Anno Accademico 2010/2011
Laurea Magistrale in
CHIMICA
Analisi degli alimenti
(LMC-5: NITROSAMMINE)
Giorgio Bonaga
ANALISI DELLE NITROSAMMINE
NITROSAMMINE
I nitroso-composti (NOC) comunemente chiamati nitrosoammine sono un
gruppo di sostanze di diversa struttura chimica che contengono un gruppo
funzionale -N-N=O. Si formano per reazione di un agente nitrosante
(HNO2, NO2 NOCl, ecc.) con ammine secondarie, terziarie e più raramente
quaternarie. L’attenzione verso queste sostanze è dovuta a tre ragioni:
1.
2.
3.
molte nitrosammine sono potenti cancerogeni verso molte specie
animali;
molte nitrosammine sono risultate mutageniche;
livelli relativamente elevati di alcune nitrosammine si possono formare
negli alimenti e bevande (birra, formaggi, ecc.), specialmente quelli
conservati con nitriti e nitrati (carni).
La World Health Organization (WHO) raccomanda per gli alimenti freschi e
affumicati una concentrazione di N-nitrosammine compresa tra 0,002 e 0,004
mg/kg (2 - 4 ppb).
La sintesi delle nitrosammine, come conseguenza dell’assunzione di nitriti e
nitrati presenti negli alimenti, avviene nello stomaco dove si realizzano le
condizioni ambientali (pH ≈ 3, elevata concentrazione degli ioni cloro del
succo gastrico) per la sintesi del cloruro di nitrosile (Cl-N=O), il vero agente
nitrosante della ammine secondarie e terziarie.
I.
+H
-
+
O N O
+H
O N
OH
+
+ H
O N O
H
+ Cl
-
pH ≈ 3
X N O + H 2O
cloruro di nitrosile
II.
R
R
N H
+
R
N,N-dialchilammina
X N
N N
O
O
+
H X
R
N-nitroso-N,N-dialchilammina
I nitriti e nitrati sono additivi comuni delle carni conservate (bovine, suine,
ecc.) perché svolgono 3 funzioni importanti:
1.
2.
3.
impediscono lo sviluppo del Clostridium botulinum, un batterio la cui
tossina è molto pericolosa (botulismo);
reagiscono con la mioglobina (il pigmento della carne) per formare
nitroso-mioglobina, di colore rosso vivo;
sono sinergici con il NaCl, il sale impiegato nella salagione e nella
stagionatura delle carni.
Anche se i nitrati sono più stabili e meno tossici dei nitriti, in realtà si
convertono parzialmente in nitriti per azione della nitratoriduttasi. Per
stabilire la congruità con le disposizioni di legge sul contenuto di nitrati (250
mg/kg carne) e di nitriti (150 mg/kg carne), una prima analisi è quella del
dosaggio dei due sali. La determinazione dei nitriti e dei nitrati negli
alimenti viene fatta, tradizionalmente, con metodi spettrofotometrici il cui
limite è la scarsa sensibilità nella rivelazione di tracce di analiti e le frequenti
interferenze della matrice. Attualmente si preferisce la HPLC che è più
accurata, rapida e sensibile, anche se frequentemente questa tecnica richiede
procedure laboriose per la precipitazione delle proteine e/o una
purificazione del campione attraverso una SPE.
ANALISI DEI NITRITI E DEI NITRATI
I nitriti e i nitrati vengono estratti da campioni (di carne) e analizzati direttamente.
10 g (salame o prosciutto) + 100 ml H2O
omogenizzazione
estrazione (70-80°C, 15 min)
ESTRATTO
centrifugazione
filtrazione
FILTRATO
HPLC
nitrito
A
nitrato
B
nitrito
nitrato
Fig. 1 – HPLC (anion-exchange chromatography) di nitriti e nitrati nel prosciutto (A)
e nel salame (B).
PRECOLONNA: IonPac AS11
COLONNA: IonPac AG11
FASE MOBILE: soluzione 5 mM NaOH
DETECTOR: UVD a 225 nm
PRODOTTO
NITRITI
(mg/kg carne)
NITRATI
(mg/kg carne)
salame
108
99
prosciutto
12
6
ANALISI DELLE NITROSAMMINE
Le diverse tecniche analitiche utilizzate più tradizionalmente per il dosaggio
delle nitrosammine volatili negli alimenti sono poco sensibili, come la TLC,
o richiedono una strumentazione complessa e costosa (GC-MS e CL). Per
questi motivi negli ultimi anni la HPLC, specialmente la tecnica RPC, è il
metodo più utilizzato, nonostante la necessità di derivatizzare gli analiti per
migliorare la sensibilità del rivelatore FLD.
100 g (alimento) + 100 ml H2O
omogeneizzazione
+ 10 g NaCl + 10 g Na2SO4
+ 5 ml soluzione al 2% H2N-C6H4-SO3H
+ 10 ml soluzione 1N H2SO4
distillazione in corrente di vapore
CONDENSATO
estrazione con CH2Cl2 (5 x 10 ml)
filtrazione
FILTRATO
evaporazione
derivatizzazione (dansyl chloride)
HPLC
1 = N-nitroso-N,N-dimetilammina (NDMA)
2 = N-nitroso-N,N-dietilammina (NDEA)
3 = N-nitroso-N,N-dipropilammina (NDPA)
Fig. 1 –
HPLC di N-nitrosammine (dansyl-derivati) di estratto di salame.
COLONNA: 80 mm x 2 mm, Zorbax ODS 5,0 mm
FASE MOBILE: ACN:H2O = 2:1
VELOCITA’ FLUSSO: 150 ml/min
DETECTOR: FLD (lex 350 nm, lem 530 nm)
1 = N-nitroso-N,N-dimetilammina (NDMA)
2 = N-nitroso-N,N-dietilammina (NDEA)
3 = N-nitroso-pirrolidina (NPYR)
4 = N-nitroso-piperazina (NPIP)
5 = N-nitroso-N,N-dibutilammina (NDBA)
TOTALE = (1,0+1,2+0,8+1,3+1,1) = 5,4 ppb
Fig. 1 – TIC della GC-MS di nitrosammine estratte (SPE) da aringhe affumicate (hot).
COLONNA: 30 m x 0,25 mm, HP-1701 f.t. 0,25 mm
TEMPERATURA: 35 (1’)
240 (1’), 50°C/min
CARRIER GAS (He): 1,0 ml/min
DETECTOR: MS (CI - NH3)