STRESS OSSIDATIVO
Stress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente, di
un eccesso di specie chimiche reattive, generalmente centrate
sull’ossigeno (reactive oxygen species, ROS), secondario ad
un’aumentata produzione delle stesse e/o a una ridotta
efficienza dei sistemi fisiologici di difesa antiossidanti.
Protezione
dalle malattie
Antiossidanti
Radicali liberi
Danno cellulare
(invecchiamento
e malattie)
STRESS OSSIDATIVO
Sbilanciamento dell’equilibrio tra pro-ossidanti e antiossidanti
nell’organismo a favore dei pro-ossidanti
PRO-OSSIDANTI
ANTIOSSIDANTI
Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi proossidanti e processi antiossidanti (Sies, 1991)
Radiazioni, farmaci, metalli pesanti
Fumo di sigaretta, alcool, inquinamento
Esercizio fisico inadeguato, sedentarietà
Infezioni ed altre malattie
Ridotta assunzione
e/o diminuita sintesi
e/o ridotta capacità di utilizzazione
e/o aumentato consumo di antiossidanti
Specie reattive 
Difese antiossidanti 
Danno cellulare
Danno tissutale
Danno d’organo
Danno sistemico
Malattie
cardiovascolari
Demenza,
M. di Parkinson
Invecchiamento
precoce
Infiammazioni,
tumori
Altre
malattie
Reazioni del metabolismo dell’ossigeno
L’ossigeno è una molecola biatomica solitamente rappresentata come
O::O
In realtà alla temperatura corporea l’ossigeno è un biradicale
.O : O.
con due elettroni spaiati, ciascuno localizzato su un orbitale
diverso. A causa quindi della sua configurazione elettronica
l’ossigeno va incontro a riduzione monovalente ( 1 e-)
Quando un ossigeno guadagna un elettrone, si trasforma in radicale
anione superossido, O2- . L’aggiunta di un secondo elettrone
(insieme con due protoni) trasforma quest’ultimo in perossido di
idrogeno, H2O2.
Il perossido non è un radicale ma guadagna facilmente un altro
elettrone dando spazio ad un radicale idrossilico, OH che è una
particella chimica molto attiva che inizia facilmente reazioni a
catena incontrollabili.
Nei sistemi biologici, i radicali liberi dell’ossigeno o ROS
(Reactive Oxygen Species) vengono generati ed eliminati
continuamente.
I principali ROS sono:
O - (anione superossido),
2
O H (radicale idroperossido);
2
OH (radicale idrossilico);
NO (monossido d’azoto);
ONOO- (anione perossinitrito).
Esistono altre molecole, quali H2O2 (perossido d’idrogeno) e
HOCl (acido ipocloroso) che pur non essendo radicali di per sé,
producono facilmente il radicale idrossilico, altamente reattivo
Le specie chimiche reattive, radicaliche, agiscono come
ossidanti
Elettrone spaiato
OSSIDAZIONE
A
Radicale
(ossidante)
+
C
C
Molecola bersaglio
(doppio legame C-C)
A
+
Nuova molecola
(ridotta, stabile)
C
C
Nuovo radicale
(ossidante)
L’ossidazione, ovvero il trasferimento di uno o più elettroni, è la
base chimica dello stress ossidativo
REAZIONI DI RADICALI LIBERI
INIZIO:
formazione di radicali liberi
PROPAGAZIONE: i radicali liberi reagiscono con altre
molecole per produrre altri radicali liberi
TERMINAZIONE: i radicali liberi reagiscono tra loro per
formare molecole
REAZIONI DI RADICALI LIBERI
CH4 + Cl2
CH3Cl + HCl
INIZIO
Cl  Cl

Cl 
Cl 
• Richiesta luce UV per questo primo stadio
• Formazione di radicali liberi
PROPAGAZIONE
La propagazione è caratterizzata da reazioni in ciascuna
delle quali si consuma un radicale libero e se ne forma un
altro
• Non è richiesta luce
• Ogni reazione produce radicali liberi
Molecole
H
H
Cl  + H  C  H

Cl  H +
H
CH
H
Radicali liberi
H
H  C  + Cl  Cl
H
H

H  C  Cl + Cl 
H
TERMINAZIONE
La terminazione è caratterizzata dalle reazioni dei
radicali liberi per produrre molecole
H
Cl  +
H
CH

Cl  C  H
H
Cl 
H
CH
H
+ Cl 
H

Cl  Cl
H
 CH
H
H

H
HCCH
H H
Diverse specie chimiche reattive sono implicate nella patogenesi
dello STRESS OSSIDATIVO
Specie chimica
Formula
Classe
Specie chimica
Formula
Classe
Ozono
O3
Non
radicale
Ossido nitrico
NO
Radicale
Anione superossido
O2
Radicale
Acido nitroso
HNO2
Ossigeno singoletto
1O *
2
Radicale (?)
Tetrossido nitrico
N2O4
Perossido di idrogeno
H2O2
Non
radicale
Triossido nitrico
N2O3
Radicale ossidrile
HO
Radicale
Perossinitrito
ONOO-
Radicale alchilico
R
Radicale
Acido perossinitroso
ONOOH
(Alchill-)perossil radicale
ROO
Radicale
Catione nitronio
NO2+
(Alchil)idroperossido
ROOH
Non
radicale
(Alchil)perossinitrito
ROONO
Semichinone (dal Coenz. Q)
Q
Radicale
Acido ipocloroso
HOClO
Fenossile (dalla vitamina E)
E-O
Radicale
Tiile
-S
Non
radicale
Non
radicale
Non
radicale
Non
radicale
Non
radicale
Non
radicale
Non
radicale
Non
radicale
Radicale
I ROS vengono prodotti sia attraverso una serie di reazioni
catalizzate da enzimi che attraverso reazioni di natura non
enzimatica.
I ROS possono essere prodotti anche in seguito ad esposizione
a radiazioni ionizzanti, xenobiotici, agenti chemioterapici.
reazione di Fenton:
H2O2 + Fe2+ (Cu+ )  Fe3+ (Cu2+) + HO + OH-
reazione di Haber-Weiss:
H2O2 + O2-  HO + OH- + O2
Il perossido di idrogeno in presenza di ioni Fe2 + o Cu2+ reagisce con l’anione
superossido prendendo parte alla:
I mitocondri vengono considerati la fonte principale di ROS cellulari poiché i
radicali del superossido vengono generati costantemente durante la
fosforilazione ossidativa e possono essere convertiti in H2O2 ed altre specie
reattive dell’ossigeno
Durante i processi di fosforilazione ossidativa, il 4-5%
dell’ossigeno non viene completamente ridotto ad H2O, ma
forma prodotti intermedi dell’O2 altamente reattivi
Nella cellula, i ROS oltre che nei mitocondri, vengono generati
anche in altri compartimenti e da molti enzimi.
Numerose attività metaboliche sono in grado di generare ROS
NADPH ossidasi
Lipoossigenasi
NADPH
ossidasi
NADH deidrogenasi
Citocromo
ossidasi
NADH
deidrogenasi
Lipoossigenasi
Stress ossidativo
Citocromo
ossidasi
Stress ossidativo
da modificazioni reattive
della superficie cellulare
Xantina ossidasi
Xantina
Aldeideossidasi
ossidasi
Aldeide ossidasi
Stress ossidativo
da variazioni
intracellulari della pO2
da ridotta efficienza della respirazione cellulare
Citocromo P450
Citocromo
Citocromo bP5450
Citocromo b5
Stress ossidativo
da induzione
farmacometabolica
Meccanismo d’azione della NADPH ossidasi
Produzione di ROS dal catabolismo purinico
ipoxantina
xantina
xantina
Acido urico
Xantina
ossidasi
H2 O + O 2
H2 O2
O2
O2 .
Biosintesi dell’NO
Agisce
come
importante
messaggero intra ed inter
cellulare
regolando
molte
funzioni: pressione arteriosa,
respirazione,
coagulazione
del sangue ed alcune attività
cerebrali.
Ha un ruolo determinante
nella difesa dalle infezioni
batteriche
e
prevenzione dei tumori
nella
MECCANISMI DI PRODUZIONE
DI ROS
Negli organismi viventi i ROS sono generati nel corso della
normale attività metabolica cellulare
A concentrazioni elevate i ROS sono dannosi per l’organismo in
quanto attaccano i maggiori costituenti della cellula (proteine, acidi
nucleici, lipidi) partecipando così a processi complessi quali
l’invecchiamento e le patologie ad esso correlate.
A concentrazioni moderate i ROS partecipano attivamente ad una
varietà di processi biologici complessi, implicati nella normale
crescita cellulare quali la trasduzione del segnale, il controllo
dell’espressione genica, la senescenza cellulare, l’apoptosi
Effetto dei ROS sulle macromolecole
I ROS causano danni ossidativi, chimici alle biomolecole
Il radicale idrossilico OH reagisce con le biomolecole tramite reazioni di
sottrazione o addizione di H.
Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in
particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi
Il radicale idrossilico OH reagisce con vari amminoacidi per formare derivati
idrossilati
Il radicale idrossilico OH reagisce con le basi azotate
I ROS reagiscono anche con i carboidrati per formare composti dicarbonilici
La matrice cellulare rappresenta uno dei principali target
delle specie reattive dell’ossigeno
Il danno della matrice extracellulare gioca un ruolo determinante nella
patogenesi dello stress ossidativo
Gli effetti dello stress ossidativo sulla struttura e sulle funzioni
cellulari
Perossidazione
di lipidi
Modificazioni
enzimatiche
Perossidazione amminoacidi e proteine
Modificazioni
del DNA
(Per)ossidazione
di carboidrati
Denaturazione
di proteine
Cellula normale
(senza lesioni)
Cellula dopo
l’attacco dei ROS
Alterazioni della
omeostasi ionica
Effetto dei ROS sulle macromolecole
Uno dei siti più sensibili al danno causato
dai ROS è la membrana plasmatica, in
particolare il bersaglio è a livello degli acidi
grassi poliinsaturi.
Il radicale idrossilico OH sottrae un atomo
di idrogeno ad un acido grasso poliinsaturo,
iniziando così una catena di reazioni di
perossidazione lipidica.
I perossidi lipidici formati in questa reazione
vengono degradati per formare dei prodotti
caratteristici quali la malonildialdeide (MDA)
o l’idrossinonenale (HNE)
Questi composti reagiscono con le proteine
formando legami crociati e addotti chimici
con esse (prodotti finali di lipoossidazione
avanzata)
DANNO INDOTTO DALLA LIPOPEROSSIDAZIONE
ALLE MEMBRANE BIOLOGICHE
RADICALI
LIBERI
perossidazione
dei PUFA
(acidi grassi polinsaturi)
ridotta fluidita’
di membrana
compromessa
attività cellulare
NEOPLASIE
INVECCHIAMENTO
MALATTIE
CARDIOVASCOLARI
Effetto dei ROS sulle macromolecole
Il radicale idrossilico OH reagisce con vari amminoacidi per
formare derivati idrossilati
H2O2 e HOCl e ONOO- reagiscono con la metionina e la tirosina per
formare nitro-e-clorotirosina e metionina solfossido
Effetto dei ROS sulle macromolecole
Il radicale idrossilico OH reagisce con le basi azotate.
I maggiori prodotti dell’ossidazione sono la 8-ossiguanosina (il
principale indicatore di danno al DNA), timinaglicole,
5idrossimetiluracile
RADICALI LIBERI E ACIDI NUCLEICI
EFFETTI DEI RADICALI LIBERI NEI
SISTEMI BIOLOGICI
Difese antiossidanti
Per evitare i danni ossidativi, la cellula ha sviluppato un sofisticato sistema di difesa
nei confronti dei ROS di natura enzimatica e non (attività “scavenger”).
Tali meccanismi di difesa sono fondamentali per l’omeostasi redox cellulare che
dipende dal bilancio tra generazione dei ROS e sistemi antiossidanti.
Quando l’equilibrio si sposta a favore dei primi oppure la cellula si trova in uno
stato di carenza di difese antiossidanti si crea la condizione di stress ossidativo.
I principali enzimi responsabili dell’omeostasi redox cellulare
sono:
la superossido dismutasi (SOD)
la catalasi
la glutatione perossidasi
la tioredossina
la perossiredossina
Questi enzimi funzionano come
“scavengers” dei ROS, ma non
possono intervenire direttamente
sulle macromolecole biologiche a
rimuovere un danno già avvenuto.
Il sistema antiossidante è regolarmente
distribuito nella cellula
ANTIOSSIDANTI
ENDOGENI
Enzimi: SOD, catalasi, glutatione perossidasi
Proteine: proteine-SH, leganti metalli (Fe, Cu)
Altre molecole: acido urico, bilirubina ...
ESOGENI
Vitaminici:
Non vitaminici:
• Vitamina C
• Carotenoidi
• Vitamina E
• Polifenoli
• Carotenoidi (b-carotene)
Meccanismo d’azione degli antiossidanti
Inquinanti, fumo, radiazioni, metalli pesanti,
farmaci, alcool, ischemia-riperfusione, …
Bloccano la formazione
dei radicali
Antiossidanti
preventivi
Specie Chimiche Reattive
Bloccano la
reazione di inizio
Antiossidanti
scavenger
Attacco di biomolecole
(glicidi, lipidi, proteine, ecc)
Bloccano la reazione
di propagazione
Reazioni radicaliche a catena
Antiossidanti
di riparo e de novo
Danno ossidativo
Riparano il danno e
ricostituiscono le membrane
Invecchiamento,
malattie
ANTIOSSIDANTI PREVENTIVI
Esempi
Classe
Transferrina, lattoferrina, ferritina
Sequestratori Aptoglobina
di metalli Emopessina
Ceruloplasmina, albumina
“Quencher” Carotenoidi
Superossido dismutasi
di ROS
Catalasi
Perossidasi
Glutatione perossidasi
Inattivatori (plasmatica)
di perossidi Glutatione perossidasi
(dei perossidi fosfolipidici)
Glutatione perossidasi
(intracellulare)
Glutatione–S–trasferasi
Meccanismo d’azione
Sequestro di ferro
Sequestro di emoglobina
Stabilizzazione dell’eme
Sequestro di rame
Quenching dell’ossigeno singoletto
2O2• + 2H+  H2O2 + O2
2 H2O2  2 H2O + O2
H2O2 + AH2  2 H2O + A
LOOH + AH2  LOH + H2O + A
PLOOH+2GSHPLOH+H2O+GSSG
H2O2 + 2 GSH  2 H2O + GS–SG
PLOOH+2GSHPLOH+H2O+GSSG
H2O2 + 2 GSH  2 H2O + GS–SG
LOOH+2GSH  LOH+H2O+GS–SG
Scissione dei perossidi lipidici
Prevengono la formazione dei radicali liberi
ANTIOSSIDANTI SCAVENGER
Riducono la concentrazione di radicali
rimuovendoli dal mezzo in cui si trovano
liberi
 Natura idrofila: albumina, acido urico, vitamina C
 Natura lipofila: carotenoidi, vitamina E, coenzima Q
AGENTI DI RIPARO
Enzimi che intervengono dopo il danno effettuato dai
radicali liberi
 Idrolasi, transferasi, polimerasi
AGENTI DI ADATTAMENTO
Sostanze o tecniche attraverso le quali è possibile
potenziare il sistema antiossidante fisiologico di un
organismo
 esercizio fisico, regime alimentare corretto ed
equilibrato
ANTIOSSIDANTI
SOLUBILITA’ RDA M/F
DOVE
VitaminaA
liposolubile
1000/800
Frutta gialla, arancione
o verde scura
Vitamina C
idrosolubile
60/60mg
Frutta, ortaggi a gemma
Vitamina E
Licopene
liposolubile
liposolubile
10/8 mg
Fegato, uova
Bioflavonoidi
Idrosolubile
1.7/1.3 mg
GTE (green tea
extract)
Sali di Mg,Zn
Se, Cr
Grassi poliinsaturi
Acidi grassi (Omega 6)
Acidi grassi (Omega 3)
Pomodoro
 5 gr
5-6 gr
Cereali, carne, latte
Te’ verde
Olio d’oliva
Semi vegetali
Pesce
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
ENZIMATICI, CELLULARI
SUPEROSSIDO
DISMUTASI
(SOD)
 Principale antiossidante cellulare, mantiene
concentrazione di anione superossido (O2-• )
bassa
la
 Converte l’anione superossido in perossido d’idrogeno
 Agisce in collaborazione con la catalasi e la glutatione
perossidasi
La superossido dismutasi (SOD)
La SOD catalizza la reazione di dismutazione dell’anione superossido:
2 O2- + 2H+  H2O2 + O2
Se ne conoscono varie forme isoenzimatiche.
Nei mitocondri l’isoenzima utilizza come cofattore il manganese
(MnSOD).
Altri isoenzimi, di cui alcuni anche a localizzazione nucleare hanno come
cofattori rame o zinco (Cu/ZnSOD).
Esiste anche un isoenzima Cu/ZnSOD extracellulare secreto (EC-SOD)
La catalasi (appartiene alla classe delle ossido-reduttasi),
localizzata nei perossisomi, inattiva l’H2O2 catalizzando la reazione:
2H2O2  O2 + 2H2O
contiene un gruppo eme
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
ENZIMATICI, CELLULARI
CATALASI (CAT)
2 H2O2
2 H2O + O2
 Eme-proteina presente nei perossisomi e nel citosol degli
RBC
 Agisce con la SOD per la rapida detossificazione dell’anione
superossido (O2-•)
PEROSSIDASI (Px)

Diverse forme, diverse localizzazioni, diversi substrati

Difesa cellulare primaria contro i perossidi (R-OOH, H2O2)

Convertono i perossidi in H2O in presenza di riducenti
R-OOH + AH2  R-OH + A + H2O
La glutatione perossidasi
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
ENZIMATICI, CELLULARI
GLUTATIONE PEROSSIDASI (GSH-Px)
2 H2O2
ROOH
2 GSH
2 H2O + O2
ROH + H2O
GSSG
GLUTATIONE REDUTTASI
NADP+
NADPH2
 Richiede selenio (cofattore) e glutatione (riducente)
GLUTATIONE (GSH)
 Tripeptide
(Glu-Cys-Gly) endogeno idrofilo a basso PM
 Cofattore della glutatione-perossidasi (GPx)
 Consente alla GPx di svolgere il suo ruolo antiossidante
GLUTATIONE (GSH)
 Azione
disintossicante
 Attività
immunitaria
 Attività
protettiva nei riguardi del SNC
E’ presente in alimenti quali: cocomero, avocado, asparagi,
pompelmo, patate, fragole, pomodori, arance, spinaci.
Ciclo del glutatione
Agenti esogeni/metabolismo
O2•
SOD
2 NADP+
2 NADPH + H+
2 GSH
GSH–R
GPx
GS – SG
GS – SG
TRASLOCASI
ESCREZIONE
H2O2
CAT
H2O + ½ O2
2 H2O
Pr – SH
Pr – SG + GSH
SOD: superossidodismutasi
CAT: catalasi
GPx: glutatione perossidasi
GSH-R: glutatione reduttasi
Le principali molecole non enzimatiche che contribuiscono
all’equilibrio redox cellulare sono:
la vitamina C (o acido ascorbico),
la vitamina E (o a-tocoferolo),
vitamina A (o b-carotene),
l’urato, il piruvato, e infine il GSH
La vitamina C e la vitamina E agiscono in maniera coordinata e sinergica: la
vitamina C rigenera l’a-tocoferolo trasformandosi in radicale ascorbile, e viene
riconvertita ad acido ascorbico da una reduttasi NADPH-dipendente.
L’a-tocoferolo protegge le membrane dal danno ossidativo in quanto blocca le
reazioni a catena caratteristiche del processo di perossidazione lipidica delle
membrane biologiche.
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
NON ENZIMATICI
PROTEINE -SH:
• Agiscono come antiossidanti plasmatici.
• Acquistano un e- generando un radicale sulfidrilico (-S•) più stabile.
PROTEINE LEGANTI Cu-Fe:
• Proteine di trasposto: transferrina (2Fe+++) e ceruloplasmina (Cu++)
• Proteine di deposito: ferritina (FeOOH)
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
NON ENZIMATICI
BILIRUBINA:
• Prodotto di degradazione dell’eme
• Blocca i radicali perossilici a livello plasmatico
ACIDO URICO:
• Prodotto finale del catabolismo delle purine (adenina e guanina)
• Chela i metalli e riduce l’ozono (antiossidante del tratto respiratorio)
ACIDO URICO
 Sostanza a basso peso molecolare, idrofila
Potente scavenger contro vari ossidanti (HO•,O2*, O3, HClO)
 Chelante nei confronti di metalli di transizione (Fe, Cu)


Previene l’ossidazione Fe-dipendente dell’ascorbato
OH
N
N
OH
HO
N
N
H
ANTIOSSIDANTI ESOGENI
VITAMINICI
ACIDO ASCORBICO (Vitamina C)
Principale antiossidante extracellulare idrosolubile
Può bloccare O2-•, HO•, H2O2, 1 O2
Riducendo il radicale tocoferile rigenera la vitamina E
Il radicale ascorbile è rigenerato dalla NADPH deidroascorbato
reduttasi, mentre il deidroascorbico dall’ascorbico reduttasi-GSH.
Vitamina C
ANTIOSSIDANTI ESOGENI
VITAMINICI
VITAMINA E
Attività antiossidante vitamina E
ANTIOSSIDANTI ESOGENI
VITAMINICI
VITAMINA E
• Sostanza liposolubile.
• Principale
radical-scavenger
delle
membrane
e
delle
lipoproteine.
• Agisce bloccando i radicali perossilici formatisi durante la
perossidazione lipidica.
• Può essere rigenerata dall’acido ascorbico e dal GSH.
VITAMINA E
ATTIVITA’
ANTIOSSIDANTE
Molecola
liposolubile
associata alle membrane
biologiche e alle lipoproteine
protegge i grassi poliinsaturi
dalla perossidazione
ATTIVITA’ NON
ANTIOSSIDANTE
A carico di RRR-a
tocoferil succinato
potente agente antitumorale
VITAMINA E e neoplasie
INIBISCE LA PROLIFERAZIONE
DI CELLULE MALIGNE
Vit. E
CAUSA APOPTOSI
È ANTI-ANGIOGENICA
INIBISCE VEGF
(fattore di crescita vascolare)
ANTIOSSIDANTI ESOGENI
VITAMINICI
CAROTENOIDI
• Gruppo di pigmenti rossi, arancio e giallo presenti soprattutto nella frutta e
vegetali.
• Sostanze liposolubili.
• Alcuni hanno attività vitaminica (b-carotene).
• Presenti nelle membrane cellulari e veicolati dalle lipoproteine.
• Interrompono le reazioni a catena dei radicali perossili (R-OO•)
• Bloccano i radicali tra cui anche l’1O2 (ossigeno singoletto) tramite due
meccanismi:
• trasferimento del e• addizione del radicale alla molecola
LICOPENE
• Antiossidante naturale della famiglia dei carotenoidi,
presente in elevate concentrazioni nel pomodoro maturo e in
misura minore nel cocomero, albicocca, uva e papaia
• Chimicamente costituito da carbonio e idrogeno ed in natura
è rinvenibile nella struttura “trans”
• Tempo di emivita 2-3 giorni, maggior metabolita 5,6diidrossi-5,6diidrolicopene
LICOPENE
Sembra avere un ruolo importante nella prevenzione di
alcune malattie degenerative quali il cancro e le malattie
vascolari, che sembrano in parte dipendere da fenomeni
ossidativi
Il meccanismo di azione alla base dell’attività antitumorale del
licopene è ancora sconosciuto
LICOPENE
In pazienti con tumore della prostata la supplementazione con
licopene per sole 3 settimane ha determinato una riduzione dei
valori sierici di PSA (un marker usato comunemente per
monitorare l’andamento della malattia), suggerendo un effetto
antiproliferativo specifico sulle cellule neoplastiche prostatiche
ANTIOSSIDANTI ESOGENI
NON VITAMINICI
POLIFENOLI
 Ampia classe di composti derivati dal metabolismo secondario
delle piante
 Chimicamente sono derivati ciclici del benzene sostituiti con
gruppi idrossilici
 Comprendono molecole sia semplici come gli acidi fenolici
oppure altamente polimerizzate come i tannini
 Scavenger nei confronti dei radicali HO• e O2•
3'
2'
8
O
7
A
1'
4'
B
2
5'
R2
6'
C
3
6
5
4
R1
R2
R1
O
R3
R3
OH
OH
Struttura dei flavonoidi
O
R4
R4
Struttura degli acidi fenolici
• bloccare i radicali liberi
• legare i metalli di transizione
• inibire l’ossidazione delle LDL
• rigenerare il radicale tocoferile
ACIDO LIPOICO

Sostanza a basso peso molecolare, relativamente idrofila
 Scavenger di vari ossidanti (HO•, O2*, HClO)
 Chelante nei confronti dei metalli di transizione (Fe, Cu)
 Consente la rigenerazione delle vitamine C ed E
 Prodotto nell’organismo, è coinvolto nel complesso della piruvato
deidrogenasi, funzionando da accettore di elettroni, grazie al suo
ponte disolfuro, reattivo
SH
SH
COOH
Forma ridotta (attiva)
S
S
Forma ossidata
COOH
Ac. LIPOICO
(25-100µM)
induce
Effetto dose
dipendente
Ac. LIPOICO
(25-100µM)
riduce
ATTIVITA’ antiossidanti:
Catalasi (+55%)
Superossido dismutasi
Glutatione reduttasi
Glutatione perossidasi
Glutatione transferasi
ACCUMULO ROS
(-55%)
DIMOSTRAZIONE IN VITRO DELL’ EFFETTO PROTETTIVO
DELL’AC.LIPOICO IN Saccaromycetes cerevisiae
Perossido di Idrogeno (H2O2)
4-5mM
Riduce le possibilità di
sopravvivenza della
cellula (Saccaromycetes
cerevisiae)
Riduce il n delle
generazioni
successive
Ossidante (H2O2) + Acido
Lipoico 0.01-0.1mM
Aumenta la possibilità
di sopravvivenza della
cellula
Aumenta il n
delle generazioni
successive
Coenzima Q10

Sostanza lipofila a basso peso molecolare
 Scavenger nei confronti dei radicali perossilici (ROO•)
 Consente la rigenerazione dei tocoferoli
O
H3CO
CH3
CH3
(CH2 – CH = C – CH2)10H
H3CO
O
Ruolo del Coenzima Q e della vitamina E
nell’inibizione della perossidazione lipidica
L–H
Fe3+ O2
UQH2
INIZIO
L•
Fe3+ H2O2
UQ•
O2
PROPAGAZIONE
LOO•
L–H
UQH2
E – OH
E–O
L•
UQ•
LOOH
A• UQ•
AH- UQH2
ZINCO
 Componente essenziale di numerosi enzimi, in cui svolge un
ruolo strutturale, di regolazione e catalitico: l’amminoacilRNA-sintetasi, la DNA e l’RNA polimerasi, la fosfatasi
alcalina, la lattico deidrogenasi, la superossido dismutasi
e le carbossipeptidasi A e B
 Attività antiossidante, prevenendo la perossidazione lipidica
e riducendo la formazione dei radicali liberi
MANGANESE
 E’ un cofattore dell’attività di numerosi enzimi (arginasi,
piruvato carbossilasi, superossido dismutasi)
SELENIO
 Componente dell’enzima glutatione perossidasi, che
impedisce l’ossidazione dell’emoglobina e quindi l’emolisi
degli eritrociti. Agisce in sinergismo con la vitamina E
 Azione antiforfora e antimicotica
In laboratorio, per valutare lo stato redox, è possibile dosare:
 Alcuni enzimi antiossidanti (SOD, GPx, glutatione reduttasi,
catalasi)
 Vitamine
 Potere antiossidante totale del siero
 Prodotti
di
lipoperossidazione
(malonildialideide
sostanze reattive all’acido tiobarbiturico TBARS)
 Metaboliti reattivi dell’ossigeno (ROM’s)
MDA,
Valutazione dello stress ossidativo ed idroperossidi
Aumentata produzione
di ROS (O2., HO., H2O2,…)
Compromissione della barriera
antiossidante (vit. C, vit. E,…)
Perossidazione di biomolecole con produzione di idroperossidi
R-OOH
(una classe di ROM)
IDROPEROSSIDI (MARKER ED AMPLIFICATORI DEL DANNO)
NEI LIQUIDI EXTRACELLULARI
INVECCHIAMENTO E PATOLOGIE CORRELATE CON LO STRESS
OSSIDATIVO (ictus, infarto, diabete, demenza, m. di Parkinson, cancro, …)
Gli idroperossidi sono marker ed amplificatori
delle lesioni da STRESS OSSIDATIVO
Valutazione dello stress ossidativo
Valutare l’“attacco”
Valutare la “difesa”
Status pro-ossidante
Status antiossidante
d-ROMs test, MDA
OXY-Adsorbent test,
BAP test, -SHp test…
VALUTAZIONE GLOBALE DELLO STRESS OSSIDATIVO
PREVENZIONE E MONITORAGGIO
DELLE MALATTIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO
STRESS OSSIDATIVO: valutare per riequilibrare
TEST DI LABORATORIO PER LA VALUTAZIONE DELLO
STATUS PRO-OSSIDANTE
d-ROMs test
- Test spettrofotometrico che consente di determinare, in un
campione biologico, la concentrazione degli idroperossidi
(ROOH) su diversi substrati biochimici
- Gli analiti misurati nel test sono metaboliti reattivi dell’ossigeno
(reactive oxygen metabolites, ROM)
Gli idroperossidi presenti in un campione biologico, dopo
aver reagito con un apposito cromogeno sviluppano un
derivato
colorato
(dal
rosa
al
rosso)
rilevabile
e
quantificabile per via spettrofotometrica.
La
concentrazione
degli
idroperossidi,
direttamente
proporzionale all’intensità del colore rilevato, viene espressa
in unità di U CARR (Carratelli)
1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL
Principio del d-ROMs test
Reazione di Fenton: un metallo di transizione in forma ionica (Fe o Cu)
catalizza la scissione di un idroperossido (ROOH), generando nuove specie
radicaliche (idroperossili (ROO*) o alcossili (RO*), a seconda che lo ione
catalizzante si ossidi (Fe2+ Fe3+ o Cu+ Cu2+) o si riduca.
Nel test gli idroperossidi, nelle condizioni previste dalla reazione di Fenton,
generano in vitro radicali idroperossilici ed alcossilici.
1a)
1b)
2a)
2b)
R-OOH + Fe2+
R-O* + A-NH2
R-OOH + Fe3+
R-OO* + A-NH2
R-O* + Fe3++ OHR-O- + [A-NH2*]+
R-OO* + Fe2+ (Cu+) + H+
R-OO- + [A-NH2*]+
Procedura sperimentale:
Un’aliquota di siero viene diluita in una soluzione tampone (acetato)
pH 4.8; il ferro ionico legato alle sieroproteine, si rende disponibile in
forma libera catalizzando la scissione degli idroperossidi in radicali
idroperossilici ed alcossilici.
Alla
soluzione
viene
aggiunto
un
cromogeno
(N,N-dietil-
parafenilendiammina) che ha la proprietà di cambiare colore (dal
rosa al rosso) quando viene ossidato.
E’ necessario preparare lo standard (o calibratore), fornito all'interno
di un kit commerciale sottoforma di siero liofilo a titolo noto (U
CARR).
Procedura cinetica standard: si preparano 3 soluzioni (bianco,
campione (preferibilmente siero fresco) e calibratore)
 incubazione delle soluzioni per 1 min a 37°C;
 lettura fotometrica (abs a 505 o 546 nm) a 0, 1, 2 e 3 min.
Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il calibratore si
sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco.
Procedura endpoint: si preparano 3 soluzioni (bianco, campione
(siero o plasma eparinato) e calibratore).
 incubazione delle soluzioni a 37°C per 75 min;
 lettura fotometrica (abs a 505 o 546 nm).
Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il
calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco.
Valori di riferimento nell’uomo:
250-300 U CARR
cioè 20.08-24.00 mg/dL di H2O2
Un aumento delle U CARR indica una
gravità crescente di stress ossidativo
Unico test disponibile per la valutazione complessiva della
componente lesiva, pro-ossidante, dello stress ossidativo che unisce a
questa specificità una standardizzazione utile nella pratica clinica
routinaria e la possibilità di integrarsi con altri test sullo stress
ossidativo.
· preciso e affidabile;
· richiede una strumentazione relativamente semplice (un
fotometro termostatato ed una centrifuga);
· possiede tutti i vantaggi di un mono test (rilevazione fotometrica
diretta di un’unica miscela di reazione, contenente il campione e il
reattivo cromogeno);
· richiede una minima manualità, con notevole riduzione delle
possibilità di errore.
• nella perossidazione lipidica si
formano
prodotti
di
degradazione;
• essi sono utilizzati per
misurare
il
grado
di
perossidazione; si misura la
formazione
della
malonildialdeide
(dialdeide
malonica, MDA)
MDA test
MDA (malonilaldeide o malonildialdeide, CHO-CH2-
CHO): prodotto finale delle reazioni a catena innescate
nelle membrane cellulari dall’attacco ossidativo, da parte
di alcuni ROS (radicale idrossile), degli acidi grassi
poliinsaturi (acido arachidonico, costituente dei fosfolipidi
di membrana).
MDA: indicatore piuttosto tardivo di stress ossidativo.
Svantaggi: non è sempre in grado di poter svelare
precocemente uno stato ossidativo alterato.
La MDA è scarsamente specifica; è un prodotto di
decomposizione
ossidativa
di
amminoacidi,
di
carboidrati e di prostaglandine;
E’ un prodotto di ossidazione dell’acido ascorbico,
risulta inutilizzabile il suo dosaggio ai fini di un
eventuale
monitoraggio
trattamenti antiossidanti.
terapeutico
in
corso
di
TOTAL ANTIOXIDANT STATUS
Valutazione dell’efficacia della barriera ossidante,
che si oppone all’azione lesiva dei radicali
PRINCIPIO DEL METODO
Rilevazione della capacità del siero in esame di opporsi ed
inibire la cascata di reazioni che portano alla formazione
dei radicali liberi
Nel plasma è identificabile una “barriera antiossidante”, alla
cui costituzione contribuiscono sostanze esogene ed endogene.
Questi componenti, “donando” elettroni, bloccano la potenziale
lesività dei radicali liberi.
Qualsiasi “insulto” a carico di tale barriera consente ai radicali
liberi di attaccare e danneggiare le strutture cellulari.
Rappresentazione schematica
della barriera antiossidante
plasmatica
L’efficienza della barriera antiossidante plasmatica può essere
valutata saggiandone la capacità di ridurre un determinato
substrato, ossia di donare elettroni ad un agente ossidante
(avido di elettroni), che funge da “sensore”.
Il potere antiossidante è, in termini rigorosamente chimici,
un’attività riducente, cioè elettron-donatrice.
BAP-TEST
BAP test (biological antioxidant potential, determinazione
del potenziale biologico antiossidante): test fotometrico.
Si basa sulla capacità che ha una soluzione di ioni ferrici (Fe3+)
complessati ad un cromogeno di colorarsi, quando gli ioni Fe3+
sono ridotti a ioni ferrosi (Fe2+), come accade se si aggiunge ad
essa un adeguato sistema riducente, ossia antiossidante, quale il
plasma.
Il campione di plasma (ottenuto dal sangue intero mediante
centrifugazione) viene aggiunto ad una soluzione colorata
(FeCl3, cloruro ferrico + cromogeno, un tiocianato).
Dopo un’incubazione (5 min) la soluzione si decolorerà e la
decolorazione sarà tanto più marcata quanto più i componenti
del plasma ridurranno gli ioni ferrici presenti, responsabili
della formazione del complesso cromatico.
Valutando per via fotometrica l’entità della decolorazione, sarà
possibile risalire alla quantità di ioni ferrici ridotti e alla
capacità riducente, ossia al potere antiossidante del plasma
testato.
I risultati del BAP test sono espressi in mmoli di ferro ridotto
per L di plasma esaminato.
Test affidabile, preciso, ripetibile, con un coefficiente di variazione (CV)
inter-serie ed intra-serie assolutamente accettabile, anche con metodica
manuale (<5%).
Interferenza segnalata è legata alla concentrazione lipidica: un
plasma iperlipemico può indurre una sottostima dei valori.
Il test va obbligatoriamente eseguito a digiuno o dopo un congruo
intervallo di tempo rispetto ad un pasto copioso o all’assunzione
massiva di antiossidanti per os.
Il BAP Test viene eseguito su siero o plasma eparinato
fresco, con lettura fotometrica a 505 nm a 37°C.
Data l’esigua quantità di campione necessaria (10 µl per
l’analisi manuale) il prelievo può essere venoso o
capillare.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Il range stimato del BAP test negli individui normali è 22004000 mmoli/L.
Una riduzione dei valori del test al di sotto dell’intervallo
indicato è direttamente correlato con una ridotta efficienza
della barriera antiossidante plasmatica.
OXY-Adsorbent test
Test fotometrico che valuta la capacità del plasma di opporsi
all’azione ossidante di una soluzione di acido ipocloroso, HClO
(ossidante).
Il campione di plasma viene sottoposto all’azione di HClO a
titolo noto, in evidente eccesso rispetto alle capacità di essere
“adsorbito” dalla barriera antiossidante da valutare.
Dopo un intervallo di tempo stabilito, l’HClO residuo reagisce
con la N,N-dietilparafenilendiammina che, ossidandosi a spese
dell’acido, si trasforma in un derivato colorato in rosa.
La
concentrazione
del
complesso
colorato
sarà
direttamente proporzionale alla concentrazione di HClO
rimasta in eccesso ed inversamente proporzionale alla
capacità antiossidante del plasma analizzato;
più bassa è la concentrazione residua dell’acido e più
elevata è la capacità antiossidante del campione di plasma
esaminato, e viceversa.
Il valore di riferimento del test è al di sopra di 350 mmoli/mL
di HClO.
In condizioni normali, 1 mL di plasma umano è in grado di
“adsorbire” e, quindi, neutralizzare, almeno 350 mmoli di HClO.
Valori inferiori a questa soglia indicano una riduzione dello
“spessore” della barriera antiossidante e correlano direttamente con la
gravità del danno da questa subito.
Il test viene eseguito su siero o plasma eparinato fresco
con lettura fotometrica a 505 o 546 nm a TA.
Il prelievo può essere venoso o capillare.
Test affidabile, preciso, ripetibile, con un coefficiente di
variazione (CV) inter-serie ed intra-serie assolutamente
accettabile, anche con metodica manuale (<5%).
Il test va eseguito a digiuno o dopo un congruo intervallo
di tempo rispetto ad un pasto copioso o all’assunzione
massiva di antiossidanti per os.
SHp test
Si basa sulla capacità dei gruppi -SH di
sviluppare un complesso colorato
determinabile fotometricamente (405
nm) quando reagiscono con l’acido
5,5ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB).
Il “titolo” di tioli è direttamente
proporzionale all’intensità del colore
rilevato.
Grado accettabile di imprecisione
analitica. Infatti, il CV intra-serie su 20
aliquote di siero fresco è stato pari a
1.7%, quello inter-serie su 20 aliquote di
siero congelato 3.3%.
I tioli rappresentano una
componente qualitativamente
significativa della barriera
antiossidante plasmatica
Il range negli individui normali è 450-650 mmoli/L.
Una riduzione dei valori del test al di sotto di questo
intervallo si correla direttamente con una ridotta
efficienza della barriera antiossidante tiolica.
Sistema FREE (Diacron)
Sistema analitico integrato che consente di eseguire qualsiasi tipo
di analisi chimica basata sul principio della fotometria
Predisposto per l’esecuzione di test per la valutazione globale dello
stress ossidativo (d-ROMs test, l’OXY-adsorbent test, il BAP test e
l’-SHp test).
SISTEMA FRAS (Diacron)
Sistema analitico integrato costituito da un fotometro con
centrifuga
incorporata
progettato
per
consentire
l’esecuzione del d-ROMs test su sangue intero, ottenuto
mediante prelievo di sangue capillare. Viene fornito
insieme al kit del d-ROMS test che ne costituisce parte
integrante.
Una goccia di sangue, prelevata per digitopuntura, è raccolta
in un piccolo capillare e, insieme a questo tubicino, immersa
in una provetta contenente una soluzione tampone lievemente
acida.
Il campione, dopo una delicata agitazione, è trasferito in
cuvetta, ove viene aggiunta una goccia di reattivo cromogeno.
La soluzione è sottoposta a centrifugazione e alla lettura
fotometrica.
Il fotometro trasformerà l’intensità del colore (proporzionale
alla quantità di radicali e, quindi, di idroperossidi presenti
nel campione) in unità di concentrazione (U CARR), a cui
possono corrispondere determinati livelli di stress ossidativo.
dROM test: errori da evitare
1
2
3
4
5
6
7
8
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