corso di Genomica a.a. 2010-2011
lezione 37-38
• laurea magistrale Biotecnologia
Industriale
giovedì 27 Gennaio 2011
aula 6A
orario : Martedì ore 14.00 - 16.00
Giovedì ore 13.00 - 15.00
Esami: 24 Febbraio, 3 Marzo, 23 Marzo
Lezioni fino al 10 Febbraio
D. Frezza
cluster Ig topo-uomo (duplicazione)
TOR VERGATA
centromero
a e
mta1 crip2 crip1 hole
Mouse Igh cluster
Chromosome 12
telomero
g2a g2b
g1
g3 d
m
trascrizione
mta1
J DV
Em
J
D
V
12F1
(cloni instabili)
BAC199M11(AF450245)
a2 e
mta1 crip2 crip1 hole
Human Igh cluster
Chromosome 14
g4 g2 g
a1 e g1 g3 d m
Em
mta1
J
D
V
14q32.33
IgH3’RR-1
J DV
3’a2
g elk 2.1
3’a1
hs4
hs1.2
hs3 20bp
a1
3’a1
86,035,000
IgH3’RR-2
86,040,000
86,050,000
86,055,000
elk 2.2
hole
85,894,500
86,045,000
85,904,500
85,914,500
85,924,500
86,060,000
86,065,000
86,070,000
hs4
hs1.2
85,934,500
85,944,500
86,075,000
hs3 20bp a2
85,954,500
3’a2
Differenti strutture: cosa cambia?
Tra topo ed uomo qualcosa cambia ma gli enhancers sono
gli stessi
Cambia l’architettura, ma non il tipo di funzione
- c’è stata una duplicazione, ma i geni (o esoni) delle
regioni costanti sono gli stessi, ci sono due catene “alfa” e
nel topo ce ne è una sola,
- ci sono due regioni regolative con 3 enhancers anziché 4
- resta la regione palindromica
U
TOR VERGATA
perchè due 3’RR ? sono ridondanti
se nell’uomo ci sono due 3’RR ci sarà un motivo ?
3 domande + 1:
è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ?
nell’uomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di
campagna si allevano male)
- dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento
delle due 3’RR ?
- hanno tempi di attivazione diversi?
- si attivano e disattivano in fasi diverse della vita
del linfocita B?
?
Confronti RR nei mammiferi
Qu i c k T i m e ™ e u n
d e c o m p re s s o re T I F F (L Z W )
s o n o n e c e s s a ri p e r v i s u a l i z z a re q u e s t ' i m m a g i n e .
Palindrome interna duplicazione umana
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (LZW)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
duplicazione ma anche inversione dx - sin (speculare)
Confronto specie RR palindrome
Panda 13584bp
rabbit 14657
mouse 31827
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (LZW)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
dog 19442
La palindrome servirà a
qualcosa ?
Stiamo cercando strutture secondarie 3D
Ex-post : se c’è servirà
Ma in che modo? dalla struttura alla funzione
Topi transgenici deleti: delezione completa e delezioni parziali
TOR VERGATA
palindrome 3’RR
solo HS1.2 è polimorfica
gli enhancer HS3 ed HS4 non sono polimorfici
HS1.2 è centrale e sta all’interno di una duplicazione
non si conosce molto delle funzioni al di là delle regioni
conservate contenenti gli enhancers
le regioni intermedie sono poco conservate nelle specie
anche all’interno dei mammiferi
è possibile studiare le assoociazioni nell’uomo tra
polimorfismi, funzioni e patologie
se regola la risposta immunitaria
sul topo molti lavori indicano i meccanismi in cui la 3’RR si
inserisce: BCR expression, Ig germline transcription, class
switch, B cell maturation (molec e cell biol, topi transgenici)
nell’uomo lavori di biologia cellulare-molecolare confermano il
ruolo importante delle 3’RR, ma sono due invece di una
possibili differenze
sull’uomo si studiano i polimorfismi non possibili su topo
cosa sono i polimorfismi di HS1.2
polimorfismo HS1.2 umana
TOR VERGATA
a
chrms 14q32
V
E m d
g3 g1 e a1
D region j
g
g2
g4
e a2
HS3 HS1.2 HS4
HS3 HS1.2 HS4
3’RR-1
3’RR-2
EcoRI
b
enhancer HS1,2
centromere
*1
287 bp
*2
339 bp
*3
393 bp
*4
465 bp
Oct1
Sp1
NF-B
Oct1
*1
*2
*3
*4
18mer
---GGCACATGCAAATGG
---GGCACATGCAAATGG
---GGCACATGCAAATGG
---GGCACATGCAAATGG
core
*1
*2
*3
*4
CTTGCACGAT
T
CTTGCACGAT
CTTGCACGAT
T
CTTGCACGAT
T
T
CCCCCCGCCCCCTCCCCC--------------------------------------------------------------------------------------------------------CCCCCCGCCCCCTCCCCC----------------------------------------------------------------------------------------------------AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGG
CTCCACCTGCAGCTGCAGCCGCCACCCACC
----A
C
CCCCCCGCCCCCTCCCCC----------------------------------------------------------------------------------------------------29mer
NF-B
40mer
----Sp1
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGC
-------------------------------------------------AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGA CCCCCCCCCCCCAACAGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGC
-CACCCCCCGCCCCCTCCCC CA
AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGA CCCCCCCCCCCCAACAGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGC
C
CA
18mer
NF-B
40mer
NF-B
15mer
40mer
Sp1
*1
*2
*3
*4
NF-B
-------------------------------------------------------AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACACCCCCCGCCCCCTCCCCCAGGACA CAGG
- CACCCCCCCACCA
AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACACCCCCCGCCCCCTCCCCCAGGACA CAGG
CTCCAGATTCGGGGA
CACCCCCCCACCA
C
CTCCAGATTCGGGGA
AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACACCCCCCGCCCCCTCCCCCAGGACA CAGG
CACCCCCCCACCA
C
AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACACCCCCCGCCCCCTCCCCCAGGACA CAGG
CTCCAGATTCGGGGACA
C
12mer
40mer
18mer
End
A
TOR VERGATA
B
Selective amplification of HS1,2-B
downstream Ca2 (IgH3’RR-2)
Selective amplification of HS1,2-A
downstream Ca1 (IgH3’RR-1)
Poly A site
Poly A site
H
B
B
H*
B
E
B
BB
H
Ua1
a1m R1
R2
U2
R3
U5
U3
U4
U6
U8
U1 R1
R3 r
a2m
U7
Ub1
U5
UU
34
U2
HS 1,2
H
E
HS 3
HS 3
U1
B
R3
U8
R3 r
U6 U4-5
B
U7r R3r
Ub2
U6r U5r
HS 1,2
R4
SA2.5
5402 bp
HS 3
HS1,2
HS1,2
A2R
SA2.5
ALLELE 1A
HS1,2
P3Frw
ALLELE 2A
ALLELE 3A
4420 bp
A2R
EcoRI
A2F
D3Rev EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
HS1,2
D3Rev
ALLELE 3B
P3Frw
ALLELE 4B
ALLELE 4A
i polimorfismi
Core of enhancer HS1,2
External element - 31 bp
Repeated element - 38 bp
External element -17 bp
14bp
16bp 20bp Internal spacers
Conserved sequence Unit
6 alleli
TOR VERGATA
Figure 3 polymorphism of HS1,2A
CORE enhancer
17bp El.
38bp Rp
17bp El.
ALLELE *1A
END
HS1,2
287
14bp Sp.
ALLELE *2A
339
31bp El
20bp Sp.
ALLELE *2B
360
16bp Sp.
17bp El
14bp Sp
ALLELE *3A
393
31bp El
20bp Sp
ALLELE *3B
414
31bp El
20bp Sp.
20bp Sp
ALLELE *4
Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF;
MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-)
Sites for : SP1; IK2; MZF1
472
Sites for : AP4; E47; MYOD; mE5
Sites for : CMYB
Sites for : NF-kB
U
Polymorphism of the human a1 immunoglobulin gene 3’
enhancer HS1,2 and its relation to gene expression
TOR VERGATA
Immunology 2001, 103: 35-40
TOR VERGATA
synergism of HS3A-B-HS1,2-HS4
Symergic effects
HS fragments are able to synergize with Vk,VH,IgH germline promoters (g2b, g3, a,e) and non
Ig-prmoters (c-myc) so as to enhance the transcription activity in a tissue and stage specific
manner. (Ong et al, 1998)
SA2.5
Poly A
site
H B
a1
Ua1
B
U3 U5 R3
U1R1 R2 U4
U2
A
H* E
B
B
IgH3’RR-1
A2R
U6
R3r
U7 U8
HS3
U6r
HH
B
R4 U9 Ua4
U5r
Ua2
U
14
R6
R5
Ua3 R5
U11 U12 U13
U10
HS1,2
END OF
HOMOLOGY
WITH ALFA2
Alu
U15
LTR
U16
ELK2
K10
retrovirus
HS4
H
Ua5
clone CHR77 (35.616 kb)
Chromosome 14
m d
g3
g2
g
g1 e a1
g4
e a2
centromero
IgH3’RR-2
B
SF AL928742 (40 kb)
Poly A
site
H BB
E H
B
a2 R1 Ub1 U5 R3U4-5
U1 U
2
UU
34
HS3
SA2.5
U6
U
8r
U
7 R3
B
B
U6r Ub2 R4
U7r R3r U5r
HS1,2
A2R
U
9 Ub3
END OF
HOMOLOGY
WITH ALFA1
H H
R5 R6
R5 U U U
10 11 12
Alu
U13 U14
U15
LTR
Ub4
U16
HS4
A2F
TOR VERGATA
U
gel genomico e selettivo degli alleli
TOR VERGATA
CM11
M1
ALLELE
ALLELE
ALLELE
ALLELE
G
RR-1 RR-2
CM 4
G
RR-1 RR-2
CM 5
G
RR-1 RR-2
M2
4
3
2
1
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
amplificazione G=genomica o selettiva RR-1; RR-2
nell’amplificazione genomica si vedono gli alleli delle 2 regioni senza PCR
selettiva applicata invece per amplificare selettivamente A o B.
i due alleli *2a, *2b e *3a, *3B
amplificazioni da DNA genomico dalle due 3’RR senza selezione
allele *4
allele *3
allele *2a
allele *2b
allele *1
QuickTime™ and a
TIFF (LZW) decompressor
are needed to see this picture.
465 bp
393 bp
360 bp
339 bp
287 bp
avevamo visto che nel locus 3’RR-B l’allele *3 aveva
l’elemento 31mer rispetto al 17mer del locus 3’RR-A
adesso abbiamo (ho) visto che anche l’allele *2 esiste nelle
due forme con il 17mer ed il 31mer, cambiano le consensus!
U
TOR VERGATA
allineamenti
Evoluzione di HS1,2
in diverse specie di
mammifero e di primati
il core dell’enhancer è più
conservata (rosa) ed il
31mer (arancio) potrebbe
essere la forma ancestrale
stiamo cercando di clonare
le forme polimorfiche di
altre specie (topo macaco,
scimpanzè) per confrontare
la funzionalità in cellule di
topo e uomo
conservazione in altre specie
Homo s.; Gorilla; Orango; Homo s. allele 4; Cavia; Macaca;
Callitrix; Canis; Equus; Felis; Pteropus; Rattus; Mus; Bos; Sus;
Callicebus; Monodelphis (opossum);Capra; Gallus.
platirrine - catarrine 40 Mya
QuickTime™ and a
TIFF (LZW) decompressor
are needed to see this picture.
evoluzione della IgH 3’RR
strutture conservate di HS1.2
manca la sequenza di Panda uscita il 13 Dicembre 2009
species
allele 1 (Homo sapiens)
Cavia porcellus
Monodelphis domestica
Macaca mulatta
Bos taurus
Callicebus moloch
Callithrix jacchus
Canis familiaris
Capra hircus
Equus caballus
Felis catus
Gallus gallus
Gorilla gorilla
Mus musculus
Pan troglodytes
Pteropus vampyrus
Rattus norvegicus
Sus scrofa
core
x
x
17bp (5') 31bp (5')
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
17bp (3')
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
38 bp
low similarity
(wrong sequence)
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
TOR VERGATA
evoluzione di HS1.2
quali altre analisi ?
il polimorfismo si può studiare dal punto di vista funzionale
struttura e modelli in “silicio” (transcr. fact.; 3D models)
CHIP chromosome immuno-precipitation
EMSA electrophoretic mobility shift assay:
-incubazione della sonda con le consensus con estratti nucleari
-corsa elettroforetica
-competizione con anticorpi o con consensus che sottraggono la
formazione del complesso e fanno sparire il segnale