Automated counting of
phytoplankton by
pattern recognition: a comparison
with a
manual counting method
K. V. EMBLETON, C. E. GIBSON AND S. I. HEANEY
Introduzione
• In questo articolo si mettono a confronto 2 metodi di
•
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•
•
studio del fitoplancton nel lago Lough Neagh nell’Irlanda
del nord: uso di reti neurali e analisi manuali.
Problema: le misure manuali tramite microscopio
richiedono troppo tempo.
L’analisi delle immagini in modo automatico e il metodo
del pattern recognition permette l’identificazione, il
conteggio e le misurazioni del fitoplancton.
Trasformazione dei dati in parametri utilizzati dalle reti
neurali.
Confronto del volume totale delle cellule ottenuto dai 2
metodi.
Metodologia: analisi convenzionali
• Il campione selezionato per l’analisi fa parte del
•
•
•
programma di monitoraggio del Dipartimento
dell’Agricoltura dell’Irlanda del nord (DANI).
I campioni sono raccolti in superficie e fissati con la
soluzione di Lugol.
I vetrini studiati al microscopio invertito, sono di 2.2 ml
con diametro 26 mm.
Analizzate 4 specie di volume noto: 2 cianobatteri
filamentosi Planktothrix agardhii (Gomont) Anagnostidis
e Limnothrix redekei (Van Goor) Meffert; colonia di
diatomea Aulacoseira subarctica (Müller) Haworth; la
diatomea Stephanodiscus astraea (Eh.) Kütz.
Metodologia: sistema automatico di
conteggio
• I vetrini per l’analisi automatico sono di volume 0.71 ml.
• La media del numero di oggetti contenuti per ogni
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immagine è nel range 1.6-12.5.
Microscopio utilizzato è Olympus con ingrandimento 20x.
Macchina fotografica Sony DXC-930P.
Dimensioni immagini 768x576 pixel.
Analisi immagini con pacchetto software KS400.
Le reti neurali usano NeuroSolution.
I risultati portati poi in fogli Excel.
Metodologia: elaborazione delle
immagini
• L’acquisizione, il trattamento e l’analisi delle
•
•
immagini è controllato da una macro scritta nel
pacchetto software KS400.
Le foto sono scattate da un operatore che
calibra la luminosità e la messa a fuoco.
Per ogni foto viene fissata una soglia per
identificare le regioni di interesse trasformandola
in un’immagine binaria (2 livelli di grigio).
Metodologia: elaborazione delle
immagini
• Vengono eliminati i bordi e riempiti i buchi
•
•
•
•
all’interno delle regioni di interesse.
All’immagine binaria viene applicato un filtro
mediano per lisciare i contorni.
Le regioni troppo piccole vengono eliminate.
Con l’uso di un filtro passa basso vengono
identificati gli incroci fra i filamenti.
Infine ogni regione viene etichettata.
Metodologia: elaborazione delle
immagini
a. immagine al
b.
c.
d.
e.
f.
microscopio.
Soglia binaria.
Filtro mediano.
Filtro passa basso.
Identificazione
incroci.
Immagine
etichettata.
Reti neurali
• Funzionano come il cervello umano, fatti di tanti neuroni
•
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•
che lavorano insieme per risolvere un problema.
Imparano per esempi.
Si occupano del riconoscimento delle immagini (Pixel
[0,255]).
Si ha una risposta finale che è si o no.
Esiste una fase di addestramento e uno di
funzionamento.
Implicazione più importante pattern recognition.
Esistono diversi tipi di reti neurali: feed-forward,
feedback.
Addestramento delle reti neurali
• Viene stabilito un set di 74 parametri per ogni
•
•
•
immagine (per lo più geometrici).
Il database contenente i parametri viene
riempito anche con parametri di oggetti estranei
per addestrare e riconoscere i falsi.
Tutte le reti neurali utilizzate sono feed-forward
MLP addestrate con l’algoritmo di back
propagation.
Ogni rete ha come nodi di input un sottoinsieme
dei 74 parametri, un hidden layer di 10 nodi, 1
solo nodo di output (range +1,-1).
Addestramento delle reti neurali
• Sono stati fatti tentativi con più hidden layer
•
•
senza un miglioramento apprezzabile del
risultato.
Durante l’addestramento i pesi sui nodi venivano
continuamente aggiustati anche a mano per
ridurre l’errore tra risultato desiderato ed
ottenuto.
Il database contenente i valori dei parametri è
stato diviso in 2 parti.
Addestramento delle reti neurali
• 80% dei dati è stato usato come insieme
•
•
•
•
d’addestramento, 20% come test della rete.
L’addestramento è continuato finchè l’errore sul test set
non ha cominciato ad aumentare invece che diminuire.
Per ognuna delle 4 specie è stata fatto una differente
rete neurale.
L’output di queste reti era “riconosciuto” o “non
riconosciuto”.
Questo approccio è stato scelto in previsione di
aggiungere nuove specie.
Addestramento delle reti neurali
• In questo modo per ogni specie nuova si aggiunge una
•
•
•
rete nuova simile alle precedenti.
Altrimenti usando una sola rete con più nodi di output
ogni nuova aggiunta comporterebbe il riaddestramento
di una nuova rete.
Ogni rete aveva come parametri di input solo un piccolo
insieme dei 74 parametri misurati, diverso per ogni rete,
scelto in modo da ottimizzare il riconoscimento.
Si sono usate delle regole aggiuntive sui parametri per
validare la classificazione ottenuta dalla rete.
Nella tabella sotto sono
riportati i parametri
considerati ottimali in
quanto comportano
minori errori.
Nella tabella sono riportati i 74 parametri ottenuti
dalle misurazioni dei campioni.
Prova del sistema
• I classificatori sono stati testati prendendo
campioni del lago Lough Neagh, 75
immagini per ogni campione.
• I volumi sono stati calcolati a mano e con
il metodo automatico per il confronto dei
risultati.
• 5 campioni sono stati messi da parte per
poter poi ripetere la procedura più volte.
Risultati
• La procedura automatica
richiede 7 minuti circa di
tempo operatore per scattare
75 foto per ogni campione; 3040 minuti di tempo di
computazione.
• Alla fine della procedura
automatica viene generato una
tabella in Excel per la
visualizzazione dei risultati.
Risultati
• Confronto fra metodo manuale e automatico.
• Il volume calcolato automaticamente è entro il 10% di quello
calcolato manualmente.
• La misura del volume può essere soggetta a doppio errore che si
compensa (mancate identificazioni compensate da falsi positivi).
Risultati
• Confronto fra le classificazioni delle singole
•
specie.
Problemi nel distinguere tra 2 specie filamentose
simili.
Risultati
• Confronto tra i volumi delle singole specie.
• Risultato simile alla precedente siccome il
volume medio è sempre lo stesso.
Confronto su analisi ripetute di 5 campioni.
Conclusioni
• Vantaggi del sistema automatico: veloce, richiede meno
•
•
•
esperienza, dà risultati accettabili nella stima del volume
totale.
Con il progredire della tecnologia (macchine digitali più
sofisticate, maggiore risoluzione, maggiori capacità di
calcolo) è possibile ridurre gli errori.
Sono richiesti ulteriori studi per affinare la scelta dei
parametri delle immagini da utilizzare nelle reti neurali.
Con minor parametri (scelti opportunamente) in input si
risparmia tempo e si riducono gli errori.
Conclusioni
• La maggior parte degli errori è dovuta a cellule
•
•
in contatto fra loro difficilmente separabili con
tecniche di elaborazione delle immagini.
Molti altri errori sono dovuti alla larghezza dei
filamenti che con la risoluzione utilizzata spesso
era di 2-3 pixel (il filtro mediano li cancella).
Il contrasto può essere migliorato con l’utilizzo
della soluzione di Lugol o con l’utilizzo della
fluorescenza (o anche tramite il metodo del
Calcofluor nel caso dei dinoflagellati).
Ordine Peridiniales Haeckel 1894:
Famiglia Protoperidiniaceae Balech 1988
• Protoperidinium steinii e
Protoperidinium conicum
Ordine Dynophysiales Lindemann 1928:
Famiglia Dinophysiaceae Stein 1883
• Dinophysis rotundata
Claparède et Lachmann
• Dinophysis sacculus
Stein