ANALISI
CITOFLUORIMETRICA
E SUE APPLICAZIONI IN
AMBITO BIOMEDICO
Definizione
CITOFLUORIMETRIA o CITOMETRIA A FLUSSO
Metodica di laboratorio che permette un’analisi automatica di
sospensioni cellulari monodisperse
misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimiche
all’interno di un flusso laminare
che interseca una sorgente luminosa, acquisendo e memorizzando piu’
parametri (volume, granulosita’, fluorescenza) per ogni cellula acquisita
Principi di funzionamento
• Sistema fluidico (focalizzazione idrodinamica)
• Sistema ottico (laser Argon 488nm)
• Sistema elettronico (software CellQuest)
Sistema Fluidico
Sistema Ottico
Sistema Elettronico
Parametri
• LIGHT SCATTERING
(Forward and Side Scatter)
• FLUORESCENZA
(FITC, PE, PerCP, Cy5.5, Alexa, Biotina, PI,
APC, ...)
Light Scattering
Sangue periferico
Fluorescenza
IMMUNOFLUORESCENZA
DIRETTA
Plot FITC/PE/Per CP
Intensita’ F proporzionale
ai siti di legame
Marcatori(linfocitari): la nomenclatura CD
Si considera membro di un Cluster differentiation
un Marcatore di superficie che:
• identifica un particolare tipo cellulare o un
certo stadio differenziativo
• ha una struttura biochimica definita
• è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi
Informazioni aggiornate
www.courseware.vt.edu/users/kdelgert/
(www.bsi.vt.edu/immunology)
www.ncbi.nlm.nih.gov/prow
Applicazioni
1. determinazione
dei
marcatori
di
differenziamento cellulare, di superficie,
intracitoplasmatici e intranucleari
2. valutazione del contenuto cellulare di
DNA
3. discriminazione tra cellule vive, cellule
apoptotiche e necrotiche
4. predisposizione per la separazione
cellulare
Immunofenotipo
Permette di IDENTIFICARE,NUMERARE E
CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti
in caso di antigenti specifici
l’immunofenotipo può rispondere a
domande su diagnosi, prognosi
e malattia residua minima
Marcatori B-lineage
TdT
CD79a
CD19
CD10
CD20
CD22
Cu
SmIg
Marcatori T-lineage
CD7
CD2
CD5
CD3
CD1
CD4
CD8
TdT
TCR
Marcatori granulocitopoiesi
CD34
CD13
CD33
CD117
CD11b
CD16
CD66b
CD66c
CD15
Marcatori monocitopoiesi
CD34
CD13
CD33
CD14
CD11b
CD16
CD66b
CD66c
CD15
Marcatori eritrocitopoiesi
CD34
CD45
CD33
CD71
CD105
CD36
GPA
Gating
CD 45
ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero
ESPRESSO CON CARATTERISTICA
INTENSITA’ SU LEUCICITI PERIFERICI
MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO
SU CELLULE BLASTICHE
Espressione CD45
Linfociti Monociti
Granulociti maturi
Cellule
immature
Eritrociti
Granulociti immaturi
Scelta degli antigeni e Criteri di Positività
•ALTA SENSIBILITA’ (es.CD19 nelle ALL-B)
•ALTA SPECIFICITA’ (es.CD34, CD133)
•Positività?
Characteristic phenotype of B-precursor ALL with most common
chromosomal aberrations
MLL/AF4
t(4;11)
CD45
Dim
CD19
CD34
CD22
CD20
CD24
CD10
TDT
cyIg
CD15
CD65
CD13
Pos
Pos
Neg/dim
Neg
Neg
Neg
Pos
Neg
Often dim
Often dim
Mostly neg
CD33
neg
TEL/AML1
t(12;21)
Dim
Pos
Pos
Dim/pos
Neg
Pos
Pos
Pos
Neg
Neg
Neg
Often pos
and/or (CD33)
Often pos
and/or (CD13)
Neg
Neg
Neg
Neg
NV
NV
Hyperdiploidy
Neg
Pos
Pos
Pos
Dim/pos
Pos
Bright
Pos
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
BCR/ABL
t(9;22)
Neg/dim
Pos
Pos/neg
Dim/pos
Dim/pos
Pos
Bright
Pos
Neg
Neg
Neg
pos and/or
(CD33)
and/or
(CD13)
Pos
NV
Neg
NV
Pos
Dim
E2A/PBX1
t(1;19)
Dim
Pos
Neg
Pos/dim
Dim/pos
Pos
Neg/dim
Pos
Pos
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Pos
Neg
CD66c
Pos
NV
Pos
CD9
Pos
Neg
Neg
NG2
NV
NV
NV
CD135
NV
NV
NV
CD25
NV
NV
NV
CD38
Derived from ;
Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias (Review) O.Hrusak and A.PorwitMacDonald Leukemia 2002
ALL-T
ALL-T
CD1a, CD2, CD3, cyCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TdT ,(CD34)
ALL-B, common
ALL-B, common
CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM,
cyIgM, Kappa, lambda, TdT, (CD15)
ALL-B, B matura
ALL-B, B matura
CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM,
cyIgM, Kappa, lambda, TdT
LAP
LAP
MPO, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, DR,
CD41, CD56, CD61 (CD2)
LAP
G+15 dopo terapia con ATRA
ESORDIO:popolazione
blastica
G+15:popolazione matura
LAM
Midollo osseo,
liquido cefalorachidiano
BM
liquor
Midollo osseo, sangue periferico,
liquido cefalorachidiano
BM
PB
liquor
Neuroblastoma
DATI RICERCA
•Differenziamento
Pession et al., MLL-AF9 oncogene expression affects cell growth but not
terminal differentiation and is downregulated during monocyte-macrophage
maturation in AML-M5 THP-1 cells, Oncogene. 2003 Nov 27;22(54):8671-6.
•Ciclo cellulare e apoptosi
Pession et al., Targeted inhibition of NMYC by peptide nucleic acid in N-myc
amplified human neuroblastoma cells: cell-cycle inhibition with induction of
neuronal cell differentiation and apoptosis, Int J Oncol. 2004 Feb;24(2):265-72.
VANTAGGI dell’ANALISI
citofluorimetrica :
• multiparametricità
• possibilità di mettere in relazione più caratteristiche
della stessa cellula
• analisi di grandi quantità di cellule
• riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni
• grande sensibilità
• rapidità di analisi
• possibilità di ulteriori analisi a posteriori
Conclusioni
La citofluorimetria completa il repertorio della diagnosi
emato-oncologica :
• Identifica la malattia residua minima
• Distingue la ripresa di malattia VS da iperproduzione
del midollo
• Determina la presenza di malattia disseminata
(ALL latente, santuari exramidollari)