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Fluorescenza in stato
stazionario
M+hn
Condizioni fotostazionarie
k
d M 
M+hn’
k
 k M   (k  k )M   0
M*
dt
k
M
k M   (k  k )M 
M   k  k 
A
*
r
*
A
r
nr
nr
*
A
st
*
st
M st
r
nr
A
(k r  k nr )
st
A
 
I st  k r M * st  k r k A M st  cost.
I st  k r  
•Si raggiunge (in pochi ns) una condizione di equilibrio, in cui è eccitata una frazione costante di
fluorofori.
•L’intensità di fluorescenza è costante e proporzionale alla resa quantica.
•Con le normali intensità delle lampade, questa frazione è sempre prossima a 0 (kA dipende dal
flusso di fotoni)
Il fluorimetro
Beam splitter
Lampada
lecc.
Monocromatore
di eccitazione
Lente
Campione
lem.
Lente
Monocromatore
di emissione
Computer
PMT
“riferimento”
PMT
“segnale”
I
Strumentazione
Fluorescenza in stato
stazionario
Sorgente
Lampada ad arco
ad alta pressione di xeno
• L’elevata tensione applicata agli
elettrodi provoca una corrente.
• Il flusso di elettroni, urtando gli
atomi del gas, li ionizza o li
eccita.
• Il decadimento o la
ricombinazione ione-elettrone
generano l’emissione di luce.
•
•
•
Lampada Xe (ozone-free)
Ad alta pressione (20-300 Atm). Può esplodere (non
implodere).
Gli impulsi ad alta tensione (40000 V) necessari per accenderla
possono danneggiare l’elettronica. Va accesa per prima.
La lampada è in quarzo, per permettere il passaggio degli UV.
Questa radiazione però ionizza le molecole di ossigeno
dell’aria, che a loro volta generano ozono (che va rimosso per
non danneggiare l’ottica). Se la radiazione nel lontano UV non è
necessaria, si aggiunge all’involucro uno strato in grado di
bloccare questa radiazione (lampade ozone-free, molto comuni
nei fluorimetri).
Il picco a 467 nm viene comunemente utilizzato per calibrare il
monocromatore di eccitazione.
0.1
Intensità (u.a.)
•
0.01
0.001
0.0001
200
467nm
300
400
500
l(nm)
600
700
800
Rivelatore
Rivelatore della fluorescenza
effetto fotoelettrico
Rivelatore della fluorescenza
tubo fotomoltiplicatore (PMT)
•Effetto fotoelettrico
•Emissione secondaria
•I fotocatodi sono realizzati utilizzando metalli alcalini o semiconduttori.
•L’efficienza fotoelettrica non è costante con l.
Il PMT può rivelare un singolo fotone (106 e- per fotone)
Rivelazione analogica
Rivelazione digitale
Rivelazione analogica
Rivelazione digitale
Rivelazione digitale: maggiore sensibilità, intervallo dinamico più ristretto.
Rivelazione digitale
Sovrapposizione di impulsi
Durata impulsi 10-9-10-8 s
Limite superiore 105-106 cps
S
n

 n
N
n
Per n=10000, S/N=100
Limite inferiore 103-104 conteggi
Si può aumentare la sensibilità semplicemente aumentando
il tempo di integrazione
Distribuzione di Poisson
• Consideriamo un fotomoltiplicatore esposto ad una sorgente di
intensità costante.
• L’emissione (e la rivelazione) sono processi casuali.
• Qual’è la distribuzione di probabilità dei fotoni rivelati in t secondi?
• Definiamo Pn(t) come la probabilità che in un tempo t vengano
rivelati n fotoni. È questa la distribuzione che cerchiamo.
• Definiamo k in base alla seguente equazione (sviluppo in serie):
P1(dt)=kdt+o(kdt)kdt
• Avremo P0(dt)=1-kdt
• Calcoliamo ora la probabilità di non rivelare fotoni in un intervallo in
un intervallo finito t.
Distribuzione di Poisson
Per rivelare 0 fotoni in un tempo t, deve averne rivelati 0 nel tempo t-dt e 0 nel tempo dt
P0 (t )  P0 (t  dt ) P0 (dt )  P0 (t  dt )1  kdt   P0 (t  dt )  P0 (t  dt )kdt
P0 (t )  P0 (t  dt )   P0 (t  dt )kdt
P0 (t )  P0 (t  dt )
 kP0 (t  dt )
dt
P (t )  P0 (t  dt )
lim 0
 lim  kP0 (t  dt )
dt  0
dt  0
dt
dP0 (t )
 kP0 (t )
dt
dP0 (t )
 kdt
P0 (t )
LnP0 (t )  LnP0 (0)  kt
LnP0 (t )  Ln1  kt
LnP0 (t )  kt
P0 (t )  e  kt
Distribuzione di Poisson
Troviamo ora un’equazione analoga per Pn(t)
Pn (t )  Pn (t  dt ) P0 (dt )  Pn 1 (t  dt ) P1 (dt )
 Pn (t  dt )(1  kdt )  Pn 1 (t  dt )kdt
 Pn (t  dt )  Pn (t  dt )kdt  Pn 1 (t  dt )kdt
Pn (t )  Pn (t  dt )   Pn (t  dt )kdt  Pn 1 (t  dt )kdt
Pn (t )  Pn (t  dt )
  k Pn (t  dt )  Pn 1 (t  dt )
dt
Pn (t )  Pn (t  dt )
 lim  k Pn (t  dt )  Pn 1 (t  dt )
dt  0
dt  0
dt
lim
dPn (t )
  k Pn (t )  Pn 1 (t )
dt
dPn (t )
 kPn (t )  kPn 1 (t )
dt
Quest’equazione differenziale lega Pn a Pn-1. Grazie ad essa ed al
fatto che conosciamo P0, possiamo trovare la funzione di
distribuzione.
Distribuzione di Poisson
Integriamo l’equazione differenziale, moltiplicando per ekt
dPn (t )
 kPn (t )  kPn 1 (t )
dt
dP (t )
e kt n  kekt Pn (t )  kekt Pn 1 (t )
dt
de kt Pn (t )
 kekt Pn 1 (t )
dt
t
e kt Pn (t )  Pn (0)   kekt' Pn 1 (t ' )dt '
0
t
e Pn (t )   ke Pn 1 (t ' )dt '
kt
kt '
0
Pn (t )  ke
 kt
P2 (t ) 
P1 (t ) 
t
 ke kt  e kt ' P0 (t ' )dt ' 
 ke
 kt
t
kt '
e
 P1 (t ' )dt ' 
0
0
t
t
 ke kt  e kt 'e  kt 'dt ' 
 ke kt  e kt 'kt ' e  kt 'dt ' 
0
0
t
 ke kt  dt ' 
2  kt
k e
 t ' dt ' 
0
0
 kte kt
t
t 2  kt (kt ) 2  kt
k
e 
e
2
2
2
t
kt '
e
 Pn 1 (t ' )dt '
0
n
(kt )  kt
Pn (t ) 
e
n!
Distribuzione di Poisson
Calcoliamo la media
j 
n 
(kt ) n  kt
(kt ) n 1
(kt ) j
 kt
 kt
n(t )   nPn (t )   n
e  e kt 
kte 
 kte kte kt  kt
n!
n0
n 1
n 1 ( n  1)!
j  0 ( j )!
n
n
k rappresenta il rate (medio) di rivelazione di fotoni!
Calcoliamo la deviazione standard
 n2  n 2  n
2
n 2  n 2  n  n  n 2  n  n  n(n  1)  n
 n2  n(n  1)  n  n  n(n  1)  kt  (kt ) 2
2
n
n 
(kt ) n  kt
n(n  1)   n(n  1) Pn (t )   n(n  1)
e 
n!
n0
n2
e
 kt
j 
(kt ) n  2
(kt ) j
2  kt
(kt ) 
(kt ) e 
 (kt ) 2 e  kte kt  (kt ) 2
n  2 ( n  2)!
j  0 ( j )!
2
n
 n2  n(n  1)  kt  (kt ) 2  (kt ) 2  kt  (kt ) 2  kt  n
Media e deviazione standard sono uguali!
Se n è il numero medio di
conteggi al secondo:
S
n

 n
N
n
Il rapporto segnale-rumore
aumenta con la radice di n