Principali applicazioni della PCR
1)
Clonaggio di geni e screening di librerie genomiche
2)
Manipolazioni e sequenziamento del DNA
3)
DNA fingerprinting in medicina legale (test di paternità e di identificazione di
reperti biologici)
4)
Ricerca di OGM e tracciabilità degli alimenti
5)
Test per rilevare infezioni batteriche e virali (HIV, Mycobacterium tubercolosis)
6)
Test per l’identificazione di oncogeni (ras)
7)
Studi di evoluzione molecolare (DNA antico)
8)
Studi del polimorfismo del DNA
Screening of clones
PCR asimmetrica
Questa applicazione della PCR è usata comunemente in
laboratorio per il sequenziamento del DNA
Sequence was determined
form single-stranded DNA
generated by asymmetric
PCR from either DNA (A)
or RT-PCR (from RNA
extracted) (B).
GAT C
GAT C
Genetic testing
Sickle-cell anemia is a serious genetic disorder characterized by
weakness, fatigue, heart failure, abdominal pain, impaired mental
function and eventual death. The HbS molecules attach to one
another forming long fibers that cause erythrocytes to assume a
sickle shape. The HbS molecules in sickle hemoglobin have reduced
oxygen affinity.
The sickle-cell anemia test is based on Restriction
Fragment Length Polymorphism (RFLP) Analysis
(wt locus, DdeI cuts)
(mutant, DdeI does not cut)
The HBB locus encodes the b subunit of hemoglobin
(a2b2). The mutation is a substitution Glu-Val in the
sixth amino acid residue of b subunit.
Rivelazione del gene dell’anemia falciforme mediante la tecnica degli RFLP applicata ai
prodotti di PCR
a)
Amplificazione mediante PCR della porzione del gene della globina b contenente il tratto mutato.
b)
Digestione dei prodotti di PCR con l’enzima CvnI.
c)
Pattern elettroforetico: AA condizione omozigotica per il gene wt; AS condizione eterozigotica;
SS condizione omozigotica per il gene
dell’anemia falciforme.
CCTGAGGAG (wt)
CCTGTGGAG (mutante)
CvnI riconosce la sequenza CCTNAGG.
L’ endonucleasi di restrizione mostra 3 siti di
taglio sulla sequenza wt e 2 sulla sequenza
mutata (anemia falciforme).
Multiplex PCR allows analysis of two or more targets simultaneously. This PCR technique is used
for genetic screening, microsatellite analysis, and other applications where it is necessary to amplify
several products in a single reaction.
Missing band
In this assay multiplex PCR was conducted with primers specific for 8 exons and the promoter region
of human dystrophin gene (N° of expected fragments = 9) Note the PCR band missing at 410 bp,
possibly indicating a deletion.
Diagnosi prenatale e determinazione del
sesso
La sequenza DYZ1 (3,5 kb) è presente nel cromosoma Y in ben
5000 copie. Mediante PCR (60-80 cicli) si amplifica un
frammento di 154 bp che è peculiare dei maschi al fine di
individuare malattie ereditarie legate al cromosoma X.
Y-specific primers (154 bp)
Alu control primers (130 bp)
Ladder
Samples
154 bp 
1
2
3
4
5 L 1
2
3
4
5
 130 bp
Identificazione OGM
1) Estrazione del DNA
2) Amplificazione DNA
- Si amplifica il promotore 35S (virus del mosaico del cavolfiore) e/o il terminatore Nos (presenti negli
alimenti contenenti OGM)
- si amplificano anche altri geni di controllo (C) per valutare l’amplificabilità del DNA estratto (es:
lectina della soia, la zeina del mais, il tRNA della leucina per i vegetali)
3) Controllo degli amplificati
OGM+
OGM-
su gel di agarosio
4) Analisi dei risultati
Se lo screening è positivo si effettua una PCR
specifica per identificare con precisione di quale
OGM si tratti ( es. mais Bt-176 o soia Roundup
Ready ecc.)
PCR Quantitativa
DNA fingerprinting
Minisatellites, 10-100 bp repeated several times in tandem (Variable Number Tandem Repeats)
Microsatellites, 2-4 bp repeated several times in tandem (Short Tandem Repeat Polymorphisms)
Tandem nucleotide repeat are generated by slippage
mutation (insertion or deletion) occurring during DNA
replication.
PCR amplification of microsatellite
markers using primers flanking the
STRP
In England, 1983 and 1986, two
15-year-old girls raped and
murdered, with only evidence,
semen.
One man convicted.
Later, DNA fingerprinting—the first
of its kind—showed that DNA in
both cases was the same—but not of
the man already in prison.
DNA of local people taken, and
criminal found.
Colin Pitchfork (born March 1960,
England) is a British criminal, the
first convicted of murder based on
DNA fingerprinting evidence, and the
first to be caught as a result of mass
DNA screening.
Colin
Pitchfork
Figure
12.1
DNA fingerprinting in Forensic Science
In most of the cases, DNA fingerprinting is based on
minisatellite or microsatellite markers.
When different probes are used to make several fingerprints,
the likelihood that any two individuals chosen at random will
have identical matches in all of them is extremely small, less
than 1 in 1 trillion.
mother
DNA fingerprinting in Paternity Testing
The DNA markers in a
DNA fingerprinting
are inherited
?
Is he the father?
Il DNA Mitocondriale
Poiché il DNA mitocondriale (16,6 KB) viene ereditato esclusivamente dalla madre (ovulo), ogni
individuo entro una determinata linea materna avrà lo stesso DNA mitocondriale; ad esempio, tutti i
figli di una donna hanno lo stesso DNA mitocondriale, la nonna materna ha lo stesso DNA
mitocondriale dei nipoti che sono figli di sua figlia.
Il Test del DNA Mitocondriale (mtDNA) serve quindi a determinare la parentela di due o più
persone attraverso la linea materna.
Questo test può essere quindi utilizzato
- per stabilire se fratelli e sorelle presunti sono figli della stessa madre,
- per stabilire le relazioni di parentela dal lato materno della famiglia (zii, zie, nonne,
ecc.),
- come alternativa al classico test del DNA in casi di forense, quando la concentrazione
di DNA nel campione sia molto bassa o degradata.
DNA mitocondriale: regioni variabili
In Scienze forensi si utilizzano due regioni
polimorfiche, (HV1 e HV2) costituenti il
cosiddetto D-loop mitocondriale, lunghe
complessivamente circa 600 bp.
Il vantaggio di usare il test del DNA
mitocondriale risiede nel fatto che se non è
possibile ottenere un campione di DNA dalla
madre, può anche essere utilizzato un
campione prelevato dalla nonna o di
un’altro parente materno.
Nella 2° generazione e in quelle
successive, solo i discendenti per
linea materna condividono lo
stesso DNA mitocondriale.
Random Amplified
Polymorphic DNA (RAPD)
• I campioni 1 e 2 mostrano un pattern elettroforetico simile con i
primers A e C.
•
•Usando il primer B è invece possibile distinguere i 2 campioni.
• I primer usati nella RAPD sono solitamente oligonucleotidi lunghi
9-10 basi e caratterizzati da un elevato contenuto in C-G (50-80%).
Qualora un primer si ibrida a entrambi i filamenti sul DNA target
con il giusto orientamento e i due siti di annealing distano 100-3000
bp, si amplificherà la regione interposta con formazione di un
caratteristico frammento di DNA.
La RAPD costituisce un altro tipo di DNA fingerprinting ed è
utilizzabile per tipizzazione di un organismo (identity tags).
Nel genoma umano (3x109)
un oligonucleotide di 10
basi a sequenza casuale è
rappresentato circa 3000
volte
DNA fingerprinting e
marcatori molecolari
I marcatori ottenuti mediante RFLP, analisi dei
minisatelliti e dei microsatelliti o mediante
RAPD sono trasmessi come caratteri
dominanti e recessivi.
Un marcatore molecolare è un sito
eterogigote per qualche tipo di variazione
neutra del DNA (nessun cambiamento
apprezzabile del fenotipo).
marker
polimorfico
Tutti gli individui rappresentano la
progenie dello stesso incrocio (Aa x aa)
 Individui affetti da una
patologia
Rapporto genotipico 1:1
Uso di quattro microsatelliti allelici di
diversa grandezza (M’-M’’’’) come
marcatori molecolari. Il marcatore M’’ è
probabilmente associato con l’allele P
che causa la malattia.
M’’
PCR quantitativa “Real-Time”
Resa teorica della PCR: 2n
Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n)
Il prodotto di PCR dipende da T, numero di copie di template di partenza
P=(2)n T
AMOUNT OF DNA
AMOUNT OF DNA
1400000000
1200000000
1000000000
800000000
600000000
fase esponenziale
400000000
200000000
0
0
5
10
15
20
25
30
35
10000000000
1000000000
100000000
10000000
1000000
100000
10000
1000
100
10
1
plateau
Log[DNA]
plateau
1600000000
fase esponenziale
0
5
PCR CYCLE NUMBER
10
20
25
PCR CYCLE NUMBER
Resa effettiva: effetto plateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da:
Quantità dei primers
Attività della Taq polimerasi
Reannealing dei filamenti
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti
15
30
35
Il plateau non dipende dal numero
iniziale di molecole stampo T
Anche se la quantità iniziale di template è la medesima, il plateau è raggiunto in tempi
diversi ed in cicli diversi.
25
PCR product
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
Cycle
Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale in cui il prodotto di PCR è proporzionale
al template iniziale.
Questo è reso possibile mediante il rilevamento di una fluorescenza che è proporzionale al
prodotto di PCR.
La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno
strumento quantitativo e dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica
della reazione di PCR.
La Real-Time misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase
esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è
influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di
ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end
point“.
1. halogen tungsten lamp
2a. excitation filters
2a. excitation filters
4. sample plate
2b. emission filters
3. intensifier
5. ccd detector
Il segnale di fluorescenza può
essere generato da:
1) coloranti fluorescenti che
si intercalano nel DNA a
doppio filamento;
2) da sonde fluorescenti
sequenza-specifiche.
Incremento di
Curva di amplificazione
fluorescenza
Cicli di PCR
Nella Real-Time PCR, i primi cicli, in
cui non è misurabile la variazione nel
segnale della fluorescenza,
definiscono un importante parametro:
la linea base (baseline) della curva.
Linea soglia
Un aumento della fluorescenza oltre
la linea base indica il rilevamento del
prodotto di PCR in fase di accumulo.
Linea di base
Ct
Un secondo parametro importante è la linea-soglia: tale linea, parallela alla linea di base,
deve tagliare le curve dei campioni nella loro fase di crescita esponenziale.
La curva di amplificazione di ogni campione taglia la linea-soglia in un punto, chiamato ciclosoglia (threshold cycle) definibile come il numero del ciclo (o frazione di questo numero) in
cui la curva di amplificazione del campione in fase esponenziale taglia la linea-soglia.
Il ciclo-soglia, al contrario di un valore misurato alla fine dell'amplificazione, è un indicatore
fedele della quantità iniziale di DNA.
Linea soglia
Il diagramma del logaritmo delle quantità iniziali di DNA nei confronti dei valori di
ciclo-soglia è una retta.
Ciò significa che, se nella reazione erano presenti campioni a quantità nota di DNA,
standards (●), dai quali viene ricavata una retta di riferimento, diventa possibile calcolare la
quantità di DNA iniziale presente in campioni oggetto di studio (●).


S1

S2


ANALISI QUANTITATIVA ASSOLUTA
La quantizzazione assoluta permette di
calcolare il numero reale di molecole di acido
nucleico presenti nel campione e richiede
l’utilizzo di standards. Lo standard è costituito
da un campione di DNA a concentrazione
esattamente nota. Generalmente l’amplicone da
usare come standard viene clonato.
Il calcolo della concentrazione di DNA o cDNA
in campioni sconosciuti si ottiene determinando il
ciclo soglia (Ct).
I valori di Ct sono proporzionali al logaritmo del
numero di copie iniziali del target.
ANALISI QUANTITATIVA RELATIVA
Nella quantificazione relativa vengono comparati tra loro i valori di espressione genica (cDNA) tra 2 o più
campioni : il risultato è rappresentato dal rapporto. La principale differenza tra la quantificazione relativa ed
assoluta è che nella quantificazione assoluta viene utilizzata una quantità nota in entrata (esatto numero di
copie del DNA stampo) mentre in un’analisi di tipo relativo vengono analizzate le variazioni del livello di
espressione rispetto ad un controllo interno. In questi esperimenti viene confrontato un gene di riferimento o
housekeeping gene necessario per la normalizzazione dei campioni in esame.
I geni housekeeping sono presenti in tutte le cellule nucleate e nelle cellule batteriche e sono considerati
essenziali per la sopravvivenza delle stesse. La sintesi dell’mRNA di questi geni è considerata essere stabile
nei vari tessuti, anche sotto trattamento sperimentale. I geni housekeeping utilizzati più frequentemente sono:
ß-actina, Gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi, (GADPH), ATP sintetasi, rRNA.
RT-PCR convenzionale
Real-time RT-PCR
Reverse
transcription
PCR
reaction
Reverse
transcription
ANALISI dell’RNA
Nested
PCR reaction
Gel
electrophoresis
DNA
sequencing
Southern
blot
Manual or
automated
analysis
PCR reaction
Quantitative
results
SYBR GRENN
All’ inizio dell’amplificazione le molecole di colorante
non sono legate e producono una fluorescenza
molto debole. Infatti il SYBR GRENN legato al
dsDNA, se eccitato, fluoresce con un’intensità 100
volte maggiore di quando è libero in soluzione.
Dopo l’annealing dei primers, si legano
poche molecole fluorescenti alla doppia
elica. Il colorante si lega al solco
minore del DNA.
Durante l’elongazione le molecole di colorante si
legano al DNA neosintetizzato. Se la reazione è
monitorata continuamente si ha un aumento di
fluorescenza in real-time.
Il fatto che SYBR GREEN si leghi al dsDNA senza specificità di sequenza fa si che si debba
verificare che il segnale ottenuto non sia dovuto a prodotti aspecifici o dimeri di primers. Per
questo motivo alla fine dell’amplificazione si fa una curva di melting o di dissociazione.
La curva di melting consiste in una rampa di temperatura che parte al di sotto del punto di
melting dei prodotti di amplificazione e gradualmente aumenta fino ad oltrepassare la Tm
degli stessi. Ciò permette di distinguere i vari prodotti di PCR sulla base della temperatura
relativa di dissociazione, che dipende dalla lunghezza della sequenza e dal contenuto in G/C.
Quando i 2 filamenti si separano la fluorescenza decresce velocemente. Il software rielabora le variazioni
di fluorescenza, Relative Fluorescence Units, (RFU) in funzione del tempo (T) secondo la seguente
espressione: (-d(RFU)/dT)
Il picco rappresenta la melting temperature (Tm).
prodotti
specifici
prodotti
aspecifici
Un’ alternativa più specifica dei coloranti fluorescenti (SYBER GRENN) sono le sonde
sequenza-specifiche marcate con uno o più fluorofori; in questo caso il segnale
fluorescente è prodotto solo se nella reazione è presente il bersaglio specifico (amplicone).
Le più diffuse sono:
1) Sonde di idrolisi (o sonde Taqman)
2) Molecular beacons
3) Sonde di ibridizzazione
4) Scorpions
Le sonde sequenza-specifiche basano la loro funzione sul FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfer).
Il FRET è un trasferimento di energia distanza-dipendente tra due fluorofori adiacenti che
avviene se:
- le molecole di colorante fluorescente accettore e donatore sono vicine
- lo spettro di assorbimento dell’accettore si sovrappone allo spettro di emissione del
donatore
Donor
(reporter)
Acceptor
(quencher)
Zona di sovrapposizione dello spettro
di emissione del donatore con lo
spettro di assorbimento dell’ accettore
Esistono due tipi principali di FRET:
FRET che porta all’emissione di fluorescenza (il segnale fluorescente emesso dal donatore
(reporter) eccitato è assorbito dal accettore (quencher) che lo riemette sotto forma di segnale
fluorescente.
Sonde di ibridizzazione.
FRET che porta al quenching fluorescente (il segnale fluorescente emesso dal donatore
(reporter) eccitato è assorbito dall’accettore (quencher) che lo riemette sotto forma di
vibrazioni, calore o bassa fluorescenza.
Sonde Taqman, molecular beacons e scorpions.
Sonde Taqman
Le sonde di idrolisi o sonde Taqman sono costituite da oligonucleotidi marcati in 5' con un
fluoroforo reporter (donatore) e in 3', o internamente, con un quencher (accettore); vengono
disegnate in modo che si leghino ad una sequenza specifica del bersaglio compresa tra i
primers forward e reverse. Le sonde intatte non emettono fluorescenza perché la vicinanza
del quencher al reporter induce una soppressione della fluorescenza del reporter a causa del
FRET.
No fluorescenza
Nella fase di estensione dei
primers, la sonda Taqman,
complementare alla sequenza
dell'amplicone, si lega al prodotto
PCR e, quando viene raggiunta
dalla polimerasi, subisce l'idrolisi
da parte dello stesso enzima
(attività 5’3’ esonucleolitica). A
questo punto, il fluoroforo (dye),
allontanato dal quencher, se
eccitato, emette fluorescenza.
Emissione di
fluorescenza
Molecular Beacons
Sono una variante delle sonde Taqman. Hanno una struttura a forcina con le
sequenze dello stelo che sono complementari tra loro e la sequenza dell’ansa che è
complementare ad una sequenza specifica presente sul DNA bersaglio. Alle
estremità i due bracci hanno un fluoroforo e un quencher estremamente vicini.
Quando la Molecular Beacon si lega alla sequenza bersaglio lo stem si apre
facendo aumentare la distanza tra fluoroforo e quencher; in questo modo non c’è
più trasferimento di energia dall’una all’altro e si ha un aumento della fluorescenza.
Emissione di
fluorescenza
Hybridization Probes
L’oligo 1 è marcato con la fluoresceina al 3’ mentre
l’oligo 2 ha una molecola fluorescente diversa, LC
Red 640, all’estremità 5’.
La sequenza dei due oligonucleotidi è selezionata in
modo che, nel frammento di DNA da amplificare, si
leghino con un arrangiamento testa-coda: in questo
modo i due coloranti fluorescenti sono posizionati
ad una opportuna distanza.
La fluoresceina (donatore) è eccitata dalla
radiazione luminosa ed emette una luce
fluorescente verde. Quando i due coloranti sono
vicini l’energia emessa eccita LC Red 640
(accettore) legata all’altro oligo che di
conseguenza emette una luce fluorescente rossa.
Questo trasferimento di energia è fortemente
dipendente dallo spazio tra i 2 fluorofori: solo se le
2 molecole sono molto vicine tra loro (1–5
nucleotidi) si ha ET (Energy Transfer) ad alta
efficienza.
Impieghi della Real-Time PCR
studio dell’espressione genica
rilevazione di patogeni
rilevazione di OGM
determinazione della carica batterica e virale
monitoraggio di terapie
discriminazione allelica
rilevazione SNPs (single nucleotide polymorphisms)
stima del gene transfer nella terapia genica