Regioni di controllo (enhancers, silencers)
Esoni
Introni
Promotore
DNA intergenico
ATG = codone di inizio
Segnale di Poly-A
* = codone di stop
A
B
D
C
ATG
*
A BCD E
mRNA
F
AAAAAAA
*
ATG
5’UTR
E
CDS
3’ UTR
F
Per gli organismi eucariotici più evoluti il ‘dogma’ un
gene = una proteina non vale per la maggior parte dei
geni. Infatti esistono diverse possibilità di produrre
mRNA alternativi a partire dallo stesso gene. In
particolare possono essere regolati in maniera alternativa
l’inizio della trascrizione, la fine della trascrizione e lo
splicing. Questi meccanismi sono spesso regolati in
maniera molto fine durante lo sviluppo e il
differenziamento dei diversi tessuti. Per questo motivo,
più che di geni, è corretto parlare di unità trascrizionali.
Per molte unità trascrizionali si assiste ad una
combinazione di questi meccanismi, con il risultato di
una regolazione estremamente complessa.
Inizio alternativo della trascrizione
A
C
D
A BCD E
F
B
mRNA 1
AAAAAAA
CD E
mRNA 2
E
F
AAAAAAA
F
Uso di segnali di poliadenilazione alternativi
A
B
C
D
E
b
a
A BCD E
mRNA 1
F
b
A BCD
mRNA 2
a
AAAAAAA
F
AAAAAAA
Splicing alternativo
A
C
D
A BCD E
F
B
mRNA 1
E
AAAAAAA
A BC E
mRNA 2
F
AAAAAAA
A BCD F
AAAAAAA
mRNA 3
mRNA 4
A BC
F
AAAAAAA
F
Altre possibilità di controllo dell’espressione genica
• La quantità di un dato mRNA in una
cellula dipende dal bilancio netto tra la
sua produzione e la sua degradazione.
• Non necessariamente esiste una
corrispondenza precisa tra i livelli di
mRNA e della proteina da questo
codificata.
• Oltre ai meccanismi post-trascrizionali,
la funzione dei prodotti di un gene può
essere regolata da meccanismi posttraduzionali (degradazione,
stabilizzazione e altre modificazioni
covalenti e non covalenti delle proteine).
Trascrittoma
Insieme degli RNA messaggeri prodotti da una
determinata popolazione cellulare. Per ogni tipo
cellulare diverso sono espressi all’incirca 10000 geni
diversi.
Proteoma
Insieme delle proteine prodotte da una determinata
popolazione cellulare.
Tecniche utilizzabili per misurare
l’espressione genica a livello dell’mRNA
Misurazione dell’espressione di geni singoli
• Northern Blot (su RNA totale o su mRNA purificato)
• Ribonuclease protection assay
• RT-PCR
• Nuclear run-on
•Ibridizzazione ‘in situ’
Misurazione simultanea dell’espressione di più geni
(anche migliaia)
• Macroarrays
• Microarrays
Purificazione dell’mRNA
• L’mRNA rappresenta il 2-4 %
dell’RNA totale presente nelle cellule.
• L’mRNA può essere purificato
mediante cromatografia di affinità con
oligo-dT legata a diversi supporti solidi.
• L’mRNA purificato prende anche il
nome di poly-A+, e rappresenta la base
per diverse procedure di analisi di
espressione, oltre che per la sintesi del
cDNA necessario alla produzione di
genoteche.
Northern Blotting
-
28S
18S
7S
+
• L’RNA (totale o poly-A+) viene
frazionato mediante corsa elettroforetica
su gel di agarosio deneturante (il gel
contiene formaldeide, e preima della corsa
i campioni vengono denaturati in
formamide). Questo è necessario per far sì
che le molecole di RNA si separino in base
al loro peso molecolare, e non in base alla
forma. Dopo la corsa si procede come per
il Southern blot.
Northern Blotting
Caratteristiche del Northern Blotting
• Tecnica non particolarmente sensibile. La sensibilità può essere
aumentata notevolmente se invece dell’RNA totale si usa l’RNA polyA+. Infatti il quantitativo di RNA che si può caricare su un gel di
agarosio è 50 mg. Se invece di caricare RNA totale carico un uguale
quantitativo di poly-A+, posso avere un segnale fino a 50 volte
maggiore.
• L’uso di mRNA purificato elimina anche la possibilità di ibridazione
non-specifica con l’rRNA.
• Metodica quantitativa. L’intensità del segnale dipende dal numero di
molecole presenti sul filtro. Se ho uno standard e conosco da quante
cellule sono partito posso arrivare a stimare il numero di molecole di
mRNA per cellula.
• Oltre a misurare i livelli di espressione permette di valutare il peso
molecolare dei trascritti, e consente di caratterizzare eventuali isoforme
alternative .
• Questa tecnica richiede che l’RNA sia il più integro possibile. Anche
solo una rottura per molecola di mRNA determina una forte riduzione
del segnale specifico.
Esempio di Northern Blotting su RNA da tessuti
A BCD E
mRNA
F
AAAAAAA
Sonda1
Sonda 2
Sonda1
B
L K
H
Sonda2
M
B
L K
H
M
Concetto di normalizzazione
Sonda gene X
0
5’ 10’ 30’ 60’
Sonda GAPDH (controllo)
0
5’ 10’ 30’ 60’
Nel campione a 10’ non c’è una riduzione reale, ma ho caricato meno RNA o
questo si è degradato.
Quando si vuole comparare l’espressione di un gene in diversi campioni, per
essere sicuri che le variazioni osservate siano reali bisogna sempre confrontare il
segnale ottenuto con la sonda specifica con quello di un controllo interno, di cui
so già che i livelli di espressione sono stabili nelle condizioni studiate. Quindi
non si va a valutare l’intensità assoluta del segnale, ma il rapporto tra il segnale
specifico e quello del controllo. Questa procedura si chiama normalizzazione.
Ribonuclease protection assay
Questa metodica sfrutta il principio che ibridi RNA-RNA non vengono
digeriti dall’enzima ribonucleasi A.
Produzione sonda di RNA antisenso marcata
Promotore
3’
cDNA X
(200bp)
5’
Vettore
Eco RI
Eco RI
Ribonuclease protection assay
Produzione sonda di RNA antisenso marcata
cRNA
RNA polimerasi
Nucleotidi marcati
Ribonuclease protection assay
Ibridazione
mRNA
cRNA
X
X
X
X
Ribonuclease protection assay
X
X
Digestione con ribonulceasi A
Ribonuclease protection assay
Rivelazione
• I prodotti della digestione vengono sottoposti a corsa elettroforetica
su gel di poliacrilamide denaturante (8M urea) e ad autoradiografia.
• In definitiva è l’mRNA che protegge la sonda dalla degradazione; più
mRNA è presente, maggiore è il numero di molecole di sonda protette
e quindi maggiore è il segnale
Caratteristiche dell’RNAse potection assay
• Tecnica molto più sensibile e specifica del Northen blot su RNA totale,
più o meno allo stesso livello di Northern su poly-A+, ma non richiede la
purificazione dell’RNA
• La metodica è quantitativa solo se si opera in eccesso di sonda.
Esempi
Molecole di sonda
1000
1000
1000
1000
Molecole di mRNA
10
30
2000
4000
Molecole protette
Eccesso di
10
sonda
30
Sonda
1000
limitante
1000
• Non permette di misurare il peso molecolare dei trascritti, poiché il
peso molecolare dei prodotti è determinato dalla sonda
• E’ meno delicata del Northern rispetto all’integrità dell’mRNA
• Piuttosto indaginosa
RT-PCR
•Estrazione di mRNA
•Sintesi del cDNA utilizzando trascrittasi inversa
(priming possibile con oligo-dT, oligo random o
primer specifico)
•Amplificazione con oligonucleotidi specifici
•Elettroforesi su gel di agarosio
Caratteristiche dell’RT-PCR
• E’ in assoluto la tecnica più sensibile, in quanto utilizza la PCR.
• Non richiede purificazione dell’mRNA
• Richiede pochissimo RNA di partenza (si può partire da qualche
decina di cellule)
• Semplice e rapida
• Funziona anche su RNA parzialmente degradato
• Non da informazioni sul peso molecolare dell’mRNA
• Non è quantitativa a meno di non usare particolari accorgimenti
Plateau
12000
10000
8000
Fase esponenziale
Campione 1
6000
Campione 2
4000
17
15
13
11
9
7
5
3
0
1
Fase lineare
2000
Cinetica di amplificazione
Scala lineare
Scala logaritmica
10000
10000
1000
8000
Campione 1
6000
Campione 2
Campione 1
100
Campione 2
4000
10
2000
1
1
2
17
15
13
11
9
7
5
3
0
1
Numero di molecole
12000
1
3
5
7
9
11
13
15
17
Cicli di amplificazione
1 2
Reazione fermata a 8 cicli
Reazione fermata a 15 cicli
RT-PCR quantitativa
• Se la reazione viene fermata quando nei diversi campioni la cinetica di
amplificazione è ancora esponenziale, la differenza di intensità delle
bande che si ottengono correndo su gel i diversi campioni riflette la
differenza del numero iniziale di molecole (metodica semi-quantitativa).
• Come nel caso del Northern, se si vuole essere sicuri che differenze di
intensità tra i campioni riflettano delle differenze di espressione,
bisogna rapportare i valori assoluti ad un controllo interno, costituito
da un RNA di cui si sa che non ci sono variazioni nelle condizioni
sperimentali utilizzate.
• Recentemente è stata sviluppata una nuova metodica: la Real Time
PCR. Questa consente di seguire la cinetica di reazione nel tempo ed è
quindi estremamente quantitativa.
La Real Time PCR sfrutta il fenomeno fisico FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Real Time PCR, metodo TaqMan
Taq polymerase
TaqMan probe
P1
5’
3’
P2
L’attività esonucleasica
5’>3’ della Taq polimerasi
distrugge il probe,
causando la scomparsa
della FRET
Nuclear run-on
Se osservo differenze di espressione di un determinato gene in ude
diversi campioni con uno qualsiasi dei metodi precedenti, non posso dire
se queste differenze dipendono da un aumento della trascrizione o da
una diminuzione della degradazione dell’mRNA. Per rispondere a
questa domanda si usa la tecnica del nuclear run-on
Cellule
Nuclei
Rottura della membrana plasmatica
(ad es. lisi osmotica)
Cantrifugazione a bassa velocità
Nuclear run-on
Nuclei
Marcatura RNA nascenti
UTP radioattivo
Estrazione RNA
hn-RNA
Campione 1
1
Campione 2
Ibridazione e
lavaggi
2
Filtri con cDNA
di un gene X
non marcato
Autoradiografia
Ibridazione in situ
• Questa metodica si basa sull’ibridazione di sonde di cRNA marcate
direttamente su cellule o tessuti. Si può ibridare su sezioni istologiche o su
materiale non sezionato (in quest’ultimo caso si parla whole-mount).
• E’ l’unica tecnica che permette di localizzare l’espressione di un dato
mRNA a livello delle singole cellule.
• Ideale per studiare i geni espressi in un gruppo ristretto di cellule
all’interno di un tessuto, o i geni la cui espressione è modulata nel tempo e
nello spazio (estremamente utilizzata negli studi di biologia dello sviluppo).
Ibridazione in situ
Se si fa su sezioni le sonde si cRNA possono essere marcate con
radioattività (in genere 35S), con biotina o digossigenina. Il metodo
radioattivo è più sensibile e affidabile.
Esempi
Ibridazione in situ
Se si fa su materiale non sezionato si usano sonde marcate con biotina o
digossigenina. Questo consente anche di fare doppie marcature.
Esempi
Misurazione espressione a livello della proteina
Western Blotting
SDS-PAGE
Misurazione espressione a livello della proteina
Western Blotting
Electroblotting
Misurazione espressione a livello della proteina
Western Blotting
Immunodetection
Misurazione espressione a livello della proteina
2D-Gel electrophoresis