Corso di Perfezionamento
NUOVI SVILUPPI NELLA DIAGNOSTICA
MICROBIOLOGICA E VIROLOGICA (II edizione)
3° modulo: Micologia e Parassitologia
5-6 Novembre 2004
Pneumocistosi
Prof. Guglielmo Gargani
Dr. Gabriella Pini
Dipartimento di Sanità Pubblica
sez. Microbiologia
Università degli Studi di Firenze
Pneumocystis carinii : La storia
1909 Chagas
In polmoni umani e di
cavia un tripanosoma
1910 Carini
In polmoni ratti
1912 Delanoe e
Delanoe
1951 Vanek, Jirovec,
Lukes
Non è un tripanosoma
Pneumocystis carinii
Polmonite a
plasmacellule
Attuale posizione tassonomica
•
•
•
•
•
•
Phylum
Ascomycota
Classe
Archiascomycetes
Ordine
Pneumocystidales
Famiglia Pneumocystudiaceae
Genere
Pneumocystis
Specie Pn carinii (ratto) Pn jiroveci (uomo)
Ciclo vitale
• Trofozoita ameboide negli alveoli con
filopodi
• Moltiplicazione per scissione binaria
• Cellule aploidi che evolvono in
sporoblasti
• Sporoblasti o cisti producono all’interno
8 sporozoiti
• Sporozoiti si liberano e ricomincia il ciclo
Ciclo Vitale
Mayor Surface Glicoprotein
(MSG)
• P.m. 95-160 kDa
Nucleo centrale
proteico
Catene laterali
carboidrati azotati
glucosio mannosio
Adesione agli
pneumociti
n-acetil glicosamina
Determinanti Antigeni
Special form
“Special form”
•
•
•
•
•
•
•
•
carinii
rattus
muris
equi
harictologi
mustelae
suis
homini o Pn.jiroveci
•
•
•
•
•
•
•
•
ratto
ratto
topo
cavallo
coniglio
furetto
maiale
uomo
Classi di eterogeneità
 Fra special form da specie animali
diverse
 Fra special form della stessa specie
animale
 Fra ceppi della stessa specie animale
Pneumocystis organisms :
Pneumocistosi
• A partire dal 1920 compare in bambini
istituzionalizzati in Europa occidentale.
• Dopo la II guerra mondiale è nei bambini
denutriti in Europa orientale e M.O.
• Dopo gli anni ‘50 in immunodepressi
• Dopo il 1985 è causa frequente di morte
in HIV positivi
Human
Pneumocystis
Infection
Dei-Cas E, 2000, Med Mycol 38
Forme clinico-epidemiologiche
• Infezione asintomatica o non diagnosticata
• Forma epidemica :dispnea progressiva,
cianosi, perdita di peso diarrea. Febbre e
tosse possono mancare
• Forma sporadica in immunodepressi:
prevalentemente polmonare
altre localizzazioni possibili
Potential implication of
Pneumocystis in SIDS
• Pneumocystis cysts were detected in lungs from :
– 31% of 134 cases of Sudden Infant
Death Syndrome (SIDS) in Chile
– 15% of 27 SIDS patients in Oxford (UK)
– 3% of 342 infants deceased from other
causes
Vargas et al, Clin Infect Dis 1999
Polmonite da P. jiroveci
Sintomatologia



Dispnea, tosse non produttiva
Cianosi, febbre
Reperti radiologici infiltrati polmonari
Evololuzione più rapida in HIV positivi
Immagini radiologiche
Infiltrati interstizio-alveoloari
prevalentemte nei lobi inferiori
Possibile reperto negativo fino a poche
ore prima dell’exitus
Polmonite da P. jiroveci
Polmonite da P. jiroveci
• Polmonite interstiziale plasmacellulare
• Ispessimento spazi interalveolari
• Alveoli ripieni di sostanza amorfa con
ammassi di parassiti
Polmone in pneumocistosi
Le frecce indicano zone confluenti grigio pallido
Cisti negli spazi alveolari
Pneumocistosi
Pneumocystis carinii
Corpi intracistici
P.jiroveci: cisti al microscopio elettronico a trasmissione. Sono
visibili corpi intracistici e una spessa parete
Altri fattori di rischio
• Tutte le emopatie
• Tumori solidi
• Adenocarcinoma mammario
• Tumori cerebrali
• Immunosoppressione per trapianti
Pneumocistosi
Diagnostica di Laboratorio
Tipologia di campioni clinici
Materiale
Sensibilità tecniche di
colorazione
 Biopsia aperta del polmone
 Biopsia transbronchiale
 Lavaggio broncoalveolare (BAL)
 Sputo indotto (IS)
 Risciacquo orale (OW)
 Brushing orale
>95%
>90%
50-95%
50-85%
Bassa
Bassa
Induced sputum
Nebulized saline
inhaled by patient to
promote deep cough
Inexpensive;
noninvasive
Specimen processing
more complex, may
delay diagnosis of
another pathogen
Less sensitive
Bronchoalveolar lavage
More expensive, more
invasive, risk of periprocedural
sedation, requires skilled
personnel
Larger samples can be sent for
staining and can be used to
diagnose other infections
(bacterial, fungal, viral and
mycobacterial cultures)
Saline instilled through
bronchoscope wedged in airway
and fluid withdrawn
To 95 percent sensitive
Esame diretto
 Colorazione metenamina-nitrato di argento GomoriGroccot
Colora l’involucro della cisti in nero su fondo verde
 Blu di toluidina
Colora selettivamente l’involucro della cisti
 Colorazione di Giemsa o sua variante rapida
Colora sia cisti che trofozoiti

nucleo porpora, citoplasma blu (non colora la parete cistica)
P.carinii: Con alto ingrandimento sono visibili le cisti di 5-8μm di
diametro. L’involucro delle cisti è colorato in nero, i corpi
intracistici non sono visibili. Biopsia aperta del polmone.
Impregnazione argentica secondo Gomori (GMS)
Tutti i fungi hanno la stessa
con metenamina-argento (GMS) che affinità per metenaminaargento e possono essere
colora l’involucro cistico. Sono
visibili cisti rotonde, ovali o piatte di confusi con le cisti di P.carinii.
Cryptococcus neoformans in
circa 4-5 µm di diametro
un campione di BAL (GMS).
P.carinii: sedimento di BAL colorato
Colorazione con blu di toluidina
Trofozoiti di P. jiroveci in BAL. Giemsa. I trofozoiti sono piccoli (1-5
µm) e solo i loro nuclei, colorati in porpora , sono visibili (frecce).
P.carinii: Sono visibili cisti (approx. 5-8 µm di diametro) con corpi
intracistici, le cisti mature ne contengono 8. Alcune cisti appaiono
vuote. Colorazione di Giemsa.
Campione di
BAL,
colorazione
Fungi-Fluor Kit
Polysciences
Europe,
Germany (400X)
Fungi-Fluor non colora specificamente P. carinii (Colora chitina e
cellulosa). Le cisti appaiono in clusters circondati da essudato
schiumoso, il background di fondo interferisce con la chiarezza
dell’immagine
cisti che mostrano le strutture caratteristiche a doppia
parentesi o virgola
Esame diretto
Immunoflurescenza
con anticorpi monoclonali (contro ag di superficie,
forma cistica e trofozoite) aumento sensibilità
Kit commerciali
MonoFluo kit pneumocystis
Bio-Rad laboratories
MeriFluor pneumocystis kit
Meridian Bioscience Europe
Light diagnostics Pneumocystis carinii DFA
Chemicon USA
Immunoflurescenza diretta con anticorpi monoclonali
MeriFluor Pneumocystis kit Meridian Bioscience Europe
Immunoflurescenza diretta con anticorpi monoclonali
Light diagnostics Pneumocystis carinii DFA, Chemicon USA
Immunofluorescenza indiretta con ac monoclonali
MonoFluo kit pneumocystis Bio-Rad laboratories
TRADITIONAL STAINS
 are less expensive
require less technical
expertise and quipment
 may allow the
identification of other
pathogens on the
specimen
MONOCLONAL ANTIBODY
STAINS
 clearly differentiate the P.
carinii organism
may be more sensitive,
particularly in specimens
with low numbers of
organisms
false positives are a
problem associated with
using the monoclonal
antibody stains.
Esame colturale Pneumocystis non si sviluppa in
sistemi di coltura continua in vitro
Ricerca di anticorpi
Non utilizzabile per la
diagnosi di pneumocistosi
ELISA con ac policlonali su Siero
Sensibilità 210ng ag
(McNabb, 1988)
Ricerca di antigeni Immunoblotting con ac monoclonali
(2G2) su BAL Aumento della
sensibilità
(Sethi, 1990)
Metodi non utilizzati a scopo
diagnostico
Metodi biomolecolari
Scopo: aumentare la resa diagnostica dei campioni clinici meno
invasivi (sputo indotto, lavaggio orale….)
Gene targets
Single copy genes

Dihydropteroate synthase (DHPS)
 Tymidylate synthase (TS)

Internal trscribed spacer (ITS)

5S rRNA

18S rRNA
Multicopy genes

Mitochondrial large subunit rRNA (mt LSU
rRNA)

Mitochondrial small subunit rRNA (mt sSU
Lane S: Standard dei pesi
molecolari
Lane 1: PCR a singolo step con
primer pAZ102-E/pAZ102-H,
banda di amplificato di 346bp
(Wakefield, 1990)
Lane 2: nested PCR con ITS primer
1724F/ITS2R per il primo step
ITS1F/ITS2R1 per il secondo step,
banda di amplificato di 550bp.
(Lu, 1995)
1.
Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER, Hopkin JM.
Amplification of mitochondrial ribosomal RNA sequences from Pneumocystis carinii of
rat and human origin. Mol Biochem Parasitol 1990;43:69-76.
2.
Lu JJ, Chen CH, Bartlett MS, Smith JW, Lee CH. Comparison of six different PCR
methods for detection of Pneumocystis carinii. J Clin Microbiol 1995;33:2785-2788.
Metodi biomolecolari
Significatività della ricerca del DNA nel BAL mediante
PCR
PCP
clinicamente
evidente
Assenza di segni
clinici evidenti
HIV-
Valore
altamente
predittivo
Non predittivo
(17% positivi con
nested PCR senza
sviluppo della
malattia, Sing 2000)
HIV+
Semplice
colonizzazione o
fase precoce di
malattia?
Consigliato un
attento monitoraggio
Metodi biomolecolari
Sensibilità delle metodiche di ricerca del DNA con PCR su
altri campioni clinici
IS  Maggiore rispetto ai metodi di microscopia classica
(Wakefield 1990, >95% con mt LS rRNA primers)
OW  Maggiore rispetto ai metodi di microscopia
classica (Wakefield 1990, 56-78%. Fischer 2001, 91% con MSG
primers)
Bassa se la colonizzazione polmonare è scarsa (Matos, 2001)
Siero  Risultati contraddittori con sensibilità da 0 a
100%
Kit Commerciale per PCR
PNEUMO KIT (AB Analitica)
Kit completo per
 Estrazione del DNA da BAL, altri campioni respiratori
o tessuti fissati e inclusi in paraffina
Amplificazione (Gene target: rRNA 5S)
Elettroforesi su gel di agarosio: amplificato di 120pb
Controllo interno di amplificabilità (β-globina)
Controllo positivo
M-PCR Kit Maxim Biotech San Francisco USA
Lane M: Standard
dei pesi molecolari
Lane 1: Controllo
negativo
Lane 2: controllo
positivo
Lane 3: Clamydia
pneumoniae
Lane 4:
Mycoplasma
pneumoniae
Multiplex-PCR
Lane 5:
Pneumocystis carinii
Lane 6: Legionella
pneumophyla
Quantitative TouchDown Real Time PCR
Sonde FRET
MSG primers
Campioni OW
cut-off a 50 copie DNA per tubo
distingue fra infezione e colonizzazione
(Larsen 2004)
Campioni BAL
cut-off a 103 copie DNA per tubo
distingue portatori da pazienti con PCP
(Flori 2004)
Metodi biomolecolari
Vantaggi
Svantaggi
Aumento della sensibilità Stadio sperimentale
Elevata specificità
Mancanza di metodi
standard riconosciuti a livello
internazionale
Utile per i pazienti che
non possono sopportare
procedure invasive
Possibili risultati positivi di
difficile interpretazione
Metodi di biologia molecolare
scopi epidemiologici
Ritrovamento di DNA di P.carinii nelle stanze di pazienti
infetti e nell’ambiente esterno ciclo vitale al di fuori
dell’ospite?
Studi di tipizzazione genomica
Esiste un genotipo prevalente Diversa virulenza dei
genotipi?
E’ possibile la coinfezione con diversi genotipi
Recidiva entro tre mesi Stesso genotipo
Recidiva dopo più di sei mesi Genotipo diverso
Epidemiologia delle infezioni da
P. jiroveci
Distribuzione territorialmente differenziata
degli stipiti
Stipiti isolati dai pazienti:
 Non corrispondono al genotipo prevalente
nella regione di nascita
Corrispondono al genotipo prevalente nella
regione dove si è manifestata la malattia
Evaluating Pneumocystis airborne
transmissibility between hosts with PcP,
carriers and susceptible hosts
?
?
•Pneumocystis DNA was detected in healthcare
contacts of PcP patients
Vargas et al, 2000, JCM 38 - 8; Miller et al, 2001, JCM 39