SVILUPPO DI UN IMMUNOSENSORE PER LA DETERMINAZIONE DEL 17- ESTRADIOLO
NEL SIERO BOVINO
G. Fares, G. Volpe, D. Moscone, R. Draisci*, F. delli Quadri*, L. Achene*, G. Palleschi.
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche, Università di Roma Tor Vergata, Via della Ricerca Scientifica, 00133 Roma.
* Lab. Medicina Veterinaria, Istituto Superiore di Sanità, V.le Regina Elena 299, 00161 Roma.
RISULTATI
INTRODUZIONE
Voltammetria ad impulso differenziale
Il 17-estradiolo (17-E2) è un ormone steroideo naturale con attività
(DPV)
estrogenica, usato per curare e prevenire infezioni animali. Tale sostanza,
date le sue proprietà anabolizzanti, viene anche illegalmente utilizzata come
velocità di scansione:100 mV/s
promotore di crescita negli allevamenti intensivi degli animali di azienda. A
intervallo di potenziale: 0 - 600 mV
causa dei suoi effetti carcinogenici, l’Unione Europea ha bandito il suo
Parametri ottimizzati
frequenza degli impulsi di potenziale: 0.16 sec
utilizzo a scopo di ingrasso per proteggere il consumatore da possibili effetti
per l’-naftolo
durata dell’impulso: 60 ms
dannosi dovuti al consumo di carne contaminata. Conseguentemente, in
ampiezza dell’impulso (DE): 50 mV
Italia, è stato stabilito un limite massimo per il 17-E2 (40 pg/ml tranne per
animali gravidi) nel siero e nel plasma bovino. Da qui l’esigenza di disporre
di metodi di analisi, semplici e rapidi, per accertare l’eventuale presenza
dell’ormone nei fluidi biologici.
Questo lavoro è focalizzato sulla realizzazione di un immunosensore Risposta degli elettrodi SPEs a differenti
elettrochimico monouso per la determinazione del 17-E2 nel siero bovino. a concentrazioni di -naftolo
-0,25
50 µM
-0,2
10 µM
5 µM
buffer
-0,15
-0,1
-0,05
0
0
PRINCIPIO DEL METODO
La tecnologia degli “screen printed”(SPEs), elettrodi stampati ottenuti
tramite serigrafia, consente la realizzazione di sistemi di rilevazione
miniaturizzati, prodotti su larga scala ed a basso costo. La loro economicità
permette di utilizzarli come “usa e getta”, eliminando di conseguenza
fenomeni di avvelenamento della superficie elettrodica, e li rende adatti per
misure in “situ”.
100
150
200
250
300
350
400
450
500
E (mV)
Immunosensore
Allo scopo di ottimizzare la quantità di 17-E2 -AP, da utilizzare nella
successiva competizione, sono state costruite delle curve di “binding”
fissando la concentrazione dell’anticorpo specifico (Pab) per il 17-E2 e
variando quella del coniugato secondo lo schema:
precoating: 8 µL IgG aspecifiche (10µg/mL),
“overnight” 4 oC
coating: 8 µL Pab (1:100), 1h
 Come è fatto uno SPE?
1. Elettrodo di Riferimento di Ag
2. Elettrodo di Lavoro di grafite
50
“Binding steps”
4 µL tampone di lavoro (PBS), 5 min.
3. Controelettrodo di Ag
4 µL 17-E2 -AP (differenti diluizioni), 25 min.
50 µL 1-naftilfosfato, 2 min
1
2 3
L’immunosensore realizzato prevede che l’interazione tra i biocomponenti
avvenga direttamente sulla superficie dell’elettrodo di grafite stampato
(elettrodo di lavoro).
tra tutti gli steps menzionati, venivano effettuati 2 rapidi lavaggi con PBS
addizionato con Tween (0.05%)
Trasduttore di
segnale
0
.
3
Supporto per
l’immobilizzazione
del
biocomponente
Curva di binding del 17-E2 -AP
Corrente (µA)
 Funzione di un SPE
0
.
2
0
.
1
0
.
0
1
Anticorpo specifico
per il 17-E2
0
0
1
:
1
0
0
1
0
0
0
1
:
1
0
0
0
E
s
t
r
a
d
i
o
l
o
A
P
(
d
i
l
u
i
z
i
o
n
i
)
la diluizione di 17-E2 -AP = 1:150 (punto di flesso della curva ) è stata
selezionata per la succesiva competizione:
“Competition
steps”
precoating: 8 µL IgG aspecifiche
(10µg/mL),“overnight” 4 oC
coating: 8 µL Pab (1:100), 1h
4 µL 17-E2 (soluzioni standard), 5 min.
4 µL 17-E2 -AP (1:150), 25 min.
50 µL 1-naftilfosfato, 2 min
0
.
1
6
l
i
m
i
t
e
d
i
l
e
g
g
e
0
.
1
2
Curva standard del 17-E2
Corrente (µA)
Lo schema del saggio sviluppato è di tipo competitivo diretto Fig.1. Allo
scopo di ottenere una superficie altamente selettiva per l’analita e ridurre
allo stesso tempo l’adsorbimento aspecifico da parte di altre molecole, è
stato utilizzato il metodo del precoating che prevede l’adsorbimento sulla
fase solida (superficie elettrodica) di IgG aspecifiche, seguito dal loro
legame con gli anticorpi specifici per l’analita da dosare. Le successive
fasi ottimizzate consistevano nella incubazione della soluzione di
competizione, contenente estradiolo libero e estradiolo coniugato
(appositamente sintetizzato) con l’enzima fosfatasi alcalina (AP) e nella
rilevazione dell’-naftolo, prodotto della reazione tra l’enzima e il
substrato -naftil fosfato, mediante voltammetria differenziale ad impulsi
(DPV).
IgG aspecifiche
1
0
1
:
1
0
0
.
0
8
0
.
0
4
0
.
0
0
1
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
E
s
t
r
a
d
i
o
l
o
(
p
g
/
m
l
)
17-E2 -AP
17-E2
Fig. 1
La sperimentazione futura consisterà nel testare le “performance”
dell’immunosensore sviluppato su un siero “bianco” fortificato con differenti
concentrazioni di17-E2 e nell’analisi di campioni reali; i risultati verranno
confrontati con quelli ottenuti mediante cromatografia liquida accoppiata alla
spettrometria di massa tandem (LC-MS-MS).