LABORATORIO DI
ANALISI DEI FARMACI
Prof. Carlo Bertucci
Prof. Roberto Gotti
Prof.ssa Rita Gatti
Prof.ssa Anna Maria Di Pietra
Prof.ssa Manuela Bartolini
Dott.ssa Jessica Fiori
Argomenti di tesi
• Screening di composti naturali o sintetici di interesse farmaceutico
• Interazione farmaco-proteina
• Interazione proteina-proteina
• Studi di aggregazione proteica
• Caratterizzazione stereochimica di farmaci chirali
Tecniche analitiche utilizzate
• Cromatografia HPLC
• Gas cromatografia (GC)
• Elettroforesi capillare (CE)
• Biocromatografia (HPALC)
• Spettroscopia UV / Fluorimetria
• Spettrometria di massa (MS)
• Dicroismo circolare (CD)
•Biosensore ottico (SPR)
(M. Bartolini)
Scopo della Tesi
Individuazione di nuovi composti di
interesse farmaceutico
Prodotti di
sintesi
In collaborazione con
gruppi di ricerca
UniBo, di altre
università italiane o
europee o
statunitensi
Prodotti
naturali
Drug
discovery
Composti potenzialmente utili per il trattamento la malattia di Alzheimer.
Bersagli molecolari considerati:
enzimi colinesterasici (AChE, BuChE), peptide beta-amiloide
Caratterizzazione del profilo di attività di
composti di interesse farmaceutico
Saggi con enzima/proteina
in soluzione
Saggi con enzima/proteina
immobilizzata
Saggi fluorimetrici o
spettrofotometrici
HPLC
- Potenza inibitoria (target enzimatico o peptidico)
- Meccanismo d’azione
- Cinetica di azione
(C. Bertucci)
Parametri ADME
Studio della farmacocinetica di un farmaco:
A
D
M
E
Assorbimento
Distribuzione
Metabolismo
Escrezione
Solo la frazione libera del farmaco può legare al target
Metodi analitici
Biocromatografia (HPALC)
140000
2,05
Abs (uAU)
110000
80000
3,71
50000
20000
-10000
0
1
2
3
4
5
6
•
•
•
•
Frazione del farmaco legato
Legame enantioselettivo
Parametri di legame
Interazioni tra farmaci
•
•
•
•
•
Configurazione assoluta del farmaco
Legame enantioselettivo
Parametri di legame
Interazioni tra farmaci
Cambi conformazionali della proteina
-40000
Time (min)
Dicroismo circolare (CD)
1/ 1 /0
1/ 1 /0.5
1/1/1
1/1/2
1/ 1 /4
1/1/6
1/1/8
Biosensore ottico (SPR)
• Specificità di legame (Yes/No reponse)
• Concentrazione attiva dell’analita nel
campione
• Parametri cinetici dell’interazione (kon , koff )
• Affinità di legame tra analita e target (kD)
Caratterizzazione stereochimica
(R. Gotti)
1a linea: Elettroforesi capillare (CE)
-Il principio di separazione (elettroforesi zonale)
offre selettività ortogonale e alternativa rispetto
a HPLC e GC e permette separazioni di campioni
complessi.
Es: Analisi di estratti di interesse fitochimico
-analisi di acidi fenolici e alcammidi in E.
purpurea (areale Nord America)
-analisi di estratti bioattivi di H. indicus (India)
-analisi di polifenoli in Tea sinensis (Asia)
Complesso proteina (AT) - eparina
cynarine
echinacoside
cichoric
chlorogenic
caffeic
caftaric
320 nm
1
0
1
2
3
4
5
260 nm
6 7
min
8
9
10 11
Studio di interazione farmaci (es. eparina)
e proteine (es. ATIII)
La tecnica permette di osservare e misurare l’entità di
Interazione sfruttando la variazione di mobilità del complesso
proteina (peptide)-farmaco.
40 μM
30 μM
20 μM
AT
Kd = 4.07 ± 0.68 µM; r2 = 0.90
AT
10 μM
3.5 μM
AT
AT
0 μM
0
2
4
6
8
10
12
14
min
Si può stimare la
forza di
di legame, utile
alla comprensione
dell’azione del
farmaco
2a linea: Gas Cromatografia-Spettrometria di massa
- Il campionamento Solid phase microextraction (SPME) offre la possibilità di ampliare le applicazioni GC-MS
Estrazione SPME
Alla colonna GC-MS
per la separazione
analisi
Desorbimento
termico
4 21.49
1.51 6.78
35
18.44
3
6
30
16.76
25
2
1 14.06
5
20
9.86
15
10
3.72
23.48
11.91
5
00
5
10
15
20
25
Analisi di sostanze
aromatizzanti in
alimenti, cosmetici,
etc… utili nella
caratterizzazione e
controllo qualità del
prodotto
Food Odorants:
9
8
32.91
31.24
7
42.53
33.3238.50
46.51
30
35
ed
40
45
50
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1,5-octadien-3-one
Linalol oxide
Heptadienal
Linalol
Nonadienal
Menthol (IS)
β-damascenone
β-damascone
β-ionone
Time (min)
butirrico
100
14,21
80
valerico
15,50
d8-butirrico
Campione
biologico
60
40
acetico
20
12,01
0
10
11
12
14,72
propionico
13,13
13
14,11
14
15
16
17
18
Analisi di metaboliti (es.
acidi grassi, SCFA) in
campioni biologici per la
caratterizzazione del
profilo metabolico utili
nello studio di patologie e
comprensione degli effetti
dello stile di vita sulla
salute
(J. Fiori)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA E GASSOSSA
INTERFACCIATE ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA e
UV-Vis (LC-MS, GC-MS, HPLC-UV):


DRUG DISCOVERY e CONTROLLO DI QUALITÁ
Caratterizzazione, determinazione, dosaggio, stabilità di farmaci, composti naturali e
molecole bioattive
ANALISI DI MATRICI COMPLESSE
Formulazioni farmaceutiche, estratti cellulari e vegetali, fluidi biologici, metaboliti
fecali
BIOMARKERS IN ESTRATTI CELLULARI
QUANTITATION
IDENTIFICATION
TECNICHE ANALITICHE COMBINATE (LC-MS,
MALDI-MS and GC-MS) in:
ANALISI DI PEPTIDI E PROTEINE
biomarkers, interazioni proteina-proteina, mutazioni proteiche, acetilazioni e
isoforme.
AGGREGAZIONE PROTEICA E INIBIZIONE (Amyloid-beta 1-42, 1-40, 25-35)
MALDI-TOF
LC-ESI-QTOF
+ Myr
ESI-IT MS
120
100
-Myr
+Myr
80
60
t1/2:
-Myr 12h | +Myr 75h
40
20
0
0
25
50
75
100
125
150
175
Time (h)
- Myr
Monomer Area / IS Area %

TECNICHE ANALITICHE COMBINATE (LC-MS,
MALDI-MS and GC-MS) in:

METABOLOMICA
Determinazione di metaboliti fecali in studi comparativi di metabolomica sul
microbiota intestinale umano, quali marker della salute dell’ospite.
STUDY CASE: ANDAMENTO MICROBIOTA INTESTINALE E METABOLITI IN BAMBINI CON
TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI ALLOGENICHE
Informazioni pratiche
• Durata della tesi: è 6 mesi di lavoro sperimentale
• Liste di attesa: sono variabili, per maggiori info
contattate direttamente i relatori
• Sarete seguiti da un tutor durante tutto il progetto
di tesi
• Non è necessario aver fatto prima il tirocinio
• Avere sostenuto il maggior numero di esami prima
della tesi è un vantaggio (soprattutto per voi )
LABORATORIO
DI ANALISI DEI FARMACI
Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie
via Belmeloro 6, 40126 Bologna
Prof. Carlo Bertucci [email protected]
Prof. Roberto Gotti
[email protected]
Prof.ssa Rita Gatti
[email protected]
Prof.ssa Anna Maria Di Pietra [email protected]
Prof.ssa Manuela Bartolini [email protected]
Dott.ssa Jessica Fiori [email protected]