dispari di
atomi di azoto.
Per molecole contenenti C, H, O, N, S, P, Si, As, alogeni, metalli alcalini. Infatti, fra questi elementi solo N
ha massa pari e valenza dispari, gli altri hanno sia massa che valenza entrambe pari o dispari.
Parità di massa/parità di carica:
uno ione che contiene 0, 2 , 4,… atomi di azoto è a numero dispari di elettroni (radicalcatione OE•+ o
radicalanione) se ha massa pari, e a numero pari di elettroni (es.EE+) se ha massa dispari.
La scarsità di picchi importanti a massa pari, soprattutto nella parte a masse basse dello spettro, indica
che lo ione molecolare ha massa pari. L’opposto non è sempre vero (l’abbondanza di ioni pari non indica
necessariamente uno ione molecolare di massa dispari).
Picchi intensi di OE sono meno probabili di EE sopratutto alle masse inferiori. Le serie omologhe (es.
M/z 57, 71, 85 degli alcani), sono tipiche di ioni EE.
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16
TIPI DI IONI
IONI (PSEUDO) MOLECOLARI.
Forniscono un’informazione importante: il peso molecolare dell’analita.
Lo ione molecolare si genera dalla molecola di analita per perdita o acquista di uno o più elettroni. Per
definizione è il monoisotopico. In ionizzazione elettronica (EI) è un OE  (ione radicalico M , oppure M- ).
Potrebbe essere molto instabile e frammentarsi prima di arrivare al rivelatore.
Lo ione pseudomolecolare è formato dalla molecola analita per perdita di un protone o uno ione idruro, o per
associazione con uno ione stabile.(formazione di un addotto) Nelle tecniche di ionizzazione soft è uno ione
EE relativamente stabile; frammentandosi poco può aumentare la sensibilità della tecnica. Un esempio tipico è
la molecola protonata MH+ (nota: non è lo ione molecolare protonato).
Esempio:
ionizzazione chimica con CH4:
MH+ MC2H5+ MC3H5+
ionizzazione elettrospray ESI :
ioni positivi MH+ MNa+ MNH4+ MK+ ; ioni negativi (M-H)-.
Nella tecnica ESI si possono avere ioni multicarica: MH55+
MH66+ ….
FRAMMENTAZIONE.
Gli ioni che si ottengono dalla frammentazione di ioni precursori (es. ione molecolare) forniscono
informazioni sulla struttura dell’analita, utili per l’analisi qualitativa (riconoscimento). La loro produzione può
essere importante nell’analisi quantitativa (specificità, riduzione S/N; es. tandem MS).
OE produce un EE per rottura di un legame, un OE per rottura di due legami (riarrangiamento, frammentazione
anello). Generalmente gi EE producono solo EE .
OE  EE + OE
OE  OE + EEo
EE  EE + EE°
EE  OE + OE
poco probabile (formazione di due siti radicalici).
Lo ione si frammenta per l’elevata energia interna acquistata nelle condizioni di ionizzazione hard (es.
EI).Lo ione viene indotto a frammentarsi per collisioni con altre molecole (es. tecniche tandem MS).
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17
Formazione degli ioni.
EI
Metodi di ionizzazione in GC
ionizzazione elettronica
+ 4930V
Elettrodi di accelerazione (5000 V)
focalizzazione
filamento
Selettore
ionico
All’analizzatore
fenditura
0V
+ 4100V
+ 5030V
+ 5010V
anodo di scarica
T = 200°C
P = 10-5 torr
E’ una tecnica di ionizzazione hard. Gli elettroni sono emessi da un filamento riscaldato, vengono accelerati da un
potenziale che è di 70V nella camera di ionizzazione. L’elettrone e¯ interagisce con la molecola M ionizzandola:
M + e¯ M + 2 e¯ (elettroni secondari)
M è lo ione molecolare. La frazione di molecole ionizzate è ca. 1:105. La ionizzazione è un processo veloce: 10 -16 s.
L’energia di ionizzazione adiabatica (minima, ai livelli vibrazionali zero di M e M ) è tipicamente intorno ai 10 eV
per molecole organiche (per atomi : 25 eV per He, 3.9 eV per Cs). Gli e¯ hanno una distribuzione gaussiana di energie
cinetiche attorno ad un massimo di 70 eV.
Energie di ionizzazione di alcune molecole (IE in eV):
CH3-CH3
CH2=CH2
EtOH
EtNH2
11.5
10.5
10.5
8.9
NH3
PH3
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10.2
9.9
Et2O
Et2S
Et2Se
9.5
8.4
8.3
18
CI
ionizzazione chimica
Vantaggi. La CI (chemical ionisation) è una tecnica di ionizzazione soft, utile per conoscere il
peso molecolare, e per introdurre sensibilità e specificità.
Composti con una elevata affinità protonica PA (ammine) possono essere rivelati dall’analisi
di ioni positivi prodotti per protonazione (PCI, positive chemical ionisation).
Composti con un’elevata affinità elettronica EA (nitro, ciano, alogeni) possono essere
determinati per cattura elettronica (NCI, negative chemical ionisation).
Difficoltà. Lo spettro di massa in CI dipende molto dalle condizioni di ionizzazione in cui si
lavora. Fattori importanti sono: T e P, tuning dei vari parametri strumentali, purezza del gas
reagente (es. Impurità contenenti ossigeno disturabano notevolmente la NCI in EC), ecc. Data
la bassa riproducibilità nelle abbondanze relative dei vari ioni, non esistono librerie di spettri
CIMS per l’identificazione dei composti.
L’affinità protonica (PA) misura la tendenza della specie M ad addizionare un protone (basicità di M in
fase gassosa). E’ il negativo del termine entalpico della reazione:
M + H+ = (M+H)+
PA (M) = - [DHf (M) + DHf(H+) - DHf(M + H)+]
Quanto più PA è grande tanto più la reazione di protonazione è favorita.
Valori tipici per composti organici: PA = 550 - 1000 kJ/mol.
L’affinità elettronica (AE) misura la tendenza di una specie M ad acquistare un elettrone trasformandosi
in un anione:
M + e–  X–
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19
PCI
La ionizzazione è causata da reazioni ione-molecola
Un gas reagente R viene introdotto nella sorgente ionica a pressioni relativamente alte (0.5-10 torr).
Poiché R è in forte eccesso rispetto al campione (104:1), si ha ionizzazione della specie R per
ionizzazione elettronica (EI):
R + e–  R+° + 2e–
Si utilizzano elettroni ad elevata energia (500 eV) per aumentare le penetrazione e rendere più efficace la
ionizzazione
R+° reagisce con altre molecole R per formare specie ioniche reattive (ioni reagenti):
R + R+°  RH+ + (R -H)°
R + R+°  RH° + (R -H)+
Gli ioni reagenti reagiscono con le molecole di campione M:
Reazione
1) trasferimento protonico:
2) estrazione di idruro:
3) formazione addotti
4) trasferimento di carica:
%
controllata da
M+

+R
M + (R -H)+  (M-H)+ + R
M + RH+  MRH+
M + R +°  M +° + R
RH+
70
MH+
%
EI
CI
PA (favorita se PA(M)>PA(RH+)
energia di ionizzazione IE
MH+
116
Spettri di massa EI e CI
della prolina
PM = 115
70
98
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
m/z
m/z
20
Esempio: gas reagente metano.
Formazione ioni primari:
Reazione con l’analita
M + CH5+  (M-H)+ + CH4 + H2
CH4 + e–  CH4+° + 2 e–
CH4+°  CH3+ + H°
M + CH5+  MH+ + CH4
Formazione ioni reagenti:
M + C2H5+  MH+ + C2H4
CH4+° + CH4  CH5+ + CH3°
M + C2H5+  (M-H)+ + C2H6
CH3+ + CH4  C2H5+ + H2
M + C2H5+  MC2H5+
se P elevata si forma anche C3H5+
M + C3H5+ MC3H5+
Gas reagenti. Come sceglierli
gas reagente
CH4
H2O
MeOH
iso-C4H10
NH3
ione reagente
CH5 +
H3 O+
MeOH+
(CH3)3C+
NH4 +
PA
5.7
7.2
7.9
8.5
9.0
L’energia interna delle specie M ionizzate
dipende dal reagente scelto.
Se PA (M) > PA(R) la formazione di MH+ è
favorita, ma se PA(M)>>PA(R) MH+ può
avere
elevata
energia
interna
e
frammentarsi.
L’energia interna delle specie M ionizzate (e quindi la possibilità di frammentazione)
dipende dal reagente scelto e dalla T e P della camera di ionizzazione.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
21
NCI
Per molti strumenti MS, basta cambiare le polarità per passare dalla rivelazione degli ioni positivi a
quella degli ioni negativi. Esistono due processi principali per formare ioni negativi
cattura elettronica
MX + e–  MX–
estrazione di protone. B¯ + M  BH + [M - H]¯ agisce come acido di Bronsted cedendo un protone ad uno ione reagente
Cattura elettronica (electron capture mass spectrometry, ECMS):
Formazione di uno ione negativo per cattura di un elettrone a bassa energia (~ 0 eV) da parte del LUMO di
un elettroforo MX.
Un gas moderatore (es.metano, azoto a 1 torr) è bombardato con elettroni ad elevata energia ( es. 100 eV)
prodotti da un filamento allo scopo di produrre elettroni secondari e ‘raffreddarli’ attraverso collisioni
anelastiche. Il gas tampone stabilizza gli ioni negativi limitando la dissociazione.
La cattura elettronica può essere:
non-dissociativa:
MX + e–  MX–
dissociativa:
MX + e–  M + X–
La struttura molecolare e la T determinano il meccanismo predominante. Il processo non-dissociativo
fornisce informazioni sul peso molecolare, e spesso è quello che si vuol favorire.
La NCI è molto più sensibile della EI o PCI per certi analiti, anche perchè la velocità di cattura elettronica è
molto maggiore di quella della reazione ione-molecola (gli elettroni hanno elevata mobilità). Però il processo
è efficace per molecole con elevata affinità elettronica, EA, come composti organoalogenati. Un elettroforo
contiene elementi elettronegatvi (F, Cl elevata EA) o sistemi coniugati (carotenoidi, orbitale vuoto a bassa
energia).
Selettività : pochi composti sono forti elettrofori (es. PCB, toxafeni).
Sensibilità : elevata efficienza di cattura, formazione di un anione dominante.
Derivatizzazione: per composti che non sono elettrofori: bromuro pentafluorobenzile. La diminuzione della
selettività può richiedere HRMS, MS/MS.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
22
Metodi di ionizzazione in HPLC.
Problema interfacciamento HPLC che opera con fasi liquide a pressione P atmosferica e flussi tipici di 1
mL/min con MS che opera in fase gassosa a P basse.
Tecniche di ionizzazione a pressione atmosferica (API)
Con i moderni HPLC-MS la Ionizzazione avviene a P atmosferica direttamente dalla soluzione all’interno
dell’interfaccia. Lo spettrometro di massa è utilizzato per separare gli ioni e rilevarli.
In generale, la ionizzazione dell’analita prevede i seguenti processi:
 formazione di goccioline dall’eluato HPLC.
 formazione di cariche sulle goccioline.
 eliminazione del solvente (desolvatazione).
 formazione di ioni dall’analita.
Principali metodi di interfacciamento/ionizzazione in HPLC:
elettrospray ESI
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ionizzazione chimica a pressione atmosferica APCI
fotoinonizzazione a pressione atmosferica APPI
23
L’interfaccia electrospray (ESI)
ESI
P atmosferica ---- ---------vuoto crescente ----- alto vuoto
Capillare
ad elevato
voltaggio
Drying gas
(N2 riscaldato)
Nozzle Skimmer
analizzatore
Elettrodo
cilindrico
eluato HPLC
Spray
elettrostatico
contro
elettrodo
Componenti:
Capillare, ago metallico ad elevato voltaggio da cui esce la soluzione che viene spruzzata in un intenso
campo elettrico Campi di 2-6 kV per ioni positivi; minori e a polarità inversa per ioni negativi.
Le gocce elettricamente cariche sono dirette verso un contro-elettrodo che le attrae.
Flusso di gas inerte caldo per favorire l’evaporazione del solvente (desolvatazione).
Ottica ionica: campi elettrici che focalizzano il raggio ionico verso l’analizzatore.
I principali vantaggi dell’ESI:
E’ una tecnica di ionizzazione soft che permette l’analisi di composti termolabili e molto polari.
Genera ioni multicarica. Si formano addotti con più protoni o ioni sodio (M + nH)n+ (M + nNa)n+
Composti ad elevato peso molecolare (HMW) formano macroioni molecolari multicarica che possono
essere così rilevati con analizzatori MS che hanno limiti di massa minori della massa molecolare
dell’analita.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
24
ESI
Meccanismo di ionizzazione
+ +-+
++-++
+- +++ +
N2
+ +
+ +
+
N2
+
+
+
+
+
+
MS
+
+
+
 Nebulizzazione e ionizzazione all’uscita dell’ago. Formazione di goccioline (ca. 1 um)
che vengono caricate elettricamente per azione del forte campo elettrico (5-10 kV cm-1).
 Desolvatazione ad opera del drying gas. Il solvente nelle goccioline evapora.
 Coulombic explosion. Dopo circa 100 us le dimensioni delle gocce sono ridotte al punto
che le forze elettrostatiche di repulsione vincono le forze coesive della tensione
superficiale. Le gocce esplodono producendo goccioline più piccole ( circa 10% del
diametro iniziale).
 Ionizzazione dell’analita. I processi di desolvatazione e “collasso” delle goccioline
continuano fino a che si formano ioni dell’analita in fase gassosa che vengono convogliati
nell’analizzatore MS. Ci sono diverse ipotesi sul meccanismo di ionizzazione dell’analita:
ion evaporation : se la goccia è sufficientemente piccola l’analita evapora in forma
ionizzata<dalla goccia;
charge-residue model: le successive esplosioni coulombiche generano gocce contenenti
alla fine un solo ione; lo ione è trasferito nella fase gassosa a causa dell’evaporazione del
solvente.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
25
Composti analizzabili in ESI:
ESI
 Analiti che sono già in forma ionica in soluzione (es. acidi, basi).
 Composti neutri/polari che possono essere ionizzati per protonazione (M+H)+ e deprotonazione (M-H)-.
 composti non-polari che possono essere ossidati (ioni positivi) o ridotti (ioni negativi) nella punta del
capillare.
Spettro di massa ESI di un composto HMW. Formazione di ioni multicarica.
773
fra due picchi consecutivi la
carica cambia di un unità
Spettro ESI del citocromo c
M = 12 360 Da
687
Possono formarsi ioni per
aggiunta di protoni:
esempio (M+5H)5+
884
di ioni sodio
esempio (M+5Na)5+
700
m/z
800
900
Determinazione del peso molecolare.
dati sperimentali : (m/z)1 dello ione 1, (m/z)2 dello ione 2, …; incognita: peso molecolare M dell’analita;
si assume che la carica dello ione 1 sia dovuta all’addizione di n1 protoni, dello ione 2 con n2 protoni, ecc.
Per ioni consecutivi n2 = 1 + n1, ecc.
M può essere calcolato per ogni coppia di ioni 1, 2, … del cluster di ioni molecolari di carica z1 = n1, z2 = n2,
ecc. utilizzando le equazioni (esemplificate per la copppia di ioni 1 e 2):
(m/z)1 = (M + n1(massa protone)) / n1 = (M + n1) / n1
(m/z)2 = (M + n2) / n2
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
26
APCI
atmospheric pressure chemical ionisation
Metodi di ionizzazione in HPLC.
 la fase liquida che esce dalla colonna HPLC è dispersa in piccole gocioline per azione del
calore e di un gas nebulizzante.
 Lo spray è desolvatato e fatto passare in una regione calda dove viene vaporizzato.
 Le specie neutre passano in una regione dove si ha una scarica a corona (corona
discharge) che ionizza il gas. Per interazione degli elettroni con le specie principali si ha
formazione di ioni reagenti. Nella modalità di ioni positivi sono in genere le molecole di
solvente protonato (in quella negativa, ioni O2-).
 Gli ioni reagenti ionizzano le molecole di analita in modo simile alla ionizzazione chimica
convenzionale attraverso reazioni ione-molecola.
Tipi di ioni:
è una tecnica di ionizzazione soft. Si formano ioni molecolari con bassa energia, che hanno una scarsa
tendenza a frammentarsi. Es.
modalità ioni positivi
modalità ioni negativi
(M + H)+ , (M + NH4)+
(M - H)(M + CH3COO)I componenti dell’interfaccia sono simili a quelli dell’ESI; in alcuni HPLC-MS le due tecniche sono
interscambiabili.
Il meccansimo di ionizzazione è diverso da quello dell’ESI, per cui le due tecniche sono complementari.
L’APCI è un processo di ionizzazione in fase gassosa, applicabile a molecole volatili e poco polari.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
27
ESI
APCI
 forma macroioni multi-carica; adatta per analisi
composti HMW (proteine, polimeri). Misure
indipendenti di peso molecolare da un singolo spettro
 adatta per analisi composti polari e già ionizzati in
soluzione (la ionizzazione si ha direttamente dalla
soluzione).
 tecnica molto soft; adatta per analisi composti
termolabili.
 Lo ione si forma direttamente nella fase mobile; il
risultato dipende molto dalle condizioni sperimentali.
 Con opportuni sistemi per diminuire il flusso
dell’HPLC convenzionale; possibilità di operareda
nL/min a ml/L.
 non forma ioni multicarica; non adatta per
compostii HMW (limite di massa tipico 2000 Da).
 adatta per analisi composti volatili (LMW) e poco
polari. Meno adatta per composti già ionizzati in
soluzione.
 E’ una tecnica soft, ma richiede condizioni più
drastiche dell’ESI. Composti termolabili non sempre
analizzabili.
 ionizzazione simile alla CI convenzionale in fase
gassosa; meno sensibile alle condizioni sperimentali
e composizione fase mbile (tampone,
 Abbinamento diretto ai flussi tipici HPLC (1-2
mL/min).
 Tecniche soft. Produzione di ioni molecolari; spesso non informativi da punto di vista strutturale
(analisi qualitativa); analisi dei frammenti ionici (indotta per collisione con molecole di gas oppure
dissociazione nel sistema di ionizzazione
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
28
analizzatori di massa
QUADRUPOLO
Q quadrupolo lineare
Gli ioni sono separati in base al rapporto m/z sfruttando la stabilità delle loro traiettorie in
campi elettrici oscillanti.
focalizzazione
fascio ionico
- F
gli ioni con un determinato m/z
attraversano il quadrupolo
formazione
ioni
gli ioni sono
rilevati
campo oscillante Vcoswt
campo costante U
Alle aste viene applicato un potenziale totale F dato dalla
somma di un potenziale diretto U (non oscillante, DC) e un
potenziale oscillante alla frequenza n (frequenza angolare
w=2pn) di ampiezza V. F = U + V coswt.
Tipicamente U=5002000volt; V =-3000  +3000; n
campo radiofrequenze (RF)
Le
traiettorie
degli
ioni
(soluzioni
dell’equazione di Mathieu) sono stabili (e
gli ioni arrivano al rivelatore) se i valori di
x e y rimangono < ro; altrimenti gli ioni si
scaricano contro le aste.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
 F
2r°
y
z
x
29
Per un dato quadrupolo ro e w sono costanti. Le variabili sono U e V. Per determinate coppie
di valori U, V gli ioni con dato m/z hanno traiettorie stabili e sono rivelati. Aumentando U e
V, e mantenendo il rapporto U/V costante, i vari ioni vengono rivelati in successione al
crescere di m/z; si effettua così una scansione (scan).
Diagramma di stabilità per ioni
con masse m1 < m2 < m3 (z =1).
U
m2
m1
m3
triangolo di
stabilità di
m3
V1
Es. Per V > V1 gli ioni con m<m1 sono instabili
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
U è variato linearmente in funzione di V,
gli ioni m1 < m2 < m3 sono rivelati in
successione.
V
Per U=O (quadrupolo con solo RF) la
risoluzione è zero. Il valore di V
determina il valore minimo di m che
deve avere lo ione per essere
rivelato.
Hoffmann & Stroobant, Mass Spectrometry, 2002
Hubschmann, Handbook of GC/MS, 2001
30
Q
Caratteristiche tipiche di un analizzatore a quadrupolo:
 Limite di massa < 4000 Th
 Risoluzione bassa (‘unitaria’, picchi separati se differiscono di almeno un’unità di
massa)
La risoluzione è ~ 3000 (oltre 3000 u i cluster isotopici non sono risolti; R aumenta
aumentando L).
Il potere risolutore è variabile lungo l’intervallo di massa (Dm costante); (scansione a
velocità uniforme).
 Elevata sensibilità. Non richiede focalizzazione del raggio ionico all’ingresso.
 Elevata velocità di scansione; può superare i 1000Th/s; adatto per
accoppiamento con GC.
 Analizza anche ioni negativi (indipendente dalla polarità).
Altre caratteristiche:
L’analisi non dipende dall’energia cinetica degli ioni che entrano nell’analizzatore (il
tempo per attraversare il Q deve essere però breve rispetto alla scansione da una
massa all’altra e abbastanza lungo da permettere alcune oscillazioni, per cui l’energia
cinetica deve essere dell’ordine di 100-102 eV).
 Gli ioni possono essere focalizzati al centro delle barre.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Hoffmann & Stroobant, Mass Spectrometry, 2002
31
TRAPPOLA IONICA - IT
IT
La IT può essere immaginata come un quadrupolo piegato su se stesso a formare un anello
chiuso: l’asta interna svanisce in un punto, l’asta esterna diventa un elettrodo circolare, l’asta
inferiore e superiore due elettrodi a calotta.
Il potenziale Fo è dato da un potenziale diretto DC U, e da un potenziale
alternato RF, V: Fo = U + V coswt.
Gli ioni sono tutti intrappolati da questo potenziale all’interno della sorgente in traiettorie
stabili chiuse (orbite); nella trappola è presente He (10-3Torr) per far diminuire l’energia
cinetica degli ioni tramite collisioni e concentrare gli ioni al centro della trappola, processo
controbilanciato dalla repulsione elettrostatica.
sezione trasversale della IT
calotta
superiore
elettrodo
ad anello
calotta
inferiore
filamento
z0
r0
uscita
ioni
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
elettromoltiplicatore
Le traiettorie stabili sono quelle
che non superano i confini della
trappola: r < ro, z < zo. La
geometria della IT
(ro,zo)èdefinita; fissata la
frequenza n = 2pw, si opera a U=0,
e si imposta V in modo da
intrappolare tutti gli ioni che
interessano.
Aumentando V, gli ioni a valori di
m/z
crescenti
raggiungono
il
limite di stabilità superato il
quale vengono espulsi in sequenza
lungo la direzione z; il 50% esce
dalla
calotta
inferiore
e
colpiscono il rivelatore.
32
B
ANALIZZATORE A SETTORE MAGNETICO
regione di accelerazione.
Gradiente di potenziale V.
Il campo magnetico agisce  alla
direzione del moto; lo ione è
deflesso in una traiettoria circolare
Forza magnetica  F. centripeta
= F.centrifuga
zevB = mv2 / r
settore magnetico
r = mv2 / zeB
ioni
sorgente
ionica (EI)
All’uscita
della
regione
di
accelerazione uno ione di massa m e
carica z ha un’ energia cinetica :
rivelatore
zeV = ½ mv2
solo gli ioni con un determinato m/z hanno
una curvatura r corrispondente a quella del
settore magnetico.
Variando l’intensità del campo elettrico V o
magnetico B si misurano ioni con diverso
m/z.
m/z = B2r2e / 2V
Limiti alla risoluzione. Cause :
v + vi
a
divergenza angolare del fascio ionico
le traiettorie tendono a essere perpendicolari alle linee di campo
equipotenziali (FOCALIZZAZIONE) ma c’è una certa
divergenza de fascio ionico (a).
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
aberrazione energetica :
v = (2zeV/m)1/2 ± Dv
Formazione di ioni con velocità vi differenti in modulo e
direzione (distribuzione di Boltzmann delle energie termiche dei
precursori degli ioni, disomogeneità di campo).
33
HRMS (high resolution mass spectrometry)
Spettrometri a doppia focalizzazione
Guadagno di risoluzione incorporando due analizzatori: a campo elettrostatico e campo magnetico.
La HRMS permette la determinazione delle masse esatte (composizione elementare) e la separazione di ioni
isobari, ma è una strumentazione molto costosa.
divergenza angolare fascio ionico  focalizzazione della direzione operata
dall’analizzatore magnetico
dispersione energetica degli ioni  focalizzazione delle velocità operata analizzatore
eletrostatico
Analizzatore
magnetico
Analizzatore elettrostatico
(ESA)
Campo radiale V’
+
–
piano focale della direzione
piano focale della energia
zeV’ = mv2 / r
zeV = 1/2 mv2/r
regione di accelerazione
sorgente ionica
L’ESA uniforma le energie traslazionali compensando
differenze nelle velocità iniziali. Ioni con troppa (poca)
energia colpisono il polo positivo (negativo)
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
punto
di
doppia
focalizzazione
(fenditura
d’uscita,
rivelatore)
F.elettrica  F.centripeta =F.centrifuga
zeV’ = mv2/r
r = mv2 / zeV’ = 2V /V’
34
FULL SCAN
Tecniche combinate. GC-MS HPLC-MS
METODI DI ACQUISIZIONE
Registrazione di tutti gli ioni di un determinato intervallo di massa (es. da m1 = 50 a m2 = 500 per
monopositivi). Fornisce lo spettro di massa utile per l’identificazione (analisi qualitativa)
La sensibilità può non essere sufficiente per l’analisi in tracce. La sensibilità diminuisce al diminuire del
dwell time, Dt degli ioni.
Nel Q gli ioni con un determinato m/z sono
registrati per un tempo breve (ca. 1 ms)
durante la scansione.
Es.
Dt = scan time/mass range =
= 500 ms/(550-50)u = 1 ms/u
m(u)
m2
m1
scan time
t(ms)
m(u)
SELECTED ION MONITORING SIM
Nel Q il tempo della scansione viene utilizzato per
misurare solo alcuni ioni con determinati m/z.Non si
ottiene lo spettro di massa totale, ma aumenta la
sensibilità, perché aumenta il Dt.Es. 3 ioni analizzati,
total scan time 500 ms  Dt ~ 550/3 = 166 ms per ione
m3
m1
m2
t(ms)
scan time
Il guadagno in sensibilità è proporzionale al tempo speso dallo strumento sullo ione nell’analisi in
SIM rispetto a quella in TIC. Es.: nell’analisi in TIC un intervallo di 500u viene registrato in 2 sec,
tempo speso sullo ione 2/500 = 4 ms; guadagno in sensibilità nell’analisi in SIM (sempre 2 s
utilizzati per la rivelazione) di (2000 ms/4 ms=) 500 volte.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
35
TOTAL ION CHROMATOGRAM - TIC
Somma delle correnti ioniche di tutti gli ioni dello spettro di massa per ogni scansione
spettrale. E’ un diagramma corrente ionica totale vs. numero di scansione (tempo).
L’intensità dipende dall’ampiezza dell’intervallo di scansione.
MASS CHROMATOGRAM - MC
È un estratto dei dati ottenuti dall’analisi in TIC, in cui vengono riportate solo le intensità di
ioni selezionati in funzione del numero di scansioni (tempo d’analisi).
Aumenta la selettività rispetto al TIC (elimina ioni interferenti) e aumenta S/N.
E’ quindi adatta all’analisi quantitativa ed è sempre possibile l’identificazione dei composti
dallo spettro di massa totale.
MCounts
TIC
10
152
5
40 kCounts
acenaftilene
20
MC a
m/z 152
0
50
76
126
13
14
15
16
17
18
minuti
m/z
Esempio: analisi GC-MS estratti di sedimento.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
36
Scelta degli ioni
 specifici dell’analita.
 tra i più abbondanti dello spettro di massa
 in genere quelli di massa più elevata (> 200Th) che danno S/N migliori (la probabilità che i
composti presenti in una miscela producano ioni caratteristici con lo stesso m/z diminuisce
all’aumentare di m/z)
 verificare l’assenza di ioni interferenti nel campione
 in genere si scelgono tre-quattro ioni per confermare l’identità, e uno ione per l’analisi
quantitativa.
Criteri per l’identificazione in SIM (descriptors). Esempio:
 corrispondenza esatta di tre ioni caratteristici
 ai tempi di ritenzione dello standard
 con le corrette abbondanze relative (entro un certo intervallo di incertezza; es. 
10% EI,  20% CI.
 S/N del picco almeno > 3.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
37
scelta degli ioni in SIM
chlorambucil
triazolam
methamphetamine
254
313
238
315
58
342
344
279
118
230
303
91
134
triazolam : gli ioni a m/z 342 e 313 sono ioni a masse relativamente alte e abbondanti. Lo ione a m/z 313 è
preferito rispetto al 344 perché la perdita di - 29 u (342  313) è più significativa dello ione M+2, prodotto da
ogni ione che contiene cloro. Gli ioni a m/z 344 o 315 possono essere scelti per la conferma; se dovesse
esserci un fondo elevato in queste zone di m/z, rimane sempre la possibilità di scelta dello ione a m/z 238.
chlorambucil : lo ione a m/z 254 è sicuramente scelto per l’analisi quantitativa. Più problematica la scela
degli ioni per la conferma. Lo ione 303 è a valori di m/z relativamente alti, ma è poco intenso, per cui la
sua scelta può essere problematica a basse concentrazioni di analita. In alternativa si può scegliere lo
ione M+2 come specificità della presenza di cloro.
methamphetamine : scelta problematica. Lo ione a m/z 58 va bene per l’analisi quantitativa, ma è uno
ione a masse basse poco specifico (tipico delle ammine), per cui la scelta di uno ione per la conferma è
cruciale. Il secondo ione più abbondante a m/z 91 è poco specifico (comune a composti contenenti il
gruppo benzilico). Lo ione ai valori più alti di m/z (134) è poco intenso, e comunque cade sempre in una
zona di m/z bassi dove l’interferenza dovuta al fondo può essere significativa. Considerare tecniche di
ionizzazione soft per fornire maggiore specificità attraverso la formazione dello ione molecolare a valori
m/z più alti.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
B.Ardrey LC-MS. An introduction, 2003
38
Esempio: analisi eptaclorodibenzo-p-diossine in scarichi municipali.
Identità molecolare
formula bruta C12HO2Cl7
peso molecolare (massa monoisotopica : 422 Da
isomeri
Cl
Cl
Cl
Cl
O
Cl
Cl
O
Cl
Cl
Cl
O
Cl
O
Cl
Cl
Cl
Cl
Spettro di massa
es. isotope distribution
calculator
(www.sisweb.com)
424
banche-MS, siti web (NIST), letteratura, …
426
calcola abbondanze
relative cluster ioni
molecolari inserendo la
formula bruta
428
422
Analisi soluzione standard:
430
432
434
m/z
GC tempi di ritenzione;
MS scelta degli ioni:
ioni selezionati m/z 422, 424 e 426
misurazione abbondanze relative :
44 / 100 / 97.
Analisi campione SIM a m/z 422, 424, 426.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
39
RISULTATI
Analisi campione SIM a m/z 422, 424, 426.
B
31428
Analisi eptaclorodibenzo-p-diossina
D
36605
m/z 422
86598
F
96785
28818
m/z 424
85983
97067
m/z 426
time
cromatogramma su tre caratteristici ioni dell’eptaclorodibenzofiossina nell’analisi GC-MS SIM degli
estratti. Tratta da FW Karasek, RE Clement, Basic GC-MS, 1988
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
40
Analisi eptaclorodibenzo-p-diossina
Analisi qualitativa:
Picchi B,D confermati:
presenti gli ioni caratteristici a m/z 422, 424, 426.
con rapporti delle aree che rispettano abbondanze relative (entro errore tipico
10-20%):
31400 / 86600 / 86000 = 36 / 100 / 99; 36600 / 96800 / 97000 = 38 /100 / 98
Confermati i tempi di ritenzione determinati dall’analisi dello standard.
picco F scartato  mancano gli ioni a m/z 422 3 426. Assente nello standard.
Analisi quantitativa:
Metodo standard esterno. Single point calibration. (Curva di calibrazione fornirebbe
migliore accuratezza, ma non effettuata per diminuire tempi di analisi).
Analisi soluzione standard di un isomero. Ione selezionato m/z 424 (più
abbondante): area 6400 per 100 pg iniettati. Fattore di risposta = 64 counts/pg.
Risultato: 1.4 ng B, e 1.5 ng D.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
41
Esempio: analisi “diossina” (2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-diossina)
322
2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-diossina
Cl
O
Cl
Cl
O
Cl
320
324
257
194
161
74 97
285
229
100
200
326
300
m/z
potenziale interferenza da eptacloro bifenile
C12H4O2Cl4
Massa media : 321.975 Da; massa nominale : 320 Da
massa monoisotopica 12C121H416O235Cl4: 319.896 Da
ione più abbondante 12C121H416O235Cl337Cl: 321.8934
Da
Possibile scelta degli ioni per
l’analisi in SIM: m/z 320, 322, 324.
Analisi quantitativa effettuata sullo
ione 322 Th.
Rapporto delle aree dei picchi deve
corrispondere
alle
abbondanze
relative degli ioni nello spettro di
massa
(320:322:324
=
400
78:100:48).
394
Cl7
Interferenza da eptacloro bifenili (MW 392) in caso di
coeluizione.
324
162
127
100
254
197
200
La scelta dello ione a 322 potrebbe portare ad un falso
positivo, e il monitoraggio di un altro ione di conferma
(es.320) ad un falso negativo (rapporto 320:322 errati).
322
290
359
300
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
400
m/z
L’uso della HRMS con una risoluzione > 12,500
permette di distinguere la diossina dall’eptaclorobifenile
(321.8678 u).
42
TANDEM MS - MS/MS - MSn
La MS/MS consiste in almeno due stadi di analisi MS combinati con un processo di
dissociazione o reazione chimica che determina una variazione di m/z dello ione.
Il primo analizzatore isola lo ione precursore (precursor, parent ion, lo ione che poi subisce
un processo) che subisce una reazione formando uno ione prodotto (product, daughter ion)
analizzato dal secondo strumento. La reazione è in genere una frammentazione, e lo ione
prodotto è uno ione frammento dello ione precursore.
Mp+  Mf+ + N
ione precursore  ione prodotto + frammento neutro
Esistono diverse configurazioni con analizzatori a settore magnetico B, elettrostatico E, e a quadrupolo Q.
Nella figura la configurazione più comune: QQQ (QqQ) triplo quadrupolo. Il primo Q agisce da filtro di
massa, il secondo q è una camera di collisione dove avviene la frammentazione degli ioni per collisione
con un gas inerte, il terzo Q come filtro di massa degli ioni prodotti.
tandem in space
focalizzazione
ionizzazione
analisi m/z
dissociazione
analisi m/z
rilevazione
camera di
collisione
ion
source
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Q-1
Q-2
Q -3
elettromoltiplicatore
43
tandem MS
sorgente ionica
Q-1
cella di collisione
ione precursore
Q-3
ione prodotto
Nella configurazione QqQ, il secondo quadrupolo non agisce come filtro di massa. Tutti gli
ioni trasmessi dal primo Q e i suoi frammenti formati per collisione con il gas inerte arrivano al
secondo Q.
CAD (CID)
:
COLLISION ACTIVATED (o -INDUCED) DECOMPOSITION
La MS/MS richiede la frammentazione degli ioni precursori selezionati dal primo
analizzatore.
La frammentazione avviene tramite collisione con atomi/molecole di un gas inerte. Nella
collisione l’energia cinetica dello ione (B: > 1 KeV, Q:10-100 eV, IT < 6eV) è trasformata in
energia interna dello ione
Il valore massimo di energia interna Ei che può essere assorbita da uno ione di energia cinetica Ec e di
massa Mi che urta una particella di gas (target) di massa Mt è dato da:
Ei = (Mt/Mi + Mt)Ec
Esempio Ei = 2.9 eV per uno ione di 100u con Ec = 10eV che collide un atomo di Ar (40Da).
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
44
MSn
tandem in time
In una trappola ionica tutti gli ioni sono resi instabili tranne quelli di interesse con un certo valore
di m/z che vengono intrappolati nella sorgente; gli ioni selezionati sono eccitati per decomporli; gli
ioni prodotto sono resi instabili e rilevati (product ion scan).
Anche gli ioni prodotto possono essere intrappolati, decomposti ed i frammenti analizzati. Gli
stadi di selezione, decomposizione ed analisi avvengono nella stessa zona dello strumento, ma
separati nel tempo. Possono essere numerosi (n) e si parla di MS/MS/MS… o MSn.
analisi ESI-IT-MSn di zolpidem
Hubschmann, Handbook of GC/MS, 2001
308
MS2
[M + H]+
263
MS3
235
248
ione molecolare
235
MS4 di
m/z 248
N
N
- HN(CH3)2
- CH3
263
O
220
- CO
248
220
N
MW 307
- CO
W.:F.Smith et al., Anal.Chim.Acta 506 (2004) 203
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
235
45
MS fisso
MS in scansione
tandem MS
MODI DI SCANSIONE
ion
source
MS - 1
camera di
collisione
MS - 2
detector
PRODUCT ION SCAN.
Si seleziona lo ione precursore nel MS-1 e si fa l’analisi dei frammenti operando MS-2
in scansione. Si usano spesso metodi di ionizzazione soft per avere ioni
(quasi)molecolari.
PRECURSOR ION SCAN.
MS-1 opera in scansione, mentre MS-2 opera in SIM su uno ione specifico. Vengono
così identificati tutti gli ioni che producono lo stesso frammento. Non può essere
effettuata nella tandem in time.
NEUTRAL LOSS SCAN
MS-1 e MS-2 operano in scansione simultanea, ma con una differenza di massa
costante corrispondente alla massa di un frammento neutro (es. mentre MS-1 fa la
scansione da 30 a 500, MS-2 la fa da 15 a 485, e la differenza di massa corrisponde
alla perdita di un CH3•.
SELECTED REACTION MONITORING (SRM).
Si seleziona una reazione di frammentazione; MS-1 e MS-2 sono focalizzati su masse
selezionate. E’ l’analogo MS/MS del SIM.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
46
Quando usare la MS/MS:
 disturbo causato dalla matrice
 co-eluizione con un interferente
 identificare la struttura di un composto incognito
 aumentare la sensibilità nell’analisi quantitativa
 conferma di un’analisi in SIM
tandem MS
MS-1 SIM - MS-2 SCAN
Utilizzato per confermare la presenza dell’ analita in una miscela complessa; per determinare la
struttura di un composto incognito; per identificare l’analita quando la ionizzazione che si
utilizza non produce frammentazioni (ESI, CI).
MS-1 SCAN - MS-2 SIM
Utilizzata per l’analisi specifica dei membri di una classe di composti con caratteristiche comuni.
Analisi alchilfenoli nei carboni: MS-2 è impostata per il monitoraggio dello ione a m/z 107,
relativo al frammento HO-C6H4-CH2+.
MS-1 SCAN NL MS-2 SCAN
Utile per l’analisi di classi di composti, es.composti con lo stesso gruppo funzionale.
Analisi PCDD: perdita consecutiva di Cl• e CO, con una perdita netta di 63 Da. Lo strumento
determina in modo specifico tutte le PCDD lavorando con una differenza di massa costante a
63 Da.
MS-1 SIM - MS-2 SIM
SRM. Caratterizzato da elevata sensibilità e selettività. Adatta per l’analisi di quantitativa di
composti in tracce in matrici complesse.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
47
Esempio: ormoni steroidei in acque di scarico municipali-1
OH
OH
H
H
Analisi GC-MS/MS acqua di scarico
H
O
H
2
1
H
tracciato GC
H
HO
testosterone
minuti
17-b estradiolo
Procedura
m/z 664
m/z 681
spettro MS/MS
Campioni di acque di scarico 4 L.
665
Filtrazione.
Aggiunta I.S. (100 ng/L mesterolone).
451
450
466
SPE C18; lavaggio H2O/MeOH 6:4;
eluizione H2O/MeOH 25:75.
Derivatizzazione
eptafluorobutirrica.
451
452
m/z
m/z
O
OCOCF2CF2CF3
con
anidride
O
MW 682.5
Evaporazione.
CF3CF2CF2
MW 664.4
H
H
O
CF2CF2CF3
H
1
H
H
H
2
CF3CF2CF2COO
O
Ripresa con 0.1 mL iso-ottano.
Analisi GC-MS/MS. EI 70 eV.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
EP Kolodziej et al. Environ.Toxicol.Chem.22(2003)2622
48
Esempio: ormoni steroidei in acque di scarico municipali - 2
Condizioni GC-MS/MS
composto
RT
min
testosterone
17b-estradiolo
androstenedione
mesterolone
precursore
m/z
14.39
681
14.78
664
15.88 ecc. ecc.
19.10
414 (SIM)
prodotto
m/z
LOD
ng / L
LOQ
ng / L
451, 466, 665
451
0.1
0.1
0.3
0.3
Quantificazione e controllo qualità.
 Identificazione. Tempo di ritenzione ( 0.1 min); abbondanza ioni prodotto (daughter) in MS/MS (
20%).
 Calibrazione. Lineare, 7 punti spaziati su scala log da 1.0 a 100 ug / L.
 LOQ. Punto di più bassa concentrazione della calibrazione considerando la pre-concentrazione; S/N > 6.
 LOD. 1/3 del LOQ.
 Quantificazione. Somma delle aree dei picchi dello spettro MS/MS (base peak + confirmatory
qualifiers); normalizzate sullo standard interno (mesterolone).
 QA/QC. Analisi dei bianchi (acqua distillata) (test contaminazione  assente); campioni in duplicato (test
precisione  < 10%); recuperi (matrice fortificata con analiti  74%  27% n=18).
…
EP Kolodziej et al. Environ.Toxicol.Chem.22(2003)2622
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
49
Esempio: analisi PCB
La scelta della tecnica dipende da:
 concentrazione di PCB prevista (LOD richiesto).
 Tipo di interferenze sospettate.
 Risoluzione richiesta (determinazione congeneri o PCB totali).
 Potere di discriminazione qualitativa; accettabilità di falsi positivi e negativi (*).
 Accuratezza e precisione richiesta.
 Disponibilità della strumentazione.
 Tempi e costi di analisi.
HPLC risoluzione sufficiente per PCB totali. Rivelazione UV.
HRGC (GC ad alta risoluzione: con colonna capillare) per l’analisi di congeneri.
GC-FID per livelli di concentrazione alti (%) e bassa interferenza. GC-ECD se concentrazioni basse, ma ci
sono poche interferenze da elettrofori.
GC-MS per basse concentrazioni e presenza di interferenti..
MDGC (multidimensional GC, GCn), GC-MS/MS, GC-HRMS per elevata selettività.
(*) Esempio: falso positivo :accettabile in un monitoraggio sulla contaminazione da PCB (danno:
sostiuzione inutile del fluido dielettrico); non-accettabile: nel latte umano di una poplazione che vive nei
pressi di un inceneritore di PCB.
MD Erickson Analytical Chemistry of PCBs
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
50
Esempio: analisi PCB
Ionizzazione elettronica (EI). L’acquisizione full scan è utile per l’analisi qualitativa; in SIM si migliora la
sensibilità e la selettività dell’analisi. In genere si usa lo ione più intenso per la quantitativa, e il rapporto
M/M+2 per il riconoscimento, eventualmente un terzo ione nei casi dubbi. Esempio:
C12H9Cl
188 (100) 190 (33)
C12H7Cl3
256 (100) 258 (99)
260 (33)
C12H8Cl2
222 (100) 224 (33)
226 (11)
C12HCl9
430 (100) 432 (66)
428 (87)
Ionizzazione chimica positiva (PCI). Per la minore frammentazione lo ione molecolare è in genere il
picco principale nello spettro di massa. Usando metano come gas reagente si formano gli ioni [M+H]+,
[M+C2H5]+. Il vantaggio è limitato, perché ioni molecolari intensi si hanno anche in EI. Inoltre, la risposta
PCI è influenzata dalle condizioni di ionizzazione con effetti negativi sulla precisione.
Ionizzazione chimica negativa (NCI, ECMS). Ha caratteristiche di sensibilità e selettività (e reattività)
simili all’ECD, con il vantaggio dell’abilità di riconoscimento del MS. Ha i problemi di riproducibilità delle
tecniche CI. Gli ioni possono essere M- e 35Cl-, 37Cl-.
Alta risoluzione (HREIMS). Maggiore certezza nell’identificazione, anche in presenza di diversi
interferenti e senza separazione GC (analisi diretta).
Tandem MS (MS/MS). Può essere adatta per l’analisi quali-quantitativa in miscele molto complesse, ad
esempio con un elevato fondo dovuto a idrocarburi o lipidi. In genere lo ione precursore è lo ione a massa
più bassa del cluster di ioni molecolari (C12Hn35Cl10-n). Gli ioni prodotto sono in genere (M-Cl)+, (M-HCl)+, MCl2)+.
Esempio: PCB N° 52 ione precursore m/z 292, ioni prodotto m/z 257, 222, 220.
Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
MD Erickson Analytical Chemistry of PCBs
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