Quali sono gli strumenti a
disposizione dell’istologo per lo
studio della cellula e dei tessuti?
ordine di grandezza delle strutture di
interesse istologico
• in questo corso raramente
ci soffermeremo sulle
esatte dimensioni delle
strutture oggetto di studio
• è però di fondamentale
importanza conoscere
l’ordine di grandezza di
tali strutture
Cosa significa “ordine di grandezza”?
• Semplificando:
due oggetti differiscono di un
ordine di grandezza quando
uno è circa 10 volte più
grande dell’altro
sarebbe l’esito
Importanza degli ordini diquale
grandezza
di questo incidente?
può una proteina
attraversare la
membrana tramite
un canale ionico?
scale lineari e scale logaritmiche
8 µm
80 mm
1 mm
7 µm
70 mm
100 µm
6 µm
60 mm
10 µm
5 µm
50 mm
1 µm
4 µm
40 mm
100 nm
3 µm
30 mm
10 nm
2 µm
20 mm
1 nm
1 µm
10 mm
1Å
In una scala
logaritimica, il valore
di ogni suddivisione si
ottiene moltiplicando
(o dividendo) il valore
della suddivisione
precedente.
In questa scala, il
fattore è 10
Questione di dimensioni…
1 mm
spessore di un capello umano
100 µm
cellule epiteliali
10 µm
1 µm
100 nm
globuli rossi
batteri
virus
10 nm
proteine
1 nm
aminoacidi
1Å
atomi
le frecce bianche
indicano l’ordine di
grandezza di alcune
strutture biologiche
e chimiche
- l’organismo è composto di cellule
immagine
istologica
- esistono molti tipi diversi di cellule
immagine istologica
tipicamente, cellule relativamente simili
fra loro si aggregano …
…formando i cosiddetti tessuti.
L’istologia può anche essere definita come
lo studio dei tessuti dell’organismo
immagine istologica
cosa si
osserva?
Anatomia del microscopio ottico o “luce”
bx51
schema di
interior
funzionamento di
un moderno
microscopio ottico
come si ottiene, a partire da tessuti
immagine
istologica
biologici, un’immagine come questa?
La preparazione di materiale istologico
Problema 1
• la luce del microscopio può
attraversare solo materiale di
spessore molto ridotto
• il tessuto deve essere sezionato
mediante speciali apparecchi, detti
microtomi
microtomo a slitta
microtomi
elettronici
La preparazione di materiale istologico
Problema 2
• i tessuti biologici sono per lo più
molli
• prima del taglio, il tessuto deve
essere indurito
– Fissazione con aldeidi
– Inclusione
– Congelamento
criostato
La preparazione di materiale istologico
Problema 3
• i tessuti sono normalmente quasi
incolori e privi di contrasto
• prima dell’osservazione al microscopio,
il tessuto deve essere colorato
• coloranti con affinità per componenti
cellulari e tissutali diverse possono
essere combinati nella stessa sezione
istologica
acidofilia e basofilia
• le sostanze acide che si trovano
nei tessuti possiedono affinità per i
coloranti basici (basofilia)
• le sostanze basiche che si trovano
nei tessuti possiedono affinità per i
coloranti acidi (acidofilia o
eosinofilia)
acidofilo (eosinofilo)
diversi tipi di
granulociti
basofilo
neutrofilo
sequenza dei passaggi in una
tipica procedura istologica
1. fissazione di un campione di tessuto
in formaldeide
2. congelamento del pezzo
3. taglio al microtomo
4. montaggio su vetrino
5. “bagni” in soluzioni di coloranti
6. disidratazione e coverslipping
lo striscio
di sangue
Lo “striscio”, una delle
tecniche istologiche
più diffuse, consente lo
studio microscopico
delle cellule del sangue
e si distingue dal
protocollo “generico”
appena delineato
perché, ovviamente,
non richiede il taglio
del tessuto.
striscio
Istologia
“funzionale”
L’istologia moderna non
si limita all’osservazione
descrittiva degli aspetti
morfologici e strutturali
di base di cellule e
tessuti.
Esistono numerose
tecniche che consentono
di rispondere a quesiti su
specifici correlati
funzionali della
composizione di un
tessuto
• Colture cellulari
• Coloranti vitali
• Istochimica
• Immunoistochimica
• Immunofluorescenza
• Tecniche speciali
– Traccianti assonali
– Tecniche combinate
Citochimica e Istochimica
• L’identificazione e/o la misura
quantitativa mediante reazioni di
colorazione specifiche (o mediante
metodi fisici) di costituenti chimici
delle cellule e dei tessuti
Mentre nella biochimica tradizionale il
materiale biologico viene studiato
tipicamente “in provetta”,
la citochimica e l’istochimica applicano
tecniche biochimiche direttamente su
sezioni di tessuto, consentendo di
identificare i costituenti in situ.
Immunofluorescenza e
immunoistochimica
• Metodi altamente sensibili per la
localizzazione di proteine o polisaccaridi
nei tessuti
• IF: anticorpi coniugati con sostanze
fluorescenti
• IIC: anticorpi coniugati con enzima
perossidasi (rivelato poi da una
reazione istochimica)
immagine istologica
che livello di dettaglio si
apprezza in questa immagine?
stesso tessuto a
maggiore ingrandimento
ulteriore
ingrandimento...
è sufficiente il
microscopio
ottico a
“saziare” ogni
curiosità sulle
strutture
viventi?
Questione di dimensioni…
1 mm
Occhio umano
100 µm
10 µm
Microscopio ottico
1 µm
100 nm
le frecce indicano il
massimo potere risolutivo
di alcuni strumenti di
osservazione
cell. epiteliali
globuli rossi
batteri
virus
10 nm
proteine
1 nm
aminoacidi
1Å
atomi
Che differenza c’è fra:
ingrandimento
e
potere di risoluzione?
Questo è quello che
succede quando si
ingrandisce
indefinitamente
un’immagine.
Aumentare a piacimento la
risoluzione di un’immagine
già acquisita è possibile
solo nei film americani...
il potere risolutivo
dello strumento di osservazione
determina il livello di dettaglio
contenuto nell’immagine.
L’ingrandimento non determina
un aumento di risoluzione delle
immagini
di conseguenza, l’ulteriore ingrandimento di questa
immagine non rivela maggiori dettagli
il microscopio
elettronico a
trasmissione
m. ottico e
m. elettronico
a confronto
filamento
(catodo)
anodo
condensatore
preparato
obiettivo
oculare
proiettore
obiettivo
preparato
schermo
fluorescente
condensatore
lampada
B
Microscopia elettronica
• Preparazione del tessuto
–
–
–
–
Fissazione in glutaraldeide
Postfissazione in tetrossido di osmio
Disidratazione con alcol
Inclusione in plastiche acriliche o resine
epossidiche
• Taglio all’ultramicrotomo
– Sezioni ultrafini di 20-40 nm
• Aumento del contrasto
– Coloranti elettronici come acetato di
uranile o citrato di piombo
ultramicrotomo
l’ultramicrotomo produce tipicamente sezioni di 50-70 nm
Esempio di
microscopia
elettronica a
trasmissione
Le immagini di
microscopia elettronica
sono “in bianco e nero”.
Le parti “scure” si
dicono elettrondense.
L’altissimo potere
risolutivo del ME
consente di distinguere
numerose componenti
subcellulari.
linfocito
stereomicroscopio
• la luce incide
sull’oggetto e
viene riflessa
da esso
• si osservano
oggetti in
rilievo
Microscopio elettronico a scansione
Microscopio elettronico
a scansione
• Risoluzione inferiore
rispetto alla ME a
trasmissione
• Consente di
valutare il rilievo
degli oggetti
• Usata per lo studio
delle superfici
cellulari
Questione di dimensioni…
1 mm
Occhio umano
l’osservazione di diversi livelli di
organizzazione della materia vivente
richiede l’uso di diversi strumenti
Microscopio ottico
100 µm
10 µm
1 µm
100 nm
Microscopio elettronico
a scansione
Microscopio elettronico
a trasmissione
cell. epiteliali
globuli rossi
batteri
virus
10 nm
proteine
1 nm
aminoacidi
1Å
atomi
capello
alcuni esempi di
microscopia
elettronica a
scansione…
formica
“bug”
ragno
tipi di
microscopio
Tipo di osservazione
Sezioni di
tessuto
Morfologia
esterna
Luce
visibile
Microscopio
ottico
Stereomicroscopio
Elettroni
Microscopio
elettronico a
trasmissione
Microscopio
elettronico a
scansione
Fonte di
energia