Spettroscopia
di assorbimento nel
visibile e nell’ultravioletto
Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici uso laboratorio ver. 00
I metodi spettroscopici di analisi si basano sulla
misura della radiazione elettromagnetica prodotta
o assorbita dagli analiti.
Si possono classificare in funzione della regione
dello
spettro
ultravioletto,
elettromagnetico
visibile,
infrarosso
(raggi
ecc.)
X,
e
storicamente i primi metodi spettroscopici erano
ristretti all’uso della radiazione visibile.
La
spettroscopia
strumento
di
costituisce
analisi
chimica
un
potente
poiché
ogni
elemento chimico, ed in generale ogni sostanza,
presenta uno spettro caratteristico che fornisce
informazioni dettagliate e precise sulla sua
struttura o sulla sua composizione.
La luce viene emessa o assorbita sotto forma di
quanti o fotoni.
L'energia E di un singolo fotone è direttamente
proporzionale alla frequenza di radiazione  e quindi
inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda
, secondo la formula:
E = h = hc/
h costante di Planck
c velocità della luce
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Si definisce lunghezza d’onda (λ) la distanza minima
tra due punti in fase e viene espressa in:
Å = 10-8 cm (raggi X)
μm = 10-4 cm (IR)
nm = 10-7 cm (UV-Visibile)
La frequenza rappresenta il numero di oscillazioni al
secondo, ossia è il numero di cicli che passa per un
punto nell’unità di tempo e viene espressa in sec-1.
Il colore o la lunghezza d’onda dei quanti di luce
emessi o assorbiti da un nucleo, da un atomo o da
una molecola, dipende dalla loro struttura interna.
In un atomo, l’assorbimento o l’emissione di luce di
una determinata lunghezza d’onda corrisponde alla
transizione di un elettrone da un’orbita ad un’altra.
Lo spettro di un atomo è sempre a righe e cade
nell’intervallo di frequenze dall’infrarosso al visibile.
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TECNICHE SPETTROSCOPICHE
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≈ 10-380 nm (UV)
≈ 380-780 nm (Vis)
≈ 1-1000 mm (IR)
espresso anche come
numero d’onda 1/
≈ 10.000-10 cm
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SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO
Quando una radiazione d’onda compresa tra
190nm e 750nm attraversa una soluzione, gli
elettroni dei legami dei composti presenti in
soluzione passano allo stato eccitato. Meno
fortemente sono legati gli elettroni dei lagami
entro la molecola, più elevata sarà la lunghezza
d’onda della radiazione assorbita e quindi più
bassa l’energia.
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ECCITAZIONE DELL’ETILENE
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Quando un fascio di radiazione monocromatica
attraversa una soluzione contenente un analita,
parte della radiazione viene assorbita:
P0 = intensità radiazione incidente
P = intensità radiazione emessa
b = spessore dello strato di soluzione
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Transmittanza
T = P / P0
Assorbanza
A = log 1 / T
A = log P0 / P
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LEGGE DI LAMBERT-BEER
A= e b c
A = assorbanza
e = assorbività molare (l mol-1 cm-1)
b = cammino ottico (spessore cuvetta espresso in cm)
c = concentrazione, espressa in mol l-1
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Se si riporta il segnale (T o A) in funzione della
lunghezza del cammino ottico:
La risposta dell’assorbanza in funzione della
concentrazione è lineare fino ad un certo punto:
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I cromofori
Sono gruppi presenti in molecole organiche che
hanno la capacità di assorbire la radiazione
elettromagnetica nella regione del visibile e in
quella dell’ultravioletto. I cromofori più comuni sono
caratterizzati
da
gruppi
insaturi
in
grado
di
delocalizzare le cariche (etileni, acetileni, dieni,
carbonili, azoico, benzeni…). Gruppi in grado di
esaltare l’attività del cromoforo vengono denominati
auxocromi.
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Caratteristiche di alcuni cromofori benzenici
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Le variazioni dello spettro
SPOSTAMENTO
DENOMINAZIONE
Lunghezze d’onda maggiore batocromico
Lunghezze d’onda minore
ipsocromico
Assorbanza maggiore
ipercromico
Assorbanza minore
ipocromico
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Lo spettro UV-VIS
0
Abs
2
QUERCETINA
200
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nm
600
Lo spettro UV-VIS
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LO SPETTROFOTOMETRO
Singolo raggio
Doppio raggio
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La sorgente luminosa è costituita da lampada a:
 deuterio per la zona dell’UV
D2 + Ee → D2* → D’ + D’’ + hv (U.V.)
spettro della radiazione emessa: ≈ 160-375 nm
 tungsteno (W) per la regione visibile
temperatura filamento: ≈ 2870 K
spettro della radiazione emessa: ≈ 350-2500 nm
 xenon (Xe) per coprire entrambe le zone
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Il monocromatore scinde la luce nelle sue lunghezze
d’onda costituenti, ulteriormente selezionate da una
fenditura successiva. I modelli più utilizzati sono il
prisma e il reticolo di diffrazione:
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Il
rivelatore
permette
di
trasformare
l’intensità
luminosa in un segnale elettrico. Possono essere
utilizzate
fotocellule
(a),
fotomoltiplicatori
(PMT,
photomultiplier tubes, b) o fotodiodi.
b
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Spettrofotometro con rivelatore a serie di diodi
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LE CUVETTE
lati opachi
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Lampada: singola sorgente pulsata allo Xenon
Intervallo: 190-1100nm
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La taratura
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Differenza spettri
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L’influenza del pH
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Spettri in derivata
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Rilascio di un farmaco da una formulazione
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I COLORIMETRI (O SPETTROCOLORIMETRI)
Grazie allo sviluppo di opportuni software, gli
attuali spettrofotometri possono essere utilizzati
come colorimetri, apparecchi che sono in grado
di misurare la radiazione luminosa e fornire un
dato numerico che corrisponde alla sensazione
visiva percepita dall’occhio umano.
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Lavorando su campioni trasparenti e in soluzione è
possibile effettuare una scansione tra 380 e
780nm, impostare l’osservatore standard e il tipo
di sorgente (in genere 10° e D65, rispettivamente)
ottenendo i valori di coordinate cromatiche nel
sistema CIE del tipo L*a*b*, L*u*v* o L*C*H*.
In tale modo vengono valutati l’intensità, la tinta e
la saturazione senza bisogno di strumenti più
costosi muniti della sfera.
Poiché il colore viene influenzato dalle diluizioni,
nel caso di campioni molto intensi è preferibile
ricorrere a celle dal cammino ottico inferiore ed
effettuare le opportune correzioni.
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I parametri di misura del colore
• Tinta (Hue, h) = definisce la tonalità del
colore (rosso, giallo, verde, azzurro)
• Luminosità (L*): indica la diversa intensità
di luce, ossia di quanto la tinta è diluita
con il nero. Varia da zero (nero) a 100
(bianco)
• Saturazione (Chroma, C*): indica di
quanto la tinta pura è diluita con il
bianco. Varia da zero (bianco) a 100
(colori spettrali puri, luci monocromatiche)
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LA RAPPRESENTAZIONE NELLO SPAZIO
Spazio CIE xy (1931)
Spazio CIE L*a*b* (1976)
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Lo spazio CIE L*a*b*
tinta, tonalità
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luminosità
saturazione
LA FUORIMETRIA
Quando gli elettroni nello stato eccitato di singoletto tornano
allo stato fondamentale di singoletto ed emettono fotoni si
parla di fluorescenza, processo che dura tra 10-10 s e 10-5 s ed
è indipendente dalla temperatura.
Si parla di fluorescenza primaria
quando la sostanza è fluorescente allo
stato naturale, mentre la fluorescenza
secondaria deriva dalla reazione con
sostanze fluorescenti (derivatizzazione).
Le molecole naturalmente fluorescenti
sono quelle con sistemi fortemente
coniugati o aromatici e struttura rigida.
Il picco di emissione si trova sempre a
lunghezza
d’onda
maggiori
(spostamento di Stokes), e pertanto, a
energia più bassa.
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FUORIMETRI
Gli strumenti per la spettrofotometria di fluorescenza
molecolare
(spettrofluorimetri)
sono
simili
allo
spettrofotometro UV-VIS: è presente una sorgente luminosa
(allo xeno o alogena al quarzo), un reticolo monocromatore,
un alloggiamento per il campione, un secondo reticolo
monocromatore e il rivelatore. Cambia la geometria perché
in questo caso il raggio che viene emesso è letto a 90° rispetto
alla luce incidente.
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Esistono alcune peculiarità che richiedono opportuni
accorgimenti tecnici, ad es. l’assenza di fluorescenza provoca
il buio totale, causando quindi problemi di azzeramento della
linea di base. Inoltre la fluorescenza è molto sensibile alla
diffusione provocata dal solvente (effetto Rayleigh) o da
sostanze colloidali (effetto Tyndall), alle variazioni di pH,
temperatura e viscosità o alla presenza di sostanze
sequestranti. Le soluzioni non possono essere troppo
concentrate in quanto una parte della luce emessa può essere
riassorbita da altre molecole non eccitate. Normalmente si
eseguono diluizioni pari a 10-100 volte rispetto a quelle
utilizzate in spettrofotometria UV-VIS.
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SPETTROSCOPIA NELL’INFRAROSSO
È una tecnica molto utilizzata per identificare composti
organici ed inorganici poiché la stragrande maggioranza
delle molecole presenta spettri di assorbimento
caratteristici. Normalmente non viene impiegata per le
analisi quantitative a causa della bassa sensibilità e
precisione e delle frequenti deviazioni dalla legge di Beer.
processo che dura
tra 10-10 s e 10-5 s
ed è indipendente
dalla temperatura.
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Il gran numero di legami presenti nelle molecole
poliatomiche comporta che i dati ottenuti dall’analisi IR
siano molto complessi e forniscano un’impronta digitale di
identificazione caratteristica ed unica per ogni particolare
molecola.
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GRUPPO
LEGAME
ENERGIA
(approx, cm-1)
hydroxyl
O-H
3610-3640
amines
N-H
3300-3500
aromatic rings
C-H
3000-3100
alkenes
C-H
3020-3080
alkanes
C-H
2850-2960
nitriles
C ΞN
2210-2260
carbonyl
C=O
1650-1750
amines
C-N
1180-1360
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STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IR
sistemi a dispersione
Globar
Lampada di Nernst
Filo Ni-Cr
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STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IR
sistemi a trasformata di Fourier
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GLI SPETTRI IR
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GLI SPETTRI IR
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