CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO AA 2011-12
Titolare del corso: Adriana Maggi
LEZIONE 8
Ingegneria cellulare:
Metodi di manipolazione del genoma cellulare
Valeria Benedusi
Ingegneria Cellulare
Modificazione del genoma di cellule in coltura
mediante mutazioni del genoma stesso o
integrazione di DNA esogeno
Finalità dell’ingegneria cellulare
applicate alla farmacologia
•Identificazione di bersagli di farmaci
•Screening di farmaci
•Produzione di proteine terapeutiche
•Terapia cellulare
TRANSFEZIONE II
Metodo ideale:
alta efficienza di trasferimento del
materiale genetico
bassa tossicità per le cellule
riproducibilità in diversi esperimenti
Applicazioni
•Studio di struttura e funzione di geni
•Studio dei meccanismi di regolazione
dell'espressione genica
•Produzione di proteine su larga scala
•Produzione di modelli animali per ricerca
•Terapia genica
La scelta del sistema cellulare 1.
• coltura primaria
• cellula immortalizzata
• linea tumorale
Scelta del sistema cellulare 2.
1. Facilità di coltura e stabilità
2. Efficienza di transfezione
3. Modificazioni post-traduzionali
4. Espressione di fattori di regolazione
dell’espressione genica
5. Facilità di analisi immunologica o di
purificazione della proteina (espressione
di proteine omologhe)
Scelta del vettore per ingegneria
cellulare
La scelta del vettore
Determinata dal tipo di sistema che si
vuole generare:
1. iperespressione proteica
2. espressione regolata per lo studio della
funzione del gene, per produzione limitata
nel tempo
3. studio della regolazione della
espressione di un gene
VETTORE IDEALE
• Tropismo di espressione: per garantire la
localizzazione del transgene sia a livello
trasduzionale (il vettore raggiunge cellule
specifiche) che a livello trascrizionale (il
gene viene espresso solo in alcune cellule).
• Durata di espressione: per far sì che la
terapia duri nel tempo.
• Livello di espressione: possibilmente
regolabile.
• Efficacia clinica: test funzionali su modelli
animali.
• Scarsa tossicità.
VETTORI PER TERAPIA GENICA
Vettori virali:
•
•
•
•
•
Adenovirus
Retrovirus
Virus adeno-associati
Lentivirus (derivati da HIV)
Herpesvirus
•
•
•
•
Plasmidi nudi
Elettroporazione in vivo
Liposomi
Ammine, proteine cariche positivamente
Vettori non virali:
Vettori per ingegneria cellulare
sequenze per la replicazione in procariote
Cassetta di espressione

Polylinker

Promotore (virale, tess. specifico,inducibile , ecc.)

Modificazioni posttrascrizionali (Siti
di:
terminazione della trascrizione; poliadenilazione; segnali di
splicing

)
Marcatori di selezione
Vettori di espressione: il vettore pCI-neo
E.Coli ori
Amp resistenza
Promotore
virale
Introne chimerico
Polylinker
Poliadenilazione
Neo resistenza
Promotore
T7 pol
Promotore
T3 pol
Poliadenilazione
Origine di replicazione
del fago f1
Promotore virale
T-antigen e cellule COS.
L’uso di cellule COS consente di
ottenere alti livelli di espressione
di proteine esogene senza l’utilizzo
di promotori virali forti. Il gene è
clonato in un plasmide che include
l’origine di replicazione virale di
SV40. Le cellule Cos contengono,
nel loro genoma, il gene codificante
per il T-antigen, una proteina che
riconosce l’origine di replicazione di
SV40 e stimola una massiccia
replicazione del plasmide.
Promotori inducibili: il sistema Tet-on/Tet-off
Utilizzando il sistema di regolazione trascrizionale
dell’operone responsabile della tetraciclina-resistenza
di E. coli è possibile regolare l’espressione di un
transgene.
Il sistema è composto da un transattivatore
chimerico che lega il tet-responsive-element
TRE espresso in modo costitutivo (promotore
virale o tessuto-specifico)
Il gene la cui trascrizione deve venire regolata
è sotto il controllo di un promotore contenente
TRE
Il sistema Tet-on/Tet-off
E’ necessario cotransfettare un plasmide contenente il fattore
di regolazione ed un plasmide contenente il transgene sotto il
controllo trascrizionale di un promotore responsivo alla
tetraciclina.
pCMV
tetR
VP16
Tet-OFF
pCMV
rtetR
VP16
Tet-ON
Transcription
TRE
Pmin CV
Gene of interest
Plasmidi
codificanti per
l’elemento di
regolazione
Plasmide
contenente il
transgene
Il sistema Tet-off
basato sulla produzione della proteina transattivante tTA
(tetracycline-controlled transactivator protein)
è represso in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina
In presenza di
tetraciclina tTA si stacca
da TRE e il gene non è più
trascritto
Il sistema Tet-On
basato sulla produzione della proteina transattivante rtTA
(reverse tetracycline-controlled transactivator protein)
è indotto in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina
In presenza di
tetraciclina rtTA si lega a
TRE e il gene viene più
trascritto
Scelta della tecnica di transfezione
Metodi biochimici
Coprecipitazione con calcio fosfato
Adsorbimento mediante DEAE-destrano
Lipofezione
Metodi fisici
Elettroporazione
Microiniezione
Infezione con vettori virali
Coprecipitazione con calcio fosfato
La coprecipitazione di aggregati calcio fosfato-DNA
sulla superficie cellulare favorisce l’internalizzazione
Vantaggi:
Svantaggi:
dell’acido nucleico
Molto semplice
Buona efficienza (5-40%)
Piuttosto riproducibile
Economico
Tossicità cellulare
Tecnicamente delicato, sono
determinanti:
Taglia e dimensioni del precipitato
Variazioni anche minime del pH
Non funziona con alcuni tipi cellulari
DEAE-destrano
Primo metodo utilizzato per l’introduzione massiva di DNA
in un cellula eucariotica
Destrano: polisaccaride costituito da unità di D-glucosio che
associato a gruppi carichi positivamente DEAE
(dietilamminoetile)
è in grado di legare i gruppi fosfato carichi negativamente del
DNA e di mediarne l’ingresso attraverso le membrane
(endocitosi). Le cellule vengono preparate mediante shock
osmotico con glicerolo o DMSO
Vantaggi: molto semplice
Svantaggi: poco efficiente
(elevata degradazione DNA,
scarsa penetrazione nel nucleo)
solo trasfezioni transienti
utilizzato in cellule
ad elevata attività endocitotica
Lipofezione
Trasferimento di DNA mediato da liposomi
In particolari condizioni è possibile
ottenere liposomi contenenti DNA
DNA
DNA
Buona efficienza
La struttura del doppio
strato fosfolipidico
facilita la fusione con la
membrana cellulare ed il
rilascio del DNA nel
citosol
Scarsa citotossicità Riproducibilità
Lipofezione
Metodica vantaggiosa :
• il DNA viene rilasciato efficientemente in diversi tipi cellulari
• i liposomi sono semplici da utilizzare in quanto non richiedono
apparati o accorgimenti particolari
Lipofezione con reagenti lipidici neutri
I liposomi sono delle sfere di
membrane sintetiche che possono
essere riempite con DNA. Esse
fondono spontaneamente con le
membrane cellulari rilasciando il
loro contenuto nel citoplasma. Sono
disponibile commercialmente dei kit
per la semplice preparazione dei
liposomi.
Lipofezione con reagenti lipidici cationici
(LipofectamineTM, OligofectamineTM, CellfectinTM)
Reagenti lipidici cationici in soluzione acquosa formano piccoli
(100-400 nm) liposomi unilamellari. La superficie carica
positivamente attrae il DNA (-). Il DNA non è propriamente
“incapsulato” nel liposoma ma piuttosto legato alle sue
superfici. Ogni plasmide si lega a 2-4 liposomi.
L’internalizzazione del costrutto è via endosomi e lisosomi.
Lipofezione con reagenti dendrimerici attivati
Particolari reagenti commerciali, definiti dendrimerici,
possiedono un’architettura sferica, che si ramifica radialmente
da un core centrale e termina con gruppi amminici ionizzati.
Tali reagenti complessano il DNA in strutture compatte
ottimizzando l’internalizzazione del DNA nella cellula.
Il complesso DNA-dendrimero possiede una carica netta di
segno positivo, che favorisce il legame a recettori con carica
negativa (ex. Glicoproteine sialilate). Una volta all’interno della
cellula, il reagente tampona il pH del lisosoma riducendo la
degradazione del vettore.
Transfezione con PEI
Macromolecola organica con elevata capacità di cariche positive:
ogni tre atomi c’è un gruppo amminico che può essere protonato
Il complesso PEI-DNA all’interno dell’endosoma si lega ai protoni
stimolando l’ingresso degli ioni cloro, questo porta alla rottura
dell’endosoma con conseguente rilascio del complesso nel
citoplasma
Vantaggi:
Svantaggi:
Favorisce il passaggio
nucleo-citoplasma
Economico
Tossicità cellulare
Efficienza non sempre elevata
Elettroporazione
Le cellule vengono concentrate,
miscelate con il DNA da transfettare e
collocate in una cella collegata a degli
elettrodi. Un breve impulso elettrico
apre in maniera reversibile dei “buchi”
nelle membrane cellulari. Il DNA entra
nelle cellule che vengono piastrate in
terreno fresco.
Vantaggi:
Minore esposizione a endonucleasi
Svantaggi: Alta % di cellule che non sopravvi-vono al trattamento
Adatta a cellule con membrane
particolarmente resistenti
Adatta a cellule in sospensione
Microiniezione
Elevata efficienza
(iniezione diretta nel
nucleo)
Impossibile applicazione su
larga scala
Grande manualità
dell’operatore
Applicazioni particolari
(topi transgenici, espressione di
mRNA in cellule di Xenopus laevis)
Microiniezione
Esempio: generazione di topi transgenici mediante
microiniezione di DNA nei pronuclei maschili
Iniezione di costrutti di
espressione lineari, che si
integrano sotto forma di
concatameri a partire dai
primissimi stadi di sviluppo.
Promotore Introne
1
CDS
2 3
ATG
4
Poly-A
5
*
• Dopo la microiniezione gli embrioni vengono reimpiantati in femmine
pseudogravide
• Gli animali nati da questi esperimenti devono essere analizzati per mezzo
di Southern blotting o PCR per valutare se il transgene si è integrato e in
quante copie.
•Gli animali transgenici (founders e/o loro discendenza) vengono
successivamente analizzati per valutare se il transgene si esprime in tutte
le cellule, ed eventualmente gli effetti fenotipici della sua espressione