Lezione V-VI
martedì 18-X-2011
corso di genomica
laurea magistrale Biotecnologia
Industriale
aula 8
orario : Martedì ore 14.00 - 16.00
Giovedì ore 13.00 - 15.00
non ci sarà lezione martedì 1 e giovedì 3 Novembre
D. Frezza
se vi indignate
Non prendetevela con me !
Certo si potrebbe protestare di più e meglio sullo scarso
investimento sulla cultura, ma è un ventennio che nessuno
ci investe ed i risultati si vedono
Poca tecnologia nei nuovi investimenti a tutti i livelli
Questo per esempio è un settore in grande sviluppo ma
per operarci in Italia non ci sono molti spazi
perché le riflessioni su evoluzione
È come dover parlare di architettura senza
sapere con quali materiali si costruisce
Nell’800 è stato iserito l’uso dell’acciaio
in edilizia(tour Eiffel 1889)
Anche i romani conoscevano il calcestruzzo
ed il ferro però ne producevano di meno
Quic kTime™ e un
dec ompres sore TIFF (Non c ompres so)
s ono nec es sari per visualiz zare ques t'immagine.
Poi il cemento armato ha permesso strutture
molto più leggere
Senza sapere come sono venuti fuori i genomi la descrizione
sarebbe piatta e di difficile comprensione
polarismi scoperta con i sequenziamenti
procarioti ed eucarioti : variazione e conservazione
mettiamo insieme queste due evenienze formamlmente in
opposizione.
abbiamo visto che esiste una polarità
una discrepanza logica che appare spesso in natura,
la polarità è compatibile senza dover eliminare una delle due
forme polari ?
come possiamo rendere compatibile una contrapposizione
così forte?
la risposta la sapete già: è possibile
i meccanismi che rendono possibile abbiamo detto che
giocano sulla variabile tempo
gestire il polarismo
salviamo il polarismo utilizzando questa contraddizione,
possono coesistere entrambe: variabilità e conservazione
il primo nei tempi lunghi, il secondo nel tempo breve
Abbiamo già detto: era implicita in Mendel la conservazione
era implicita in Darwin la variabilità delle specie una nell’altra
Sembrava difficile trovare la soluzione
quando è stata scoperta la mutagenesi si è aperta
una nuova finestra per interpretare questi due
fenomeni!
la variabilità come mutazione
In the 1920s, Hermann Muller discovered that x-rays
caused mutations in fruit flies. He went on to use x-rays to
create Drosophila mutants that he used in his studies of
genetics. He also discovered that x-rays not only mutate
genes in fruit flies but also have effects on the genetic
makeup of humans.[1] The first mutagens to be identified
were carcinogens, or cancer-causing substances. Early
physicians detected tumors in patients more than 2,000
years before the discovery of chromosomes and DNA. In
500 B.C., the Greek Hippocrates named crab-shaped
tumors cancer, meaning crab.
1 Campbell, Neil A. and Jane B. Reece. Biology. 7th ed. San Francisco, CA: Pearson
Education, Inc, 2005.
scoperta legata ad un evento tragico
chi scoprì il fenomeno legato alla variabilità genetica se ne
accorse associando l’uso di sostanze tossiche belliche ad
eventi di trasformazione genetica: le mutazioni
prima Muller con Drosofila e raggi X, poi UV e poi la
chimica: mostarda azotata, azoiprite ed altre in seguito,
scoperte dalla Charlotte Auerbach
mutagenesi chimica
The discovery of Mustard Gas by Charlotte Auerbach
and Robson
Science. 1947 Mar 7;105(2723):243-7.
The Chemical Production of Mutations.
Auerbach C, Robson JM, Carr JG.
Nature. 1946 Mar 9;157:302.
Chemical production of mutations.
AUERBACH C, ROBSON JM.
Perspectives on genetics: anecdotal, historical, and critical ... - Google Books Result
James Franklin Crow, William F. Dove - 2000 - Medical - 723 pages
June 1993 The Discovery of Mustard Gas Mutagenesis by Auerbach and Robson in
... had been obtained from experiments on chemical mutagenesis prior to 1940. ...
books.google.it/books?isbn=029916604X...
bilanciato il polarismo?
possono coesistere variabilità e conservazione
studio dei genomi tramite sequenziamento completo
slancio nella ricerca genomica e sviluppo di nuove tecniche
nuove applicazioni di tecniche già note per sveltire i metodi
i genomi a disposizione
le nuove evidenze:
procarioti compatti ma senza meiosi (aploidi)
eucarioti con nuove strutture per la diploidia
la complicazione a partire dagli eucarioti unicellulari
lieviti, funghi, (Saccharomyces, Neurospora)
strutture di base invariate già dai procarioti:
RNA, ribosomi, tRNA, polimerasi, membrane,
la conoscenza negli eucarioti
strutture paraloghe che assumono nuove funzioni
(omologie analogie)
ma le nuove strutture ancora non si conoscono
si parte dai geni, ma sono il 5%
TUTTO IL RESTO é nuovo e questa è GENOMICA
si sapeva che c’era il DNA ripetuto: trasposoni, regioni GC
rich, mini e microsatelliti e poi?
Si consideravano regioni ricche di AT poco informative
i meccanismi dell’evoluzione elementare
i processi evolutivi sono lontani da essere compresi
nella complessità
alcuni sono evidenti dalle analisi genomiche più semplici
come abbiamo detto i confronti “evolutivi” ci aiutano
i confronti ci parlano del rapporto tra funzione e strutture
i geni divergono e si duplicano
Geni ortologhi e geni paraloghi
Geni ortologhi: geni simili riscontrabili in organismi correlati tra
loro. Il fenomeno della speciazione porta alla divergenza dei
geni e quindi delle proteine che essi codificano.
es. la -globina di uomo e di topo hanno iniziato a divergere
circa 80 milioni di anni fa, quando avvenne la divisione che
dette vita ai primati e ai roditori. I due geni sono da considerarsi
ortologhi.
Geni paraloghi: geni originati dalla duplicazione di un unico
gene nello stesso organismo.
es. -globina e -globina umana hanno iniziato a divergere in
seguito alla duplicazione di un gene globinico ancestrale. I due
geni sono da considerarsi paraloghi.
variabilità per divergenza
Gene ancestrale
duplicazione genica
Gene A
Gene B
speciazione
Gene A1
ortologhi
Gene A2
paraloghi
Gene B1
Specie 1
ortologhi
Gene B2
Specie 2
alla scoperta del genoma:
allontanandosi dai geni
(cod. geni < del 5% del genoma)
ricerca delle funzioni: analogia con il periodo
precedente alla scoperta del codice genetico
interpretazioni: studi attraverso i confronti su modelli
i modelli sono validi perchè è esistita l’evoluzione
conclusione: il genoma è dinamico a breve e lungo termine
come ha fatto ad attrezzarsi per poter evolvere?
come mai si usano organismi modello: ribadiamolo
è possibile perchè ci sono:
- i geni ortologhi (stessa origine nell’ancestrale e divergenza
nelle specie successive), hanno la stessa funzione nelle
specie diverse
- i geni paraloghi derivano da duplicazioni e possono
mantenere funzioni simili (DNA binding, kinasi ecc.)
(l’evoluzione rimane la premessa inevitabile)
l’unica spiegazione sembra autocelebrativa,
tautologica
il genoma non poteva esistere senza interazione
(per definizione)
se la vita è nata nel mondo ad RNA e poi è venuto il DNA
ed ha cominciato ad interagire con proteine diventandone
dipendente, ma anche il responsabile, l’informazione
genetica non poteva non essere dinamica.
come sarebbe il genoma non interattivo?
da dove parte l’interattività del genoma
non c’è funzione che non preveda interazione con altre
strutture ed enzimi, l’informazione passa attraverso
interazioni
- potrebbe risultare passivo quando deve essere
replicato/duplicato; la struttura rende possibile ogni altra
funzione che già conosciamo o che è ancora da individuare
- sembra passivo ma non lo è nemmeno per la sintesi
dell’mRNA, manda segnali e ne riceve continuamente
cambia strutturalmente : per il differenziamento: epigenetica
meiosi: gameti: zigote: embrione: adulto
interazione del genoma nelle varie fasi
sotto il nome della regolazione
la struttura (anatomia)
informazioni per le funzioni
anche solo per la trascrizione la cromatina si altera
la trasformazione inizia molto prima della trascrizione
trascrizione = una delle funzioni finali
non c’è soluzione di continuità
l’interazione non è saltuaria
tutto il ciclo vitale di ogni organismo prevede interazione
dinamica
ad ogni passaggio il DNA-cromatina subisce
trasformazione, alterazioni
dallo zigote alle mitosi al differenziamento, ogni fase
prevede quella successiva,il genoma riceve messaggi
continuamente per sapere se fermarsi, procedere e
cambiare funzioni
ovvio ma fondamentale
l’interazione genoma “ ambiente “ è continuo
gli stimoli devono permettere la reattività
ci deve essere esecuzione del programma
ci deve essere flessibilità
il programma può andare avanti se c’è “feedback”
bidirezionalità della trasformazione
funzionale
genoma (cromatina)
ambiente: nucleo, citoplasma,
extracellulare.....ecc.
quando il genoma si attiva è perchè c’è l’ambiente
giusto per far partire determinate funzioni
come si inserisce la variabilità
le differenze esistono, si sono accumulate,
ad ogni meiosi si rimescolano
ogni organismo che nasce ha un genoma “ricombinante”
cosa comporta questa diversificazione ?
microvariabilità
i polimorfismi :
genetica quantitativa
Interattoma modulabile (non solo tra proteine)
modulazione dovuta ad effetti dei polimorfismi
(osservati col confronto tra fenotipi/genotipi)
turn-over (rapidità-lentezza)
effetti a cascata (attivazioni tramite trasformazioni posttraduzionali: fosforilazioni, metilazioni, glicosilazioni ecc.)
trasduzione del segnale tipica dell’interazione intra-extra
cellulare e citoplasmatica - nucleare
dal nucleo al genoma e viceversa (ciclo continuo)
andata e ritorno
l’informazione arriva all’informatore e riparte
(difficile separare i ruoli nel ciclo continuo)
è un artificio porre un inizio e scegliere lo zigote come
start-point, si potrebbero prendere i gameti o le gonadi o
l’individuo adulto
la trasduzione del segnale mette in comunicazione le varie
parti della cellula e quindi dell’organismo
ogni punto di un ciclo può essere scelto come inizio o fine
adesso prendiamo il genoma come nostro riferimento
come possiamo approcciare il genoma in maniera globale
la post genomica (di già?)
dopo il sequenziamento dei genomi interi
ancora una volta si scopre di non sapere
è l’inizio del salto verso la genomica regolativa /
o dello studio del genoma non tradotto
è riduttivo credere che si conosca il genoma
conoscendo solo la porzione codificante
conseguenza: una parte del trascrittoma non è noto
ignorando una bella parte delle funzioni del genoma
post genomica non significa che la genomica sia superata,
va capito che non basta conoscere le sequenze genomiche
approcci globali e olistici
nuove metodologie
trascrittoma
proteoma - interattoma
ma il restante 95%?
95% ? wide genome screening
screening con tecniche diverse
studio nuovo
cosa si può analizzare
in che maniera
genomica obbligatoriamente porta al confronto tra i vari
possibili organismi modello o intraspecie
centralità del modello umano oppure riferimento al
modello umano (ricchezza di polimorfismi)
ricerca di modelli per trovare semplificazioni e
generalizzazioni
cosa si vuole vedere ?
come sempre: strutture e variabilità
micro-arrays per ibridazione
resequencing shot-gun parziali o globali
SNPs e VNR
ogni 500 bp del genoma
i vari approcci
i diversi modelli permettono di produrre i nuovi approcci
e le diverse tecniche
dalle domande generali a quelle più specifiche verso i
meccanismi sottostanti
allargare l’interattoma anche alla interazione col genoma
pensare in maniera globale
cercare di essere onnicomprensivi (presuntuoso ma
necessario)
il problema globale
rischio di genericità tutto o niente
lo studio con le libraies è stato l’inizio
i metodi globali: osservazioni col grand’angolo
necessità di non perdere anche i particolari
guardare dal satellite ma con una risoluzione altissima
osservazione diretta e indiretta
in quasi tutte le scienze si passa alla oservazione indiretta
il DNA o le proteine non le vediamo, abbiamo prove
indirette
ci fidiamo delle osservazioni indirette ed il metodo passa
attraverso l’uso dei controlli ossia della contraffabilità del
risultato
ancora di più vale per bioinformatica in cui si lavora sotto
simulazione
convergenza delle osservazioni e riprove
l’uso di organismi modello come riprova della universalità
osservazioni riproposte anche su organismi di specie diverse
difficoltà di riscontrare patologie in organismi molto diversi
possibilità di osservare fenotipi simili in organismi anche
molto diversi
generalità di un fenomeno riscontrabile su altre specie
(quanto più è generale)
troppi esempi
a riprova dell’universalità dei promotori eucariotici e
procariotici : tutti i costrutti inducibili o costitutivi transfettati
cosa possiamo fare per capire il genoma nell’era
post-genomica
mantenere la capacità di analisi nelle interazioni / variazioni
nel contesto e fuori contesto
in vitro veritas
fenotipi mutanti e polimorfismi
come può essere l’approccio sperimentale?
dove si guarda: nei possibili target (regioni predette) o
con un sistema non “bias” onnicomprensivo senza
selezione
cercando le funzioni genomiche
creazione di esche per trovare con cosa interagiscono
riprova in vivo con l’organismo transgenico per avere una
conferma
approccio simmetrico
da un fenotipo ricerca del fenomeno da riprodurre in vitro
verificare se lo stesso costrutto interagisce con le stesse
proteine
Esempio: tentativi non sempre di successo con two-hybrid
systems, le tecniche hanno delle approssimazioni
esca e oggetto interagente (isolamento e conferma in vitro)
transcription factories
Passando alla struttura del genoma, nuove tecniche ed ipotesi
Simposio sulla struttura e funzioni del genoma
Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology
CSH 17 maggio 2011, vol. LXXV
CH Eskiw, NF Cope, I Clay, S Schoenfelder, T Nagano and
P Fraser.
Laboratory of Chromatin and Gene Expression, The
Babraham Institute, Cambridge CB22 3AT, United
Kingdom Correspondence: [email protected]
abstract transcript fact.CSHQ
The dynamic compartmental organization of the transcriptional
machinery in mammalian nuclei places particular constraints on
the spatial organization of the genome. The clustering of active
RNA polymerase I transcription units from several chromosomes at nucleoli is probably the best-characterized and
universally accepted example. RNA polymerase II localization in
mam- malian nuclei occurs in distinct concentrated foci that are
several-fold fewer in number compared to the number of active
genes and transcription units. Individual transcribed genes
cluster at these shared transcription factories in a nonrandom
manner, pref- erentially associating with heterologous,
coregulated genes. We suggest that the three-dimensional (3D)
conformation and rel- ative arrangement of chromosomes in the
nucleus has a major role in delivering tissue-specific geneexpression programs.
riassunto art. Eskiw- Fraser
Il sistema dinamico della compartimentazione della macchina
della trascrizione nel nucleo dei mammiferi pone dei limiti alla
organizzazione spaziale del genoma. La localizzazione delle
unità attive di trascrizione della RNA pol I di parecchi
cromosomi nei nucleoli è l’esempio meglio caratterizzato ed
accettato universalmente.
I foci della RNA pol II concentrati nei nuclei di mamm. sono di
meno rispetto al numero di geni ed alle unità di trascrizione.
Unità di trascrizione di cluster di geni sono associate in
maniera non random a “transcription factories” condivise in
preferenza con geni eterologhi coregolati. Suggeriamo che la
conformazione 3D e arrangiamenti relativi dei cromosomi nel
nucleo abbiano un ruolo importante per attivare programmi di
espressione genica tessuto specifica.
introduzione dell’articolo
Nella introduzione si parla di molti argomenti di questo
corso di genomica. E’ grande interesse però è una storia
che vi dovete leggere voi e di cui in gran parte vi ho già
parlato nelle lezioni introduttive sulla genomica, per
definirla ed identificarla.
Differente conoscenza
Tra nucleo e citoplasma
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
del nucleo si sa abbastanza poco:
nucleolo, nucleoplasma, membrana
interna/esterna, pori, cromatina (euetero), ribosomi, ~matrice nucleare
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
del citoplasma: vacuoli, RE, centrioli,
lisosomi, mitocondri, Golgi app.,
vescicole, citosol, citoscheletro, pori
etc.
attività trascrizionale dei geni
Trascrizione dei geni più attivi discontinua e ad impulsi
Geni singoli alternano brevi periodi ad alta attività
trascrizionale a periodi inattivi di durata variabile.
Il 90% degli alleli di  e  globina sono attivi allo stadio
corretto con analisi FISH (fluoresc. in situ hybridization)
Topi transgenici con LCR deleta mostrano un pattern on / off
dinamico suggerendo che la presenza stabilizzi lo stato on.
Tutte le cellule esprimono un basso livello di globina, ma solo
una frazione mostra segnali di trascrizione con RNA FISH.
Per la maggior parte degli altri geni con FISH con sonde
introniche si vede che geni attivi sono “off” per la maggior
parte del tempo. (LCR = locus control region)
conseguenze regolative
La conseguenza di questi stadi di inattività
prolungata è che questi geni possono essere
modulati variando i livelli di espreessione
genica alternando dinamicamente le fasi “on” e
fasi “off”.
Molto diverso che non modulare una fase di
trascrizione continua rallentandola o
accelerandola.
geni associano dinamicamente con
“transcription factories”
Le TF (transcription factories) sono foci nucleari discreti che
contengono alte conc. di RNA pol II fosforilata e sti di
produzione di RNA nascente.
Analisi di geni singoli con immuno-FISH mostra
invariabilmente segnali associati ai foci di RNApol II con la
nascente sintesi di RNA nelle TF.
Analisi con immuno-FISH mostrano che gli alleli inattivi di geni
attivi sono lontani dalle TF.
la cromatina dinamica nei territori
occupati
Ipotesi :
la dinamica della cromatina porta molti geni in attività a
ricollocarsi fuori dai territori cromosomici
I geni perciò si muovono in TF preassemblate quando sono
attivi ?
Inoltre i movimenti dinamici della cromatina hanno un ruolo
nella regolazione della trascrizione muovendosi dentro e fuori
dalle TF?
gene modello -globina
Tecnica RNA-FISH
cellule eritroidi in fase di maturazione
associazione di quasi tutti gli alleli nelle TF
Doppia marcatura di geni lontani attivi dello stesso
cromosoma associano e condividono gli stessi TF dei geni
della globina ad alte frequenze.
Geni a megabasi di distanza colocalizzano al 40-50% di
più di una localizzazione random.
Colocalizzazione di geni distanti con un’altra tecnica: 3C
chromosome conformational capture.
altre evidenze con linfociti B murini
Linfociti B murini “resting” di milza esprimono alti livelli di IgH
Quasi tutti i loci delle catena IgH mostrano segnali RNAFISH associati a TF
- è un sist. modello come la  globina per le cellule eritroidi
- induz. di geni early (Fos, Myc) in B resting
- Fos e Myc non erano espressi al t.0
- dopo 5 minuti la > parte di alleli F e M erano trascritti ed
associati nei foci con RNA pol II; al 30% Fos sta a ~30
Mb dal locus IgH sul chrms 12 di topo
- Myc sul crms 15 risulta al 25% nelle TF del locus IgH