AZIENDA
SANITARIA
FIRENZE
ALLERGOLOGIA
IMMUNOLOGIA CLINICA
NUOVO OSPEDALE SAN GIOVANNI DI DIO
Recenti acquisizione
nell’immunoterapia con veleni
Maurizio Severino
Insect venom allergens
with known sequences and structures
Allergen
Name
Apis mellifera
Api m 1
Api m 2
Api m 3
Api m 4
Common name
Molecular
Size, kD
Recombinant
protein
Phospholipase A2
Hyaluronidase
Acid phosphatase
Mellitin
16
39
43
3
+
+
+
-
Bombus penny.
Bom p 1
Phospholipase A2
Bom p 4
Protease
16
28
-
Insect venom allergens
with known sequences and structures
Allergen
Name
Common name
Molecular
Size, kD
Recombinant
protein
Polistes annularis
Pol a 1
Phospholipase A1
Pol a 2
Hyaluronidase
Pol a 5
Antigen 5
34
38
23
+
Vespula vulgaris
Ves v 1
Ves v 2
Ves v 5
34
38
23
+
+
+
Phospholipase A1
Hyaluronidase
Antigen 5
Insect venom allergens
with known sequences and structures
Allergen
Name
Common name
Molecular
Size, kD
Recombinant
protein
Dolichovespula
maculata
Dol m 1
Phospholipase A1
Dol m 2
Hyaluronidase
Dol m 5
Antigen 5
34
38
23
+
+
+
Vespa crabro
Vesp c 1
Vesp c 5
34
23
-
Phospholipase A1
Antigen 5
Allergeni ricombinanti
Molti allergeni maggiori (fosfolipasi A2, ialuronidasi
per il veleno di ape, antigene 5 per il veleno di
vespula) sono stati prodotti utilizzando vari vettori:
E.coli
cellule di insetto infettate con baculovirus **
** con l’uso di questo sistema l’attività enzimatica e
la capacità di legare le IgE sono simili a quelle
dell’allergene naturale purificato
U.R. Muller, Allergy, 2002
Allergeni ricombinanti di veleno di
ape
Test cutanei
L’attività allergenica della fosfolipasi
ricombinante è dieci volte più alta di
quella di veleno intero purificato
U.R. Muller, Allergy, 2002
Allergeni ricombinanti di veleno di
ape
Studi in vitro
Gli allergeni ricombinanti sono superiori alle
preparazioni naturali altamente purificate per
determinare la rilevanza dei singoli allergeni.
Un altro vantaggio dell’uso di allergeni ricombinanti
per la diagnosi è l’AUMENTATA SPECIFICITA’:
con allergeni ricombinanti o sintetici non ci sono
falsi positivi, al contrario di quanto avviene con
l’uso di veleno intero purificato o di fosfolipasi
naturale purificata
U.R. Muller, Allergy, 2002
Molecular cloning and expression in insect
cells of honeybee venom allergen acid
phosphatase (Api m 3).
The availability of recombinant Api m 3
provides a tool for both the development
of improved diagnostic tests and the
design of safer and more effective
immunotherapeutic approaches for
honeybee venom allergy.
Grunwald T, Allergy Clin Immunol. 2006
Prospettive per l’uso di allergeni
ricombinanti nella terapia
Una volta che il pattern di
sensibilizzazione individuale del paziente
è stato determinato, può essere
somministrata per l’immunoterapia una
miscela a misura del paziente
U.R. Muller, Allergy, 2002
Allergic reactions to
epidemiologically less relevant
Hymenoptera
To avoid false-negative and falsepositive responses to diagnostic
tests and in order to completely
protect allergic patients from the
effects of subsequent stings, the
commercial extracts of venom
should be prepared with
appropriately selected species
U.R. Muller Allergy 2002
VELENI
ALK
ape
vespula
Apis m.
Vespula spp
Vespa
crabro
polistes
ANALLERGO
STALLERGENES
Apis m.
Ape
(Apis m.)
Vespula g.
Giallone
(Vespula spp)
Vespa crabro
Polistes spp.
Polistes dom.
Calabrone
(Dolichovespula a.)
Vespa
(Polistes spp.)
VELENO DI APE
E’ stato isolato un altro allergene: una
proteina di 8 kDa (Api m6)
Per aumentare la stabilità del veleno
durante la sua estrazione vengono aggiunti
aminoacidi e successivamente nella fase di
purificazione (dialisi) vengono eliminate
Durante il processo dialitico potrebbero
essere eliminati importanti allergeni con peso
molecolare basso.
Kettner et al JACI, 2001
VELENO DI BOMBO
Sta aumentando l’utilizzo del Bombo nelle
serre per l’impollinazione
Anche se l’Ape ed il Bombo appartengono
alla stessa famiglia, studi hanno
dimostrato che testare con il solo veleno
di ape può essere insufficiente, dal
momento che le PLA2 di ape e bombo
cross-reagiscono parzialmente ed il velemo
di Bombo possiede allergeni esclusivi.
Hoffman DR JACI 2001
Polistes spp
The species Polistes dominulus and
Polistes gallicus are European paper
wasps belonging to the subgenus
Polistes, while the species Polistes
exclamans, Polistes annularis
(subgenus Aphanilopterus) and
Polistes fuscatus (subgenus
Fuscopolistes) are typical of North
America
P. dominulus, has spread also in the
northeastern United States; this adds
even more interest to the
characterization of European Polistes
venom
D.R. Hoffman J.Allergy Clin Immunol 1990
R. Cervo Insectes Soc. 2000
Polistes spp
It is particularly important for diagnosis
and therapy of Polistes allergic patients
to choose the proper venom , since this
genus is the most distantly related in the
Vespidae family and since there is only
partial cross-reactivity between
European and American Polistes venoms.
F. Sanchez Clin. Exp. Allergy 1995
D.R. Hoffman J. Allergy Clin Immunol 1997
M. Severino Ital. J. Allergol Immunol 1998
what
can help us to elucidate the molecular
basis of the limited cross-reactivity
between European and American Polistes
venom?
Characterization of the major allergens purified
from Polistes gallicus venom
Characterization of the major allergens purified
from Polistes gallicus venom
serum specific IgE
Characterization of the major allergens purified
from Polistes gallicus venom
serum specific IgE
Characterization of the major allergens purified
from Polistes gallicus venom
Characterization of the major allergens purified
from Polistes gallicus venom
Characterization of the major allergens purified
from Polistes gallicus venom
Polistes spp
The degree (85%) of sequence
homology between European and North
American Ag5s, which is lower than that
observed within the same subgenus (98%)
the differences found in the PL
molecules
the finding that protease is an
important allergen in P. gallicus and in P.
dominulus venoms
can help us to elucidate the
molecular basis of the limited
cross-reactivity between American
and European Polistes venom
Polistes spp
European Polistes venom allergy
Severino M. , Campi P, Macchia D,
Manfredi M, Turillazzi S, Spadolini I,
Bilò MB e Bonifazi F.
Allergy, 2006 in press
Polistes spp
ho il piacere di comunicarLe
che è disponibile l'ImmunoCAP
per il Polistes
Dominulus Venom con marchio
CE.
Il codice è 14 4919 01
confezione da 10
ImmunoCAP sigla i77
Cordiali saluti
Antonella Marelli
Vespa crabro
The role of Vespa crabro stings in
life-threatening reactions has been
suggested
Hoffman DR, Int Archs Allergy appl Immunol,
1987
Vespa crabro
The extensive cross-reactivity between
Vespula and Vespa crabro has been
demonstrated
Hoffman DR, Ann Allergy 1981
The main components of Vespa crabro
venom, hyaluronidase, phospholipase and
Antigen 5 are structurally homologous to
corresponding proteins in other vespid
venoms
Hoffman DR, Int Archs Allergy appl Immunol,
1987
Vespa crabro
“Vespa crabro venom possesses some
common antigens with Vespula venom, but
one third of Vespa crabro-allergic
individuals have positive skin tests and
RAST restricted to Vespa crabro venom”
Bousquet J. Allergy, 1987
Vespa crabro
The percentage of life-threatening
reactions was very high in the Vespa
crabro allergic group (81,25%), while was
similar both in honeybee allergic group
(24%) and in Vespula spp allergic group
(27,8%)
L. Antonicelli: Europ Annals Clin Immunol 2003
Vespa crabro
In those patients who have had a
systemic reactions, the risk of a lifethreatening reaction is about three times
higher for the Vespa crabro sting than it
is for the honey bee or yellow jacket
sting
L. Antonicelli: Europ Annals Clin Immunol 2003
Correlation between insect identification
intradermal test and/or sIgE
Among 928 pts who identified the culprit insect
Insect
identification:
Patients n°
Honey bee:
399
Yellow jacket:
235
Vespa crabro:
294
Intradermal
test
Positivity %
sIgE
Positivity %
95.2
91.2
99.1
89.7
94.8
60.5
Vespa crabro venom
intradermal tests and sIgE results
40
35
30
25
20
N° pat with CAP > 0,35
15
10
N° pat with CAP < 0,35
5
0
0,0001 0,001
0,01
0,1
skin reactivity threshold
1
VESPA CRABRO venom
preliminary data
Skin reactivity
threshold
Cap
RAST
Anallergo venom
0.01
1
0.001
0.01
0.1
0.0001
0.1
0.01
0.01
0.01
< 0.35
5.09
0.47
< 0.35
< 0.35
0.68
0.42
< 0.35
2.82
< 0.35
3.39
25.8
8.45
4.95
3.18
7.20
6.15
3.15
21.22
5.34
Cap: positive > 0.35 KU/l
RAST: positive > 3.4 % ( Control serum 1.7%)
VESPA CRABRO venom
preliminary data
CAP
CAP
Anallergo venom
< 0.35
<0.35
0.40
0.4
<0,35
<0.35
< 0.35
0,4
0,4
0,4
<0,35
0,6
1,3
1,5
0,4
0,5
0,9
1,0
<0,35
<0,35
0,4
0,5
2,3
1,7
0,7
2,1
1,4
1,7
Immunoterapia specifica con
veleno di Imenotteri
Selezione dei pazienti che
necessitano della immunoterapia
Scelta del veleno
Protocolli di trattamento
Follow up dei pazienti dopo
l’interruzione dell’immunoterapia
Classificazione delle reazioni allergiche
alle punture di Imenotteri
Reazioni locali estese
Reazioni sistemiche
Grado 1
Eritema ed edema di diametro >
10 cm, che dura > 24 h
Orticaria, prurito generalizzato,
malessere, ansietà
Grado II
Angioedema, costrizione toracica,
nausea, vomito, diarrea
Grado III
Dispnea, edema laringeo,
debolezza, confusione
Grado IV
Collasso, perdita di coscienza,
incontinenza sfinterica
Mueller HL 1966, modificata
Storia naturale dell’allergia
al veleno di Imenotteri
Studi prospettici hanno dimostrato che non tutti i
pazienti con prove allergologiche positive presentano
reazione in seguito a nuova puntura.
Il rischio di reazione sistemica dipende dalla gravità
della precedente reazione:
 dopo una reazione locale estesa, meno del 5% dei
soggetti svilupperà una reazione sistemica
 dopo una reazione sistemica lieve il 15-30%
 dopo una reazione sistemica grave più del 50%
manifesterà di nuovo una reazione sistemica grave.
Ammissione all’immunoterapia
specifica per veleno di Imenotteri
Tipo di reazione
Tests cutanei
Sistemica grave Positivi
Negativi
Orticaria
Positivi
Negativi
Locale estesa
Positivi
Negativi
Ammissione
all’ITS
Si
No
Di solito No
No
No
No
F. Bonifazi et al. Allergy, 2005;60:1459
Immunoterapia specifica con
veleno di Imenotteri
Selezione dei pazienti che
necessitano della immunoterapia
Scelta del veleno
Protocolli di trattamento
Follow up dei pazienti dopo
l’interruzione dell’immunoterapia
Hymenoptera venom allergy
skin tests results in 2017 patients
negative
16%
Apis m.
12%
Vespula
8%
Polistes
4%
multiple
59%
V. crabro
1%
S. Giovanni di Dio Hospital , Florence
Skin tests results in 1190 patients
with multiple reactivity
BPH
BH
PH
BVP
BV
BVH
VP
B: Apis m.
V: Vespula spp
P: Polistes spp
H: Vespa crabro
VH
BVPH
VPH
0
10
20
30
patients %
S. Giovanni di Dio Hospital , Florence
40
50
Hymenoptera venom allergy
Identification of the stinging insect
Apis m.
17%
Vespula
11%
Not
identified
59%
Polistes
2%
V. crabro
11%
S. Giovanni di Dio Hospital , Florence
“Position paper: immunotherapy
with Hymenoptera venoms”
…. The RAST-inhibition may also give a
clue to the responsable insect.
If not, both venoms shold be used for
immunotherapy.
U. Muller and H. Mosbech, Allergy, 1993, 43, 37
“Combined use of skin testing
and RAST inhibition in patients
allergic to Hymenoptera venom”
If primary venom was considered the
venom with the stronger skin reactivity
and with the higher titer of sIgE , the
likelyhood of mistakes in the light of RAST
inhibition was about 30%
R. Zerboni et al, Int. J. Immunophathol. Pharmacol,
1997
RAST inhibition studies
Analysis of costs (EURO) according to
Costilab® software
Time cost Reagent cost
86 €
163 €
Laboratory
cost
37 €
Total
286 €
One venom for a 5 year immunotherapy : 1936 €
S. Giovanni di Dio Hospital , Florence
RAST inhibition studies
144 patients positive to two venoms
Apis m.
74%
V. crabro
4
13
26%
Polistes
Vespula
multiple sensitization
unique sensitization
20
69
RAST inhibition studies
Field stings
45 out of 144 patients were restung 141
times in total:
137: no reaction
2: LLR
(97.1%)
(1.4%)
2: mild sistemic reaction
(1.4%)
Immunoterapia specifica con
veleno di Imenotteri
Selezione dei pazienti che
necessitano della immunoterapia
Scelta del veleno
Protocolli di trattamento
Follow up dei pazienti dopo
l’interruzione dell’immunoterapia
Treatment protocols for venom immunotherapy
doses in µg of venom
Day
1
Ultrarush
Rush
Cluster
Our Protocol
Conventional
0.1
1
10
20
30
40
0.01
0.1
1
0.001
0.01
0.1
0.01
0.1
1
3
0.01
0.1
2
4
8
10
20
40
60
80
100
100
3
4
8
15
50
50
100
22
29
100
5
10
20
30
35
35
1
6
10
20
30
50
50
100
100
1
2
1
4
8
10
20
40
60
Dose di mantenimento
La dose di mantenimento generalmente raccomandata
è di 100 µg di veleno, che corrisponde a circa due
punture di Ape e a diverse punture di Vespula
(Hoffman, 1984).
Golden (1981) ha dimostrato che la dose di 100 µg
di veleno protegge in misura significativamente
maggiore rispetto alla dose di 50 µg.
La dose di 200 µg è indicata negli apicoltori, che
sono punti spesso da diversi insetti allo stesso
tempo, e nei pazienti che hanno avuto reazione in
campo durante la terapia.
1390 pazienti sottoposti a immunoterapia
specifica con veleno di Imenotteri
Apis m.
22%
V. crabro
10%
Vespula
47%
Polistes
21%
Pazienti trattati con un solo veleno: 963
“
due veleni:
419
“
tre veleni:
8
Nuovo Osp. S. Giovanni di Dio, Firenze
Immunotherapy with Honey bee venom
mean skin test threshold in mcg/ml
64 patients
Intradermal test: follow-up
10-3
10-2
10-1
pre- VIT
5° year
18/57 (31.5%) pts during VIT became negative
S. Giovanni di Dio Hospital , Florence
Immunotherapy with Honey bee venom
64 patients
60
48
36
24
m
12
T
ai
nt
en
an
ce
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
pr
eVI
KU/l
Mean serum IgE
months
S. Giovanni di Dio Hospital , Florence
Immunotherapy with Vespula venom
mean skin test threshold in mcg/ml
142 patients
Intradermal test: follow-up
10-3
10-2
10-1
pre- VIT
5° year
15/88 (20.4%) pts during VIT became negative
S. Giovanni di Dio Hospital , Florence
Immunotherapy with Vespula venom
142 patients
60
48
36
24
m
12
T
ai
nt
en
an
ce
30
25
20
15
10
5
0
pr
eVI
KU/l
Mean serum IgE
months
S. Giovanni di Dio Hospital , Florence
Immunotherapy with Polistes
dominulus venom in 290 patients
Polistes dominulus +
Apis m
Polistes dominulus +
Apis m. + Vespula spp
Polistes dominulus +
Vespa crabro
3
7
42
Polistes dominulus +
Vespula spp.
Polistes dominulus
136
102
Immunotherapy with Vespa crabro
venom in 190 patients
Vespa crabro + Apis m
Vespa crabro + Vespula
Vespa crabro + Polistes
dominuls
Vespa crabro
5
17
42
126
Clinical data
N° pts.
Age: average
M
F
Severity of systemic
reaction:
Grade 1
Grade 2
Grade 3
Grade 4
290
190
41.9 (9-75)
46.8 (10-78)
104
26
63
25
3%
12. 7 %
33.3 %
51 %
5.6 %
13.8 %
27.2 %
53.4 %
Immunotherapy with Polistes
dominulus and Vespa crabro venom:
rush schedule
Session
1
^
2
^
3
^
4
**
Dose
mcg
0.01
0.1
1
3
^
**
5 30 100
10 35
20 35
Injection every 30’
** venom adsorbed with tyrosine
Immunoterapia specifica con veleno
di Polistes dominulus
110 pazienti
sIgE (KU/I)
25
20
15
10
5
0
1
Pre-ITS
2
mantenimento
Immunoterapia specifica con veleno
di Polistes dominulus
110 pazienti
sIgG m g/m l
15
10
5
0
1
Pre-ITS
mantenimento
2
Immunoterapia specifica con veleno
di Polistes dominulus
110 pazienti
1,4
NEG
1,2
mcg/ml
1
0,8
1
0,6
0,4
0,2
0.10
PRE-IT
1
12
2
24
3
36
4
MONTHS
48
5
60
6
Immunotherapy with
Polistes dominulus e Vespa crabro
venom
No adverse systemic reactions
45 pts were re-stung (102 stings):
1 systemic reaction
Italian study group on
Hymenoptera venom allergy
Occurence of systemic side effects
Mild
Reactions
Severe
reactions
Conventional
Modified
rush
Rush
Clustered
2/87
(2.2%)
28/655
(4.2%)
13/470
(2.7%)
8/178
(4.4%)
3/87
(3.4%)
20/655
(3%)
13/470
(2.7%)
2/178
(1.1%)
Giorn. It. Allergol. Immunol. Clin, 1993
Gruppo di studio Italiano
sull’allergia al veleno di Imenotteri
Reazioni avverse in corso di
immunoterapia:
Ape :
15.4%
Vespula :
2.%
1390 pazienti
Giorn. It. Allergol. Immunol. Clin, 1993
Side-effects od insect venom
immunotherapy:
results from EAACI multicenter study
Occurence of systemic side effects
Type of
Patient/treatment
Sex
F
M
Venom
Vespula spp
Honey bee
Polistes spp
Updosing regimen
Weekly
Clustered
Rush
Rate/injections
during updosing
Rate/injections
during
maintenance
2
1.2
0.9
1.2
25
15
1.5
1.8
0
0.6
2.4
0
19
24
0
0.8
1.3
2.1
Rate/patients
0.2
12
0.1
22
1.5
24
Allergy, 2000, 55, 1005
Adverse systemic reactions during
treatment with honey bee venom
Build-up
Pts
N° of injections
116
1030
N° of systemic
Reactions
9
maintenance
116
6146
5
Rate/pts
7.7
4.3
Rate/injections
0.7
0.1
S. Giovanni di Dio Hospital , Florence
Precauzioni per evitare l’iniezione
intravasale
se il paziente sente dolore più del
solito, è necessario cambiare area
aspettare 30’’ tra la puntura e l’iniezione
ripetere l’aspirazione più volte,
iniettare la dose lentamente
tenere un piccolo quadratino di garza
bianca tra la siringa e la cute



Immunoterapia con veleno di
Imenotteri
efficacia
Più del 90% dei pazienti allergici ai
vespidi durante l’immunoterapia
specifica risulta protetto, in confronto
al 75-80% dei soggetti allergici al
veleno di Ape
Muller 1993, Allergy
Efficacy of venom
immunotherapy
The efficacy of VIT was analysed in 3 prospective
controlled studies (level of evidence: Ib)
Systemic reaction at re-exoposure:
Hunt: 1978
Venom : 5.3%
Wholebody extract: 63.6%
Placebo: 58.3%

Brown 2003
Venom: 0%
Placebo: 72%

Immunoterapia con veleno di
Imenotteri
efficacia
Ape:
Vespula:
99%
95.5%
Nuovo Ospedale S. Giovanni di Dio, Firenze
Immunoterapia specifica con
veleno di Imenotteri
Selezione dei pazienti che
necessitano della immunoterapia
Scelta del veleno
Protocolli di trattamento
Follow up dei pazienti dopo
l’interruzione dell’immunoterapia
Survey of patients after discontinuing
vemom immunotherapy
Years off therapy
1
2
3
5
10
Reaction rate author
0%
8%
9.5 %
13 %
16.2 %
Golden, 1989
Golden, 1987
Golden, 1996
Golden, 1998
Golden, 2000
Percentuale di reazione dopo
interruzione dell’immunoterapia
43 patients
Ape:
Vespula:
2%
4%
(6-72 mesi)
(6-96 mesi )
Nuovo Ospedale S. Giovanni di Dio, Firenze
Quality of life in patients allergic to
Hymenoptera venom in Italy before
and after immunotherapy
L’immunoterapia migliora la qualità di vita in tutti i
pazienti allergici al veleno di imenotteri; il
miglioramento è più marcato nei pazienti di classe III e
IV e nei pazienti che sono stati ripunti durante
l’immunoterapia
L’immunoterapia sembra giocare un ruolo molto
importante nello stato psicologico e nei rapporti sociali
Bilò MB., JACI, 2000, 105, 57
Venom immunotherapy improves
health-related quality of life in patients
allergic to yellow jacket venom
Seventy-four patients agreed to be randomized,
of whom 36 received VIT and 38 an Epi-Pen.
The improvement in quality of life was
statistically significant (P< .0001) in the group
randomized to VIT, compared with that seen in
the group randomized to the EpiPen.
Oude Elbernik., JACI, 2002, 110,174
Grazie per l’attenzione.