Le funzioni dei geni STM e WUS sono interconnesse
a vie di signaling ormonali
CITOCHININE
GIBBERELLINE
Diversi studi indicano che esiste una correlazione positiva tra
l’espressione/funzione dei geni KNOX e le CITOCHININE (CK)
CK promuovono la divisione cellulare e la morfogenesi
Piante overesprimenti KNOX hanno elevati livelli di CK
Piante con elevati livelli di CK overesprimono geni KNOX
e una correlazione negativa con le GIBBERELLINE (GA)
Le GA promuovono l’espansione cellulare e la crescita degli organi,
incompatibile con il mantenimento dell’omeostasi meristematica
STM reprime la sintesi di gibberelline nel SAM
Wt
GA
spy-1
35S::AtCKX3
spy-1,35S::AtCKX3
CK
inibiscono la crescita
del meristema
spy-1,35S::AtCKX3
spindly: attivazione
costitutiva GA
signaling
mutanti spindly con ridotti livelli di CK
(35S::AtCKX3) hanno bassa attività
meristematica
spy-1
Spy-1,35S::AtCKX3
crescita determinata del
meristema della
infiorescenza
wt
spy-1
spy-1;AtCKX3
Piante transgeniche di arabidopsis overesprimenti GR::STM (promotore inducibile)
GR= promotore del recettore dei glucocorticoidi
DEX= dexametasone
RTPCR
10gg 1mM DEX
STM nell’apice induce la sintesi di geni della biosintesi delle CK (IPT7)
e la sintesi di geni di della via di signaling (ARR5)
Piante transgeniche di arabidopsis overesprimenti STM (GR::STM)
RTPCR
STM nell’apice induce l’espressione di geni (GA2 ossidasi) che inattivano le GA
(da studi di espressione di GA2 ossidasi in mutanti wol: effetto non diretto ma mediato da CK )
In tabacco dimostrato che geni KNOX (STM) agiscono come repressori
trascrizionali del gene della GA20 ossidasi
La GA20 ossidasi è un enzima necessario alla di GA attive
Biosintesi delle Gibberelline (dalla GA12- aldeide)
GA20 ox
Via di Biosintesi delle GA
STM nel SAM attiva la biosintesi delle CK e reprime sintesi della GA20ox e
quindi la biosintesi delle GA e promuove l’attività meristematica.
CK attivano l’espressione di GA2ox stimolando l’inattivazione delle GA.
Il risultato è che le GA attive vengono confinate nelle foglie cotiledonari
GA2ox controls GA movement into the shoot meristem
OsGA2ox1
mRNA
GA4
Before the transition to
flowering, OsGA2ox1 is
expressed just below the
shoot meristem,
selectively excluding GA1
and GA4.
GA5
It has been shown in Lolium
that GA5 (which is resistant to
deactivation by GA2ox) can
move into the meristem despite
GA2ox activity.
Sakamoto, T., Kobayashi, M., Itoh, H., Tagiri, A., Kayano, T., Tanaka, H., Iwahori, S., and Matsuoka, M. (2001). Expression
of a gibberellin 2-oxidase gene around the shoot apex is related to phase transition in rice. Plant Physiol. 125: 1508-1516.
FUNZIONE DEL GENE WUSCHEL
Piante di arabidopsis overesprimenti WUS con promotore inducibile da etanolo
Espressione ectopica di AG::GUS
In risposta all’induzione di WUS (AGAMOUS= bersaglio di wuschel)
Microarray
STM
WUS
Alc::GUS
Alc::CLV3
ARR5 ARR6 ARR7
ARR15
t
RT-PCR
RT PCR
WUSCHEL
Reprime la trascrizione dei geni ARR5, ARR6, ARR7 e ARR15
che codificano per regolatori di risposta nel sistema a due componenti
attivato dalle citokinine
ARR5, ARR6, ARR7, e ARR15 agiscono come regolatori negativi della
risposta alle citokinine
MECCANISMO DI AZIONE DELLE CK
NETWORK REGOLATIVI PER IL MANTENIMENTO DEL SAM
SAM
NETWORK REGOLATIVO DI WUS
STIMPY (STIP/WOX9): necessario per l’aumento delle dimensioni del meristema
nel mutante clv3-2
ULTRAPETALA
HD-ZIP
Regolatori negativi di WUS
HANABA TARANU
AP2
SPLAYED (SYD) : regolatore diretto di WUS
(fattore di rimodellamento della cromatina)
INTERAZIONE TRA FATTORI DI TRASCRIZIONE E ORMONI NELL’APICE
MERISTEMATICO
FORMAZIONE DEL MERISTEMA APICALE
DELLA RADICE
L'ipofisi, nello stadio globulare tardivo si divide in due cellule, dando una cellula
superiore a forma di lente, e una cellula inferiore che va incontro subito ad una
divisione longitudinale. La cellula lenticolare si dividerà ulteriormente e formerà la
porzione interna del RAM, ovvero le 4 cellule del centro quiescente. Le due
cellule inferiori si divideranno sia longitudinalmente sia trasversalmente,
formando le iniziali della porzione apicale della cuffia radicale (o columella).
Apice radicale di arabidopsis
Il segnale di formazione del meristema apicale radicale è generato da
alti livelli di IAA nella regione basale del proembrione
Elevati livelli di IAA sono causati dal trasporto polare di IAA mediato dalle
proteine PIN
Espressione geni PIN
•
Espressi con diversa localizzazione in tempi diversi dello sviluppo
dell’embrione;
•
La sequenza di espressione, regolata temporalmente e spazialmente, è
responsabile della variazione della direzione del flusso di IAA durante
l’embriogenesi.
Trasporto di IAA nella radice
Massima concentrazione di IAA nelle iniziali della columella
Proteine PIN
PIN1 parte basale delle cellule del cilindro vascolare;
PIN2 estremità basale delle cellule corticali e
all’estremità apicale delle cellule epidermiche e della
cuffia laterale;
PIN3 espressa, senza polarità apparente,
in due file sovrapposte di cellule della
columella e nel periciclo;
PIN4 localizzazione non polarizzata nelle
cellule del centro quiescente e nelle cellule che
lo circondano, nonché all’estremità basale nelle
cellule provascolari;
PIN7 nelle membrane laterali e basali delle cellule
provascolari, nella zona di distensione e nelle cellule della
columella.
CENTRO QUIESCENTE (QC)
Nei meristemi del germoglio (SAM) e della radice (RAM) la popolazione
di cellule staminali è mantenuta grazie all’attività di un centro organizzatore
SAM: centro organizzatore specificato dal gene WUSCHEL
RAM: centro quiescente (QC); l’identità di QC è specificata dai geni
SHORT ROOT e SCARECROW
è richiesta anche l’espressione dei geni PLETHORA1 e PLETHORA2
Codificano per fattori di trascrizione di tipo AP2
 Sono espressi inizialmente nella regione basale dell’embrione, poi nel primordio
della radice e infine nel centro quiescente
CENTRO QUIESCENTE
Localizzazione determinata da massimo di concentrazione
di auxina
Espressione dei geni SHORT ROOT e SCARECROW
Espressione dei geni PLETHORA1 e PLETHORA2
SHORT-ROOT (SHR)
e SCARECROW (SCR)
Le proteine SHR sono prodotte nella stele e
traslocano nelle cellule adiacenti
Necessarie per la formazione ed il
mantenimento delle cellule staminali del CQ.
Attivazione espressione SRC
Geni PLETHORA (PLT)
•
Codificano per fattori di trascrizione di tipo AP2;
•
Richiesti per specificare l’identità delle cellule del QC e per il corretto
pattern di divisione delle cellule circostanti;
•
La loro espressione è controllata da MONOPTEROS;
•
L’espressione dei geni PLT è modulata e modula l’espressione dei
geni PIN.
PLETHORA
Mutanti plt1 e plt2 hanno alterazioni nel pattern di divisioni cellulari nel QC e
nella columella
Columella WT: 4 file di cellule la prima di staminali le altre differenziate
(accumulo granuli di amido)
Columella plt1: ulteriori file di cellule dovute ad aumento di divisioni nello strato 1
QC
WT
plt1-4
plt2-2
plt1-4 plt2-2
Mutazioni dei geni PLT riducono il numero di cellule meristematiche
e la lunghezza della radice
La columella contiene più cellule , la struttura a strati è alterata; si accumulano granuli
di amido anche negli strati che dovrebbero essere occupati da cellule staminali
La crescita della radice è ridotta
Il numero delle cellule meristematiche è molto ridotto
L’espressione del gene reporter cyclin-GUS (marcatore fase G2/M) è limitata
Sviluppo postembrionale
Zona meristematica
plt1-4 plt2-2
I geni PLT sono espressi nella regione basale dell’embrione nello
stadio globulare a 8 cellule
sono richiesti per specificare l’identità delle cellule del QC
cellula progenitrice
del QC
Ibridazione
in situ PLT1
Espressione di marcatori del centro quiescente nello stadio a cuore
(QC25)
WT
(QC46)
plt1-4 plt2-2
WT
plt1-4 plt2-2
La funzione PLT è richiesta nello stadio iniziale della determinazione dell’identità del QC
e per il corretto pattern di divisione delle cellule circostanti
PLT1 e PLT2 agiscono in parallelo con i geni SHORT ROOT/SCARECROW
nel pattern di specificazione del centro quiescente
SCR e SHR necessari per l’espressione dei marcatori del CQ (QC 25; QC46)
I domini di espressione di PLT1 PLT2 e SHR/SCR si stabiliscono in maniera
Indipendente
wt
plt1-4 plt2-2
Espressione di SHR::GFP
wt
plt1-4 plt2-2
Espressione di SCR::YFP
Ibridazione in situ PLT1
wt
scr-1
shr-1
3dpg
L’espressione dei geni PLT risponde a cambiamenti di distribuzione dell’auxina
e dipende dai fattori di risposta all’auxina (ARF)
Embrione nello stato di transizione
doppio mutante mp-G12 nph4-1
Ibridazione in situ
assenza di segnale per PLT1
Necessario doppio mutante per ridondanza proteine ARF
L’espressione di PLT è controllata dal gradiente di IAA determinato dalla
localizzazione di PIN e da MP;
Le proteine SHR sono prodotte nella stele e traslocano nelle cellule
adiacenti, dove attivano SRC;
Il centro quiescente è specificato nella zona d’intersezione dei domini
d’espressione dei geni PLT, SHR e SCR;
I pattern d’espressione di SHR, SCR e PLT definiscono le differenti
regioni;
In presenza dei geni PLT → SHR e SCR sono coinvolti nella
specificazione delle cellule staminali; in assenza di PLT → SHR regola il
differenziamento delle cellule derivate dalle staminali.
MODELLO
Le cellule che esprimono PLT SCR e SHR diventano QC
QC segnala alle cellule circostanti per mantenere l’identità meristematica
Esperimenti di ablazione con laser del centro quiescente
 alterazione dei flussi auxinici
 rimodulazione della espressione dei geni PLT (SHR, SCR, PIN)
 rispecificazione del centro quiescente
qc
DR5::GFP
SHR
SCR
ablati
qc
PIN1
PIN2
ablati
Ablazione: shift gradiente auxinico; espressione PLT; inibizione espressione PIN;
Loc nucleare di SHR; promozione espressione SCR
qc
Network regolativo nel meristema della radice
WOX5 è un omologo di WUSCHEL: contribuisce a mantenere le cellule del
CQ in srtato indifferenziato
CK nel meristema radicale
controllano la velocità di differenziamento delle cellule
meristematiche della radice e quindi le dimensioni del
meristema
Dimensioni del Meristema:
N° di 1 fila di cellule del cortex dal QC alla TZ
CK esogene riducono il numero di
cellule meristematiche senza influenzare
Le dimensioni del QC e della Columella
quindi senza influire sul loro potenziale
meristematico
Mutanti biosintetici per le CK o mutanti nella via di signaling hanno meristemi
più grandi
ahk3
Recettori per le CK (sistema a due componenti Istidina kinasi)
AHK4/CREI1/WOL
AHK3
AHK2
AHK3 è l’unico espresso in tutti i tessuti della zona di transizione
AHK3
ARR1 e ARR12 sono espressi solo nella TZ
ARR1
ARR12
MODELLO
UN SISTEMA A DUE COMPONENTI DI SIGNALING PER LE CK BASATO SU
AHK3/ARR1, AHK3/ARR12 MEDIA IL CONTROLLO DEL NUMERO DELLE
CELLULE MERITEMATICHE NELLA ZONA DI TRANSIZIONE
LE CK AGISCONO ANTAGONIZZANDO UN SEGNALE DI DIVISIONE
CELLULARE (AUXINA)
Applicazioni di auxina esogena alla radice incrementano le dimensioni del meristema
La riduzione di livelli di CK in tripli mutanti pin non ha effetto sullle dimensioni del meristema
CK attivano SHY2 che media la repressione dell’espressione delle proteine PIN
IAA media la degradazione tramite proteosoma di SHY2
IAA è il segnale per la divisione cellulare meristematica nella radice
SHY2 è una proteina AUXIAA
Controlla la biosintesi delle CK
Attraverso la IPT5
Gli effetti antagonistici tra IAA e
CK
Sono spiegati in base al conrollo
negativo da parte di CK sulla
distribuzione PIN-dipendente di
IAA
RBR: PROTEINA DEL RETINOBLASTOMA (antagonizza nei mammiferi la
funzione meristematica)
Mutanti di arabidopsis rbr loss of function mostrano divisioni cellulari in più e ritardo
del differenziamento della radice
L’overespressione di RBR causa differenziamento precoce
RBR proteina regolativa per il differenziamento nella radice
Non sono alterati i pattern di espressione di PLT, SCR, SHR
RBR agisce a valle di SCR/SHR; PLT
mutanti scr hanno livelli più alti di RBR
SAM/RAM
Le CK promuovono il mantenimento del meristema del germoglio
ma hanno la funzione opposta nel meristema radicale dove stimolano
il differenziamento nella zona di transizione
L’auxina è necessaria per la formazione del meristema radicale
ma nel meristema del germoglio promuove l’organogenesi
Sia nel germoglio che nella radice il mantenimento del meristema dipende
dal bilancio tra CK e auxina ma le risposte sono diverse nei due meristemi
Quali funzioni cellulari sono controllate dai due ormoni nei meristemi
del germoglio e della radice?
DIFFERENZIAMENTO DI CELLULE EPIDERMICHE NELLA RADICE
Le cellule epidermiche confinanti con lo spazio tra
due corticali diventano TRICOBLASTI
SE UN TRICOBLASTO VIENE RIMOSSO (ablazione laser)
L’ A TRICOBLASTO VICINO PRENDE IL SUO POSTO ( e viceversa)
IL DIFFERENZIAMENTO E’ DIRETTO DALLA INFORMAZIONE POSIZIONALE
Mediante l’analisi di mutanti identificati geni regolatori
per il differenziamento DEI TRICOBLASTI
WEREWOLF (WER) (myb)
regolatore negativo dell’identità tricoblastica
CAPRICE (CPC) (myb)
CPC regolatore negativo dell’identità atricoblastica
TTG1: TRANSPARENT TESTA GLABA1
GL3 : GLABRA3 (2) (1)
EGL3: ENHANCER OF GLABRA3
SCM: SCRAMBLED
CAPRICE: CPC
Modello regolativo per il differenziamento dei tricoblasti nella radice
LRR-RLK
CPC è espresso nelle cellule N nonostante il suo effetto inibitorio sul differenziamento
azione non-cell-autonomous del gene CPC
WER
Gl2 (+)
CPC
Gl2 (-)
ATRICOBLASTO
TRICOBLASTO