Promotori eucariotici
RNA pol I
trascrive rRNA
RNA pol II
trascrive mRNA per proteine
RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA
LE RNA POLIMERASI COME
RICONOSCONO I PROMOTORI?
Transcribed region
Promotore
-contiene sequenze
Specifiche per il legame della
polimerasi
FATTORI DI TRASCRIZIONE
• FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI)
- RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter”
• REGOLATORI SPECIFICI
- ATTIVATORI
- REPRESSORI
Basal factor
binding sites
Transcribed region
ELEMENTO
ENHANCER
ELEMENTO
DEL
PROMOTORE
PROSSIMALE
• Il legame promotore RNA polimerasi
richiede i fattori di trascrizione generali
Promotori
~200 bp
gene
COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE
ATTIVITA’
Reporter gene
100%
eg CAT, luciferase
Reporter gene
100%
Reporter gene
20%
Reporter gene
1%
Reporter gene
0%
COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE
ATTIVITA’
Reporter gene
100%
eg CAT, luciferase
Reporter gene
100%
Reporter gene
400%
Reporter gene
1%
Reporter gene
0%
Livello di trascrizione
attivato
basale
represso
Elementi del Core promoter
• siti di legame per I fattori di trascrizione generali
Che supportano un livello di trascrizione basale
La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla
Azione di fattori di trascrizione gene-specifici
Transcribed region
RNAP II
BRE
TATA-box
TATA
~24bp
Inr
DPE
8 bp elemento ricco in AT
Bound by TFIID
BRE
6 bp elemento ricco in purine
Bound by TFIIB
Inr
DPE Bound by TFIID
TFIIF
TFIIE
2 subunits
2 subunits
RNAP II
TFIIA
2-3 subunits
TFIIB
1 subunit
~40 polipeptidi
TFIID
12 subunits
10 subunits
TFIIH
9 subunits
RNAP II
BRE
TATA
TATA-box
8 bp AT
BRE
6 bp
Inr
~24bp
Inr
lega TFIID
lega TFIIB
DPE lega TFIID
DPE
QuickTime™ and a
YUV420 codec decompressor
are needed to see this picture.
QuickTime™ and a
Sorenson Video decompressor
are needed to see this picture.
Q ui ck Ti m e ™ an d a
V id eo M PE G- 4 d ec om pr es so r
a re ne ed ed t o s ee th i s pi c tu r e.
TFIIF
TFIID
TFIIA
TFIIB
BRE
TATA
~24bp
TFIIE
Inr
DPE
RNAP II
QuickTime™ and a
None decompressor
are needed to see this picture.
TFIID contiene la
TATA-Box Binding Protein
TBP
TFIID
TFIID e’ composta da vari
TBP Associated Factors
—TAFs
-aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo
L’elemento Inr
-legano i fattori di trascrizione gene specifici
-aiutano a decompattare la cromatina
TFIID
BRE
TATA
~24bp
Inr
DPE
TFIIA
TFIIA
BRE
TFIID
TATA
~24bp
Inr
DPE
-aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA
-interagisce con vari attivatori gene specifici
Aiutandoli a legarsi ai vari TAF
TFIIB
TFIID
TFIIA
TFIIB
BRE
TATA
~24bp
Inr
DPE
-si lega a TBP e richiama la polimerasi
-Partecipa alla selezione del sito d’inizio e
Stabilisce la direzione
TFIIF
TFIIF
TFIID
TFIIA
TFIIB
BRE
TATA
~24bp
Inr
DPE
RNAP II
Stabilizza il complesso di preinizio e induce
Una torsione nel DNA
TFIIE
TFIIF
TFIID
TFIIA
TFIIB
BRE
TATA
~24bp
Inr
DPE
RNAP II
TFIIE
Attira una elicasi ed insieme srotolano il
Promotore.
Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH
TFIIH
TFIIF
TFIID
TFIIA
TFIIB
BRE
TATA
~24bp
Inr
DPE
RNAP II
TFIIE
Fosforila una delle subunita’ della polimerasi
dando l’avvio alla trascrizione
— REGOLATORI GENE SPECIFICI
Transcribed region
SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE
Regolatori gene specifici
• hanno una struttura modulare
• contengono un dominio che lega il DNA
• contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale
• qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione
• qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione
(MADS box)
N
Donatore
H
H
O
C
Accettore
A
D
A
A
A
M
A
A
A
D
D
A
M
A
A
D
A
A
D
A
A
D
A
A
Regolatori gene specifici
1) Contengono un dominio che lega il DNA
2) E un dominio di attivazione trascrizionale
Transcribed region
Gli Attivatori come influenzano la
trascrizione di un gene distante molte
migliaia di nucleotidi?
DNA loop
Enhancers- stimolano la trascrizione
1. Attivatori si legano ad un sito specifico
2. Il DNA si ripiega
Enhancers- stimolano la trascrizione
Attivatori si legano ad
un sito specifico
Il DNA si ripiega
Si forma il complesso
nel promotore
Enhancers- stimolano la trascrizione
Attivatori si legano ad un
sito specifico
Il DNA si ripiega
Si forma il complesso
nel promotore
Si lega la RNA
polimerasi
Inizio della trascrizione
Controllo combinatoriale
dell’espressione genica
Con poche
proteine
regolatorie si
possono
controllare un
elevato numero
di geni
Diverse
combinazioni
producono
fenotipi
differenti
Heterodimerization of DNA binding proteins can alter
their sequence specificity
Enhancer e Repressori
promotore
enhancer
repressore
10-50,000 bp
RNAP
gene
enhancer
interagiscono con
RNAP
trascrizione
repressore previene il
legame dell’enhancer
Recettori nucleari
Fattori di trascrizione regolati da molecole
idrofobiche
• Cambio dell’attivita’
• Cambio della localizzazione cellulare
Recettori nucleari
Il legame del ligando causa cambiamenti
conformazionali
TAF
TBP
RNA pol II
TAF
TAF TAF
RGRACANNNTGTYCY
Nuclear Receptors
Legame dell’ormone
Dissociazione da hsp90
GR GR
GR GR
hsp90
hsp90
dimerizzazione
GR
GR
Migrazione nel nucleo
Legame al DNA
TATA
Regolazione mediante
fosforilazione
• Ormoni attivano
una chinasi
• La chinasi
fosforila un
fattore di
trascrizione
• Il fattore e’
attivato
Cascata delle chinasi
GF si lega al recettore - protein tyrosine
kinase
Il recettore dimerizza
Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase
kinase kinase)
MEKK
P
SEK
MEKK fosforila SEK – una MAP kinase
kinase
P
P
JNK
P
SEK fosforila JNK – una MAP kinase
Cascata delle chinasi
JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il
fattore di trascrizione C-JUN
C-JUN dimerizza with C-FOS per formare
AP-1
nucleo
P
AP-1 attiva la trascrizione legandosi a –
TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di
trascrizione generali
RNA pol II
JNK
P
P
C-JUN
C-FOS
TRE
QuickTime™ and a
None decompressor
are needed to see this picture.
Metilazione del DNA
• La citosina puo’ essere metilata:
• Risulta in una maggiore condensazione della cromatina
• La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del
cromosoma X
Trascrizione e struttura della
cromatina
• Il DNA nella cromatina condensata non e’
accessibile
• La cromatina condensata (eterocromatina)
e’ trascrizionalmente silente
• La condensazione della cromatina dipende
ANCHE dalla acetilazione degli istoni
Acetilazione degli Istoni
• E’ una modificazione post-traduzionale
• Gruppi acetilici (CH3COO–) legati
covalentemente a aminoacidi basici
Neutralizzano le cariche positive
• Eliminano le interazioni ioniche con il DNA
• Diminuiscono la condensazione
• Associati con una attiva trascrizione
– Acetilazione/Deacetilazione
QuickTime™ and a
YUV420 codec decompressor
are needed to see this picture.
Attivatori: acetilazione degli Istoni
• Alcuni attivatori attirano delle acetilasi
• Il macchinario di trascrizione puo’ accedere
al DNA meno condensato
Alcune Istone Acetilasi (HAT)
•
•
•
•
p300/CBP
TAF II 250
Ambedue sono dei co-attivatori
SAGA e’ a ponte tra un Fattore di
Trascrizione e la TBP
Repressori: deacetilazione degli Istoni
• Alcuni repressori attirano delle deacetilasi
• Prevengono l’accesso del macchinario di
trascrizione al DNA
– Acetilazione/Deacetilazione
SWI/SNF in Lievito
SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO
(accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio).
Queste proteine catalizzano il rimodellamento
ATP-dipendente del DNA
Macchinari di Rimodellamento
• Tutti contengono subunita’ simili a swi2/snf
• NTP-binding proteins
Regolazione dell’Espressione Genica
Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi:
NUCLEUS
CYTOSOL
inactive
mRNA
degradazione
DNA
RNA
transcript
trascrizione
mRNA
Maturazione
mRNA
trasporto
traduzione
protein
controllo
dell’attivita’
inactive
protein
Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o
legati alla membrana dallo stesso gene
• Lo splicing alternativo puo’
produrre due tipi di anticorpo
diversi con la stessa
specificita’
• Quando attivati dall’antigene i
linfociti B cominciano a
produrre anticorpi solubili
• Le forme secrete mancano
degli esoni 7 e 8 che
codificano per domini
idrofobici
L’RNA Editing altera le sequenze dei premRNA
Figure 11-39
• mRNA editing
Nel fegato
La deaminasi e’ presente
solo nell’intestino
Nell’intestino
Metodi per studiare
l’espressione dei geni
• Northern blot
• Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR)
• Ibridazione In situ
• Trascrizione In vitro
• DNA Microarray
Purificazione dell’RNA
• Procedura
– Lisi delle cellule con un reagente
che dissocia le nucleoproteine e
inibisce la RNAsi
– Rimozione delle proteine
– Precipitazione specifica dell’RNA
Northern blot
• Per determinare la dimensione e la
quantita’ di specifici mRNA
• Studi sull’espressione genica
Northern blot
– Elettroforesi dell’RNA in gel contenente
formaldeide per mantenere l’RNA in
forma completamente lineare
– Trasferimento dell’RNA su una
membrana
– Ibridazione con una sonda marcata
tampone elettroforetico
es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)
generatore di corrente
gel di agarosio
100V
-
+
0,2A
scatola elettroforetica
Gel ElettroforesiSepara le molecole in base alla dimensione
Trasferimento su supporto solido
Trasferimento dal gel alla
membrana
Dopo il trasferimento
gel
membrana
Preparare la sonda per il Northern Blot
Ibridazione
• La sonda marcata e’ aggiunta ad una
soluzione contenente il supporto solido che
lega l’RNA da analizzare
Lavaggio
• Rimozione della sonda non legata al
supporto solido
Rivelazione degli ibridi
• Esposizione di un film se la sonda e’
marcata radioattivamente
• Se la sonda e’ marcata con un enzima si
procede alla reazione enzimatica che
produce colore direttamente sul supporto
solido
Northern blot
• La rivelazione avviene usando:
– DNA marcato con radioattivo(32P)
– DNA marcato con un enzima che
catalizza una reazione che produce
luce o colore
Northern blot
Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating
seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for ElLTP1
(top panel) and ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide
staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate
transcript sizes in kb
Svantaggi del Northern Blot
• Richiede grandi quantita’ di RNA
• E’ un processo lungo e laborioso
Ibridazione dell’RNA in situ
Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su
vetrini da microscopio
Preparation of RNA probe with in vitro transcription
T7/T3 or SP6
promoter
RNA in situ hybridization
Colour substrate:
nitro blue tetrazolium (NBT)
+ 5-bromo-4-chloro-3indolyl phosphate (BCIP)
Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1.
E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm,
hy hypocotyl, am apical meristem, ro root
• Il livello di RNA presente nella cellula non
necessariamente riflette direttamente i livelli di
trascrizione del gene
• Per poter asserire che un gene viene attivato
TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne
visualizzare l’attivita’
permette di determinare il livello
di trascrizione di un gene
1)
2)
3)
4)
5)
Purificare i nuclei
+ NTP, 32P GTP
Trascrizione: la catena nascente
e’ radioattiva
Estrazione dell’RNA
Ibridazione a cDNA immobilizzato
su filtro
codificanti mRNA epato-specifici
analizzata tramite run-on
Lodish
Figure 10-23
Northern blotting
RNA isolation
Probe labeling
AAAAAA
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
pBS-SemaIII
Gel electophoresis
Hybridization
Blotting
Autoradiography
reverse Northern blotting
Northern
reverse Northern
specific probes
*
*
labeled target