STERILIZZAZIONE
Processo che si prefigge di distruggere su un substrato o in un
determinato ambiente tutte le forme di vita, spore comprese.
La sterilizzazione è perseguibile con:
MEZZI FISICI
MEZZI CHIMICI
Filtrazione
Calore
Radiazioni
STERILIZZAZIONE CON IL CALORE
Il calore è considerato il mezzo più sicuro, rapido ed
economico per qualsiasi materiale che non sia
termolabile.
Il tempo di sterilizzazione decresce con l’aumentare
della temperatura.
Il calore può essere usato essenzialmente in due modi:
•SECCO
•UMIDO
In entrambi i casi l’azione biocida del
calore deriva dall’ossidazione dei
costituenti cellulari con denaturazione
irreversibile degli enzimi e delle
strutture proteiche.
La sensibilità del calore varia in
rapporto al loro contenuto in H2O: più
questa è alta, più sensibili sono i
microrganismi al calore.
La sterilizzazione con il calore può essere ottenuta usando:
incenerimento
CALORE SECCO
Stufa di Pasteur
ebollizione
CALORE UMIDO
autoclave (vapore saturo)
Il principio fisico che sta alla base dei due diversi metodi è che il
vapore è un migliore conduttore termico rispetto al calore secco,
cioè: a parità di temperatura, la sterilizzazione è raggiunta in un
tempo minore.
CALORE SECCO
Si usano le Stufe Pasteur o a secco in cui il calore si
trasmette per convezione o irraggiamento dalle pareti
della stessa.
Utile per materiale termoresistente, non corrode.
Il tempo di morte termica nella stufa a secco è il seguente:
30’
a 180°C
50’
a 170°C
120’ a 160°C
150’ a 150°C
I parametri di funzionamento sono 2:
TEMPERATURA
TEMPO
CALORE UMIDO
Ebollizione
E’ il metodo più semplice per la sterilizzazione
dell’acqua e di oggetti in essa immersi o dei
recipienti stessi.
L’ebollizione va prolungata per almeno 20’
Vapore sotto pressione (autoclave)
Si usa vapore saturo, sotto pressione.
Il ciclo di base è 121° C per 15’ ad 1 atmosfera.
Parametri di funzionamento dell’autoclave:
• temperatura
• tempo
• pressione
STERILIZZAZIONE CON LE RADIAZIONI
RADIAZIONI IONIZZANTI
I raggi g (gamma) sono fotoni ad elevata energia.
Le radiazioni ionizzanti agiscono trasferendo la loro energia
all’interno della cellula colpita, la cui sensibilità è proporzionale
alla quantità di DNA presente, che viene alterato.
Tutto materiale di plastica sterilizzato con radiazioni gamma.
RADIAZIONI ULTRAVIOLETTE (UV)
Le
radiazioni
UV
sono
radiazioni
elettromagnetiche prodotte dal bombardamento,
con elettroni o con un fascio di raggi catodici, di
un bersaglio di metallo pesante (lampade
germicide).
I RAGGI UV
•Risultano poco penetranti ed agiscono per
trasformazione fotochimica delle basi pirimidiniche del
DNA cellulare.
•La sterilizzazione con i raggi UV è adoperata
soprattutto nei laboratori scientifici per trattare l’aria.
•Il tempo di esposizione può essere permanente e
l’esposizione deve avvenire quando i locali trattati non
sono utilizzati. Questo perché i raggi UV sono molto
irritanti per le mucose (occhi in particolare).
Alcune delle tecniche di laboratorio possono inavvertitamente
generare schizzi ed aerosol; le cabine di sicurezza biologica sono
attrezzature che agiscono come barriere, eliminando o riducendo
il rischio di infezioni via aria impedendo la diffusione degli aerosol
e degli schizzi verso l’operatore e l’ambiente esterno e nello
stesso tempo garantiscono la sicurezza del campione prevenendo
contaminazioni esterne e crociate.
Flusso laminare: flusso unidirezionale di aria sterile, filtrata
attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro ed aventi tutti la
stessa velocità, generalmente di 0,45 m/sec. I filetti di aria
sterile trascinano lontano dall’area di lavoro i contaminanti
ed evitano la formazioni di vortici, quindi il flusso d’aria viene
“raddrizzato” generando un flusso d’aria laminare, ossia
unidirezionale e privo di turbolenze.
Filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air): prevengono
la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di
microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la
superficie filtrante; l’efficienza è la capacità di trattenere
particelle di 0,3 µm di diametro e deve essere compresa tra
99,97% e 99,99%.
Cappa a flusso laminare verticale
A. Aria contaminata in uscita
B. Schermo Frontale
C. Filtro HEPA
D. Motoventilatore
Buona prassi di lavoro
Spegnere sempre la lampada U.V. in presenza dell’operatore;
anche se quest’ultimo è presente nella stanza in cui è situata la
cappa
Accendere la cappa almeno 10 min prima di iniziare a lavorare
Posizionare il vetro frontale, se del tipo a scorrimento,
all’altezza di sicurezza per l’operatore (20-30 cm)
Ridurre al minimo il materiale sul piano di lavoro
Operare nella parte media e posteriore del piano di lavoro
Evitare l’utilizzo di fiamme: provocano turbolenze e possono
danneggiare il filtro HEPA; evitare movimenti bruschi; non
inserire altro materiale a lavoro iniziato
Rimuovere immediatamente rovesciamenti di materiale
biologico
A lavoro terminato, lasciare la cappa in funzione per 10 min,
per “pulire” una eventuale aerocontaminazione dispersa
Pulizia e disinfezione della cappa ogni volta che si termina il
lavoro
Chiudere la cappa, accendere la lampada U.V.
Colture di cellule di mammifero
•
•
in sospensione
in monostrato
• colture primarie
• linee continue: immortalizzate e tumorali
Mentre le cellule di procarioti hanno
tempi di duplicazione brevi (circa 2030 min), le cellule di mammifero hanno
tempi di duplicazione lunghi (in media
circa 12-24h)
• L’ingresso indesiderato di microorganismi nel terreno di coltura è
dannoso, in quanto questi competono con le cellule in coltura
(che generalmente hanno ritmo di crescita inferiore) e possono
secernere sostanze tossiche. Tipici contaminanti sono batteri,
micoplasmi, lieviti, muffe.
• In caso di infezione batterica il terreno vira in fretta (acidifica) e
intorbidisce. Le infezioni da micoplasmi sono più subdole, in
quanto il microorganismo è meno visibile e richiede un paio di
settimane per formare colonie visibili.
• Questo pericolo determina la prassi di aggiungere antibiotici al
terreno (es: streptomicina-penicillina); va ricordato che sono stabili
per pochi giorni a 37°C.
Contaminants
(100X)
Types of Cells
Cultured cells are usually described based on their morphology (shape and
appearance) or their functional characteristics.
There are three basic morphologies:
1. Epithelial: cells that are attached to a substrate and appear flattened
and polygonal in shape.
2. Lymphoblast: cells that do not attach normally to a substrate but
remain in suspension with a spherical shape.
3. Fibroblast: cells that are attached to a substrate and appear
elongated and bipolar, frequently forming swirls in heavy cultures.
It is important to remember that the culture conditions play an
important role in determining shape and that many cell cultures are
capable of exhibiting multiple morphologies.
The Caco-2 cell line is a continuous cell of heterogeneous
human epithelial colon adenocarcinoma
Cellule in sospensione
Il mezzo extracellulare
1) Fase gassosa
2) Temperatura
3) Terreno di coltura
4) Substrato di adesione
1) Fase gassosa
– Saturazione umidità
– CO2 is normally produced by cells
– CO2 is fed to incubator by tank: 5%
– HCO3- (bicarbonate) is present as a result of the
buffer salt and as a result of CO2 dissolved in the
medium.
pH of medium: 7.2/7.4
• Il sistema tampone più comunemente utilizzato è
bicarbonato/acido carbonico
• Il pH viene monitorato aggiungendo un indicatore come il rosso
fenolo (giallo a pH acido, rosso-viola a pH alti).
• Red dye indicates pH
– Reddish-pink = 7.2 – 7.4
– Purple = too basic (CO2 concentration is too low)
• CO2 feed to the incubator needs to be adjusted
• contamination
• Humidity too low
• Dead cells
– Yellow = too acidic (CO2 concentration is too high)
• Cells need to be re-fed
• Bacterial contamination
• CO2 feed to the incubator needs to be adjusted
2) Temperatura
• Le cellule di mammifero crescono a 37°C, sature
di umidità, in un mezzo tamponato a pH ~7.3.
3) Terreno di coltura
•
•
•
•
•
Amminoacidi
Vitamine
Sali
Glucosio
Indicatore
Basic
Culture
Medium
Basic Culture Medium (IMDM) Add:
1) Antibiotics
2) Serum
3) Glutamin
TERRENO COMPLETO
4) Substrato di adesione
Plastica di 2 tipi:
Treated: per tissue colture
Un-treated: per suspension
NB: l’aspetto delle piastre è identico, leggere
sempre con attenzione sulla confezione!!!
Culture Dishes (plates)
and
Flasks
• Flasks
–
–
–
–
Capped vessels
Geometria del collo per ridurre rischi
Harder to manipulate cells in vessel
Students most often forget to loosen cap
to allow air into vessel
• Well-plates
– Multiple areas for experiments with
multiple variables
– 6, 12, 24, 48, 96 well plates
• Dishes
– Easy to manipulate cells
– Large surface area could create
evaporation issues
– Easier to spill or contaminate
Esercitazione di oggi
1) Scomplementazione del siero
2) Preparazione terreni (compl, HAT,…)
3) Conta cells
4) Piastrare cells: mieloma e B16
Scomplementazione del Siero
Alla fine del 1800 Nuttal aveva capito che era
presente qualcosa di litico nel siero degli animali
o delle persone immunizzate. Nel siero c’era
un’attività termolabile, in grado di lisare i batteri,
quando gli animali erano sensibilizzati contro quei
batteri.
Scaldando mezz’ora a 56°C, veniva persa la
capacità di uccidere i batteri. Ciò significa che nel
siero è presente una componente termolabile,
unitamente ad una componente termostabile
(ovvero, gli anticorpi).
L’esperimento era fatto in questo modo: venivano presi dei
batteri, e del siero iperimmune (ovvero da un animale
immunizzato più volte) verso i batteri, tale siero uccideva i
batteri.
Tale siero perdeva la sua attività litica con un riscaldamento a
56°C per mezz’ora. Un altro siero proveniente da un animale
non immunizzato non uccide ovviamente i batteri, ma è capace
di "complementare" l’attività litica del siero scaldato.
- termolabile, ed aspecifica
- termostabile, specifica
Quella termolabile è data appunto dalle proteine del
complemento, quella termostabile è data invece dagli
anticorpi.
1) Scomplementazione del siero
Incubare il siero nel bagnetto a 56°C per 30 minuti.
Dopo l’incubazione filtrare il siero scomplementato con un
filtrino da 0,2 µm. Per questa operazione bisogna versare
il siero in una siringa da 5 ml in cui è stato
precedentemente sostituito l’ago con l’apposito filtrino (di
colore blu).
2) Terreni di coltura
Terreno IMDM 10% FBS o “Terreno Completo”
Terreno (IMDM) vol. Tot 2 x 50 ml
Penicellina/stre
ptomicina
L- Glutammina
FBS
Conc.
Iniziale
Conc.
Finale
100x
1x
200mM
2mM
100%
10%
Terreno Selettivo HAT completo
Terreno (IMDM o DMEM) vol. Tot. 50 ml
Conc. Conc.
Iniziale Finale
Penicellina/stre 100x
ptomicina
L- Glutammina 200mM
2mM
FBS
HAT
10%
1x
100%
50x
1x
3) CONTA delle CELLULE:
•Centrifugare le sospensione cellulari fornite a 1200
rpm per 5 minuti
•buttare via il surnatante con una pipetta da 10 ml
(facendo bene attenzione a non toccare il pellet
cellulare), lasciando circa 3-4 mm di supernatante
•Risospendere le cellule “picchettando” con un dito il
fondo della falcon
•Aggiungere 1 ml di terreno completo
•Prelevare sterilmente 10 µl di sospensione cellulare e
fare le opportune diluizioni (1:5)
•Prelevare 10µl del campione cellulare diluito
•Con la Gilson P20, mettere 10 µl nella camera di
conta
•Contare almeno 3 quadranti
Esempio: Ponendo come diluizione X, prelevando
10µl del campione cellulare, una volta contate le
cellule e fatta la media matematica il calcolo da fare
per sapere il n° di cellule/ ml sarà:
x (Numero medio di cellule per quadrante) x fattore
di diluizione finale
10-4 ( volume del quadrante)
A questo punto calcolare il numero di cellule necessario da
piastrare, aggiungervi un opportune volume di terreno
fresco e piastrare secondo le indicazione nelle piastre
opportune.