DOSAGGIO ENZIMATICO
ANALISI DELL’ATTIVITà ENZIMATICA DI
UNA PROTEINA MEDIANTE L’UTILIZZO
DELLO SPETTRO FOTOMETRO.
SI ANALIZZA LA COMPARSA DI UN
PRODOTTO DELLA REAZIONE O LA
SCOMPARSA DI UN SUBSTRATO.
PER POTER QUANTIZZARE UN ENZIMA
OCCORRE CONOSCERE BENE IL SUO
MECCANISMO DI AZIONE.
OGNI SINGOLO ENZIMA HA UN SUO
DOSAGGIO SPECIFICO.
LEGGE DI BEER
A=εcb
A=
ASSORBANZA O DENSITà OTTICA
(OD). CORRISPONDE ALLA
FRAZIONE DI ENERGIA
RADIANTE.
ε=
COEFFICIENTE DI ESTINZIONE
MOLARE,
L’ASSORBIMENTO DI
UNA MOLE DI
COMPOSTO
CON SPESSORE UNITARIO AD
UNA DATA LUNGHEZZA D’ONDA
C=
CONCENTRAZIONE DELLA SPECIE
IN ESAME
(MOL/LITRI).
b=
CAMMINO OTTICO IN cm
I
Ia
1 cm
T=
T
I
Ia
= TRASDUTTANZA.
Ia = INTENSITà DELLA RASIAZIONE INCIDENTE
I
= INTENSITà DELLA RASIAZIONE USCENTE
SCHEMA DI UNO
SPETTROFOTOMETRO
Tipi di DOSAGGIO
DIRETTO
INDIRETTO
SFRUTTA I COMPONENTI
DELLA REAZIONE O I
PRODOTTI.
UN ESEMPIO è IL
DOSAGGIO DELLA
GLUTATIONE-STRANSFERASI
NON POTENDO SFRUTTARE
I COMPONENTI DELLA
REAZIONE O I PRODOTTI SI
ACCOPPIA UN’ALTRA
REAZIONE.
UN ESEMPIO è IL
DOSAGGIO DELL’ESOCINASI
DOSAGGIO
SI UTILIZZA UN PROGRAMMA DI LETTURA CHE LEGGE
IL CAMPIONE A INTERVALLI DI TEMPO
OD
D min
1
2
3
4
5
6
7
8
Min.
DOSAGGIO DELLA
GLUTATIONEREDUTTASI
DtNB + GS-SG + NADPH
GR
TNB-S-GLUTATIONE
+ NADP
LEGANDOSI AL GLUTATIONE IL DTNB,
ASSORBE A 412nm
DOSAGGIO DELl’ESOCINASI
Glucoso +ATP
HK
Glucoso-6-P +ADP
QESTA REAZIONE NON HA ELEMENTI CHE
ACMBIANO IL LORO ASSORBIMENTO.
PER QUESTO MOTIVO SI ACCOPPIA UN’ALTRA
REAZIONE CON LA G6PD
Glucoso-6-P + NADP
G6PD
6-fosfogluconato
+ NADPH
IL NADPH HA UN ASSORBIMENTO CARATTERIS
A 340 nm
Spettro d’assorbimento
NAD/NADH
Dosaggio dell’attività enzimatica e
calcolo dell’affinità (Km)
 Dosaggio di un enzima
 Dosaggio con i reattivi per la
Km
 Costruzione del grafico della costante di
Michelis-Manten
 Costruzione del grafico dei
reciproci
doppi
 Individuazione grafica della Km.
Dosaggio di un enzima
Viene utilizzato come enzima la Glutatione
Reduttasi (E.C. 1.6.4.2.)
La Glutatione Reduttasi (GR) è necessaria
per la rigenerazione del glutatione ridotto, che
è importante per un normale metabolismo
cellulare
La glutatione reduttasi è un enzima NAD(P)H e
flavina adenina dinucleotide (FAD)-dipendente
che si trova negli eritrociti. L’enzima catalizza
l’ossidazione del glutatione ossidato (GS-SG)
per formare glutatione ridotto (GSH).
Cosa fa la GR?
GSSG + NADPH
GR
2GSH + NADP+
Cosa è la Km?
È la concentrazione di substrato alla quale la
velocità dell’enzima è pari a Vmax/2
Curva di
Michealis e
Manten
Come si calcola la Km?
Il metodo migliore e più preciso è quello di
riportare i dati cinetici su un grafico dei
doppi reciproci.
Grafico dei
doppi
reciproci
Come si misura la Km?
Per calcolare la Km di un enzima si
effettuano diversi dosaggi
mantenendo costante la
concentrazione dell’enzima e
variando invece la concentrazione
del substrato per cui si intende
trovare la relativa Km.
Nel nostro caso cercheremo di
trovare la Km della Glutatione
Reduttasi per il GSSG
DOSAGGIO ENZIMATICO
Tampone K/fosfato 0.2 M
EDTA 1mM, pH 7.5
500 µl
DTNB 3mM in Tampone
K/Fosfato 10 mM pH 7.5
250 µl
NADPH 2mM
20 µl
GS-SG 20 mM
50 µl
5 µl
10 µl
175 µl
170µl
Glutatione Reduttasi 1:500
H2O
__________
1.00 ml
DOSAGGIO DELLA KM
l
Tampone K/fosfato 0.2
M EDTA 1mM, pH 7.5
500
DTNB 3mM in Tampone
K/Fosfato 10 mM pH
7.5
250
NADPH 2mM
20
GS-SG 400 µM *
10
20
30
40
50
60
H2O
200
190
180
170
160
150
Glutatione Reduttasi
1:500
20
Totale
1 ml
* concentrazioni GSSG: 4 8 12 16 20 24 μM.