forma denaturata

(287nm)
a
b c
d
Ribonucleasi
P.M.=14000
forma nativa
10°
20°
30°
40°
50°
T(°C)
a) pH = 1.13 b) pH = 2.10 c) pH = 2.77 d) pH = 3.15
N⇄D
[N]
1
1



[ N ]  [ D ] 1 [ D ] 1 K
[N]
Denaturazione termica
della
Chimotripsina
(pH=2.0)
N⇄D
Denaturazione termica
della Ribonucleasi A
(pH=2.1)
G  H   TS
S   
H    C dT
0
p
C  C ( N )  C ( D )
0
p
0
p
0
p
C
T
0
p
dT
A pH=2.5, T=303K, p=1 atm:
H   57.2kcal  mol 1
S   186cal  mol 1
G  57.2 103  303 186  900cal  mol 1
[ D]
Predomina la forma nativa
K
1
[N]
A pH=2.5, T=313K, p=1 atm:
H   76.1kcal  mol 1
S   260cal  mol 1
G  76.1103  303  260  5.4kcal  mol 1
[ D]
K
1
[N]
Predomina la forma denaturata
Parametri termodinamici per la denaturazione
termica della Ribonucleasi A (pH=2.5)
G°(D)
Tm
G°(N)
20° 40°
D
G   RT ln K   RT ln 
N
60°
80° T(°C)
ΔG°= G°(D)-G°(N)
Tm
20° 40° 60° 80° T(°C)
Forma denaturata
Forma nativa
La variazione di capacità termica del processo di denaturazione
è data dalla differenza tra le rette caratteristiche della forma
nativa e denaturata:
0
C P
0
0
 C P (D) - C P (N)
Dall’integrazione della curva sperimentale si ottengono la
variazione entalpica ed entropica del processo:
H    C dT
0
p
S   
C p0
T
dT
• Le variazioni entalpiche ed entropiche con la temperatura
sono grandi e positive. Il contributo entalpico è sfavorevole
al processo di denaturazione e l’intero processo è quindi
guidato dal contributo entropico favorevole.
• G0 è piccolo a causa di effetti di compensazione tra effetti
entalpici ed entropici. Bastano piccole variazioni nei
contributi entalpici ed entropici per far variare il segno
complessivo dell’energia libera standard. L’aumento di pH
sfavorisce il processo di denaturazione (G0 > 0), il punto di
flesso delle curve di transizione (G0=0, H0 = Tm S0) si
sposta a temperature maggiori. ;
• La
capacità
termica
è
relativamente
elevata
(ΔCp°≈2kcal·mol-1), come conseguenza della elevata
dipendenza dei termini entalpici ed entropici dalla
temperatura.
L’andamento è in accordo con quanto previsto dall’equazione
di Van’t Hoff:
H
  ln K 

 
2

T

 P RT
0
Poiché H0>0 la reazione di denaturazione è favorita da un
aumento di temperatura.
Analogamente, poiché:
  G 0 

  - S 0
 T 

P
l’aumento di temperatura favorisce lo stato a entropia
maggiore (forma denaturata).
Le proteine tendono ad essere più stabili intorno al punto
isoelettrico (carica nulla).
1. Il pH influenza gli equilibri di deprotonazione dei residui
polari (Lys, Gln, Asp) e determina la carica totale sulla
superficie proteica (repulsione elettrostatica tra i gruppi
ionizzabili).
2. Determina inoltre la rottura dei ponti salini tra gruppi
ionizzati di diverso segno (Ex. Asp70 e His31 nella
lisozima).
Come risultato molte proteine denaturano in maniera
irreversibile a valori estremi di pH (pH<5 o pH>10).
La denaturazione di una proteina può essere anche indotta
mediante l’aggiunta di agenti chimici in grande eccesso, come
l’urea o lo ione guanidinio.
- formazione di legami idrogeno competitivi con i gruppi
peptidici;
- stabilizzazione dello stato denaturato attraverso l’interazione
preferenziale con la superficie proteica. Infatti l’urea e lo ione
guanidinio aumentano la solubilità di tutti i residui, sia polari
che apolari, diminuendo di circa il 30% l’entità del contributo
idrofobico, con un conseguente aumento della superficie
esposta.
Ferritina umana
L’insieme di questi effetti è dovuto in larga parte a fenomeni di
solvatazione.
Glu
Lys
Arg
Lys
Phe Ile
Leu Val
Arg
Arg
Forma nativa
Lys
Ile
Phe
Glu
Arg
Lys
Leu
Val
Forma denaturata
Formazione di clusters di acqua intorno ai residui apolari
All’aumentare della temperatura cresce il peso del
contributo entropico favorevole, favorendo il processo di
denaturazione. Inoltre all’aumentare della temperatura le
strutture ordinate di solvente tendono a rompersi,
rilasciando molecole libere di muoversi liberamente in
soluzione.
Questo comporta un ulteriore aumento di entropia e anche
una variazione entalpica associata alla parziale distruzione
dei legami idrogeno che stabilizzavano le strutture a clusters.
Il risultato dell’insieme di questi processi è una forte
dipendenza dei contributi entalpici ed entropici dalla
temperatura.
N ⇄ MG ⇄ D
Il Molten Globule rappresenta una struttura intermedia tra la
forma nativa e quella denaturata. E’ caratterizzato da un
contenuto di struttura secondaria paragonabile a quello della
forma nativa, ma con un volume molare molto più grande
(~50%).
Le caratteristiche principali di uno stato molten globule sono:
(i) le dimensioni totali di questo stato sono minori di quelle
associate ad un gomitolo statistico e sono solo lievemente
maggiori di quelle dello stato nativo;
(ii) il contenuto di struttura secondaria è confrontabile con
quello dello stato nativo;
(iii) le interazioni con il solvente (cioè la superficie esposta al
solvente) sono molto maggiori di quelle dello stato nativo,
ma molto minori dello stato completamente denaturato;
(iv) l’interconversione molten globule  stato denaturato è
rapida e non cooperativa, mentre l’interconversione molten
globule  stato nativo è lenta e cooperativa.
Fluttuazioni intorno
allo stato nativo
Il numero di conformazioni possibili per un polipeptide composto
da n residui è:
 
n2
dove ω rappresenta il numero di conformazioni popolato da ogni
residuo. L’esponente (n-2) tiene conto del fatto che i due residui
terminali restano comunque liberi in qualunque conformazione.
Dall’approssimazione degli isomeri rotazionali: ω=9.
Quindi per n=100 (miniproteina):
  9  3 10
98
93
Sperimentalmente si è trovato che in media: ω=3.5.
  3.5  2 10
98
53
 N 

S  S ( N )  S ( D )  k ln
 D 
Assumendo ΩN≈1 per una proteina nel suo stato nativo e calcolando
la variazione entropica per mole di proteina:
 1 
1
1
S  R ln
 244cal  mol  K
53 
 2 10 
La variazione di entropia conformazionale è di ca. -2.4 cal·mol-1·K-1
per residuo!
Paradosso di Levinthal
Ipotizzando che un sistema popoli ciascuna conformazione per un
tempo dell’ordine di 1 ps ci vorrebbero ca. 6·1033 anni per
analizzare tutte le possibili conformazioni. Proteine (in vivo e in
vitro) raggiungono la conformazione nativa in un tempo che varia
tra 0.1 e 1000 secondi.
Il processo di folding deve essere un processo guidato attraverso
un cammino non casuale!
1-Φ =
Frazione di
molecole che
raggiungono
stati
metastabili
(minimi locali
di energia)
Φ=
Frazione di
molecole che
raggiungono
rapidamente
lo stato nativo
kD
N⇄D
kF
Es. Lisozima
• kD e kF rappresentano rispettivamente le costanti cinetiche
del processo di denaturazione (ND) e del processo di
folding (ND).
• Perché valga questo tipo di modello gli stati intermedi
devono essere tutti fortemente instabili.
Da un punto di vista cinetico:
d [N]
 k D [N] - k F [D]
dt
Dividendo entrambi i membri per la concentrazione totale [N] + [D]:
d fN
 k D fN - k F fD
dt
[N]
fN 
[N]  [D]
[D]
fD 
[N]  [D]
Introducendo la variazione delle frazioni molari della forma nativa
e denaturata dai valori di equilibrio:
fN = fN – fN(eq)
fD = fD – fD(eq)
d f N
 k D f N(eq)  k D f N - k F f D(eq) - k F f D
dt
All’equilibrio:
kD fN(eq) = kF fD(eq)
-
d f N
 k D f N - k N f D
dt
fN = - fD
A tutti i tempi (conservazione di massa):
d f N
 (k D  k F ) f N
dt
La cui soluzione è:
 f N  f N0 exp(-  t)
  kD  kF
 f D  f D0 exp(-  t)
  kD  kF
In un meccanismo a due stati la cinetica di denaturazione e di
folding avvengono con la stessa costante cinetica .
N⇄ X ⇄ D
veloce
lento
Es. Ribonucleasi
Lo stato intermedio X presenta regioni strutturalmente
ordinate che assumono la funzione di centri di nucleazione
attorno ai quali si completa il folding proteico.
Il modello più semplice prevede un solo stato intermedio:
k1
k2
N ⇄ X ⇄ D
k-1
k-2
La soluzione dell’equazione cinetica è:
 f N  C1 exp(-  1t)  C 2 exp(-  2 t)
 f D  C 3 exp(-  1t)  C4 exp(-  2 t)
Le cinetiche di folding e unfolding per un processo a tre stati non
sono le stesse.
A) Nucleazione e crescita rapida
D ⇄ I1  I2  I3  I4  I5  N
Nucleazione (lenta)
crescita (rapida)
In questo modello vi è un primo evento di nucleazione verso
l’intermedio corretto che porterà alla strutturazione nativa.
Questo primo passo è lento e il processo di sampling delle
conformazioni casuale.
Gli stadi successivi (crescita) sono rapidi e portano
irreversibilmente alla struttura nativa.
B) Modello generale
U1
I1
U2
stati
unfolded
U3
I2
I4
N
struttura
nativa
U4
U5
intermedio
pre-foldato (MG)
I3
stati
intermedi
I
II
III
I. Collasso veloce della catena proteica in una conformazione
compatta (Molten globule)
I tempi sono dell’ordine dei microsecondi.
II. Esplorazione delle strutture compatte
III. Transizione tra stati misfolded e struttura nativa (lento)
La transizione tra stati misfolded e struttura nativa è un
processo attivato, generalmente lento.
Per una barriera di energia dell’ordine di 7 kcal·mol-1, il
tempo stimato necessario alla transizione è dell’ordine di
qualche secondo.
Collasso veloce
Processi attivati
Cinetica bifasica di un processo di folding