La trasformazione batterica è la prima fase del progetto REpLAY, e
consiste nell’inserire all’interno di un ceppo di batteri E. Coli un
plasmide (segmento di DNA circolare) contenente un gene per la
resistenza ad un antibiotico, per fare in modo che resistano a loro
volta a questo antibiotico. Tutto ciò viene verificato a livello fenotipico
con la crescita dei batteri in un terreno solido contenente antibiotico,
a livello molecolare con l’elettroforesi, dopo la seconda fase, la
Miniprep di DNA. Questa fase si riassume nel seguente schema
(l’elettroforesi, non facendo parte di questa fase, non vi è inserita):
1
2
3
4
5
6
• Preparazione all’inserimento
del plasmide
• Inserimento del plasmide
• Shock termico
• LB
• LB + AMP
• Inoculi
Spostare le cellule competenti (E. Coli TOP 10 aliquotate) dal ghiaccio
secco al ghiaccio e tenerle in ghiaccio per un paio di minuti prima
dell’aggiunta del DNA.
Aggiungere 5μl di DNA plasmidico diluito 50 ng/l alle cellule. Incubare
poi in ghiaccio per 30 minuti.
Come mostra la foto a sinistra,
l’inserimento del plasmide deve
essere effettuata tenendo la
soluzione in ghiaccio. Non in
ghiaccio secco (-70°C) perché il
plasmide verrebbe ucciso, ma
neanche a temperatura
ambiente, perché verrebbe
denaturato.
La prova in negativo è una provetta all’interno del quale l’esperienza
non avrà sicuramente successo: questo vuol dire che i batteri al suo
interno non cresceranno a contatto con l’antibiotico. Per produrre
questo risultato non devono essere inseriti plasmidi nella provetta con
i batteri E. Coli, perché non deve avvenire la trasformazione.
Questa prova è utile a verificare che i batteri iniziali non fossero già
trasformati.
Lo shock termico è una rapida successione di un innalzamento ed un
abbassamento di temperatura. Esso apre dei pori nelle pareti delle
cellule per far entrare il plasmide. Le cellule competenti sono infatti
molto sensibili agli sbalzi della temperatura. Per innalzare la
temperatura dei batteri inserire le provette in un termo mixer per 40
secondi a 42°C.
Questo affollamento di
mani intorno al termo
mixer indica che le
provette vanno inserite
contemporaneamente
perché il tempo di
incubazione sia uguale
per tutti.
Appena estratte dal termo mixer, incubare le cellule in ghiaccio per due
minuti: i pori aperti con l’innalzamento della temperatura si richiudono.
Aggiungere 250l di terreno di coltura LB fresco senza antibiotici ed
incubare a 37°C per 42 minuti.
I batteri si riprendono dallo shock termico ed eseguono un ciclo di
riproduzione.
Piastrare le cellule trasformate ed il controllo negativo su piastre con
terreno di coltura LB con l’antibiotico Ampicillina. Aspettare una notte.
Le cellule trasformate correttamente cresceranno sul terreno selettivo
con l’antibiotico, perché hanno acquisito il plasmide contenente il gene
per la resistenza all’Ampicillina.
La prova in negativo, se le cellule batteriche utilizzate inizialmente non
erano già trasformate, non deve dare sviluppo di colonie: la piastra
resterà vuota.
Aspirare con una pipetta le colonie di batteri cresciuti durante la notte,
introducendole in una provetta.
Durante la notte i batteri trasformati correttamente si riproducono sul
terreno nella piastra, sviluppando delle colonie (le bollicine nella foto).