Lezione 19-20 IngGen 5-XII-06
• Pcr quantitativa
• competitiva (competitori)
• Real time e LC
PCR quantitativa
Come si può quantificare ? Si possono determinare dei valori
assoluti ?
Che metodologie si possono utilizzare ?
-PCR classica chiamata “end point” o terminale o meglio di
fine* reazione (fine* inteso come finale senza giustificazione dei mezzi).
- analisi dell’amplicone dopo i cicli di fine* reazione, gel
elettroforesi colorazione con Bromuro di Etidio o Cybrsafe
(intercalante fluorescente del DNA, si rileva con UV)
quantificazione comparativa, relativa.
- PCR “real time” o “light cycler” automatizzata con lettura del
prodotto della PCR direttamente durante i cicli di
amplificazione tramite lettura laser della fluorescenza
corrispondente alla quantità di DNA prodotto.
PCR competitiva
competitore ottenuto con
mutagenesi tramite PCR di un amplicone a seconda delle
esigenze.
Per poter fare un competitore dobbiamo sapere per cosa lo
dobbiamo usare, se per PCR classica o se per “Real Time - LC.
- inserzione di un frammento all’interno di un amplicone
- si ottiene un competitore con peso molecolare diverso dal
frammento w.t. con sostituzione di una sequenza
La sequenza esogena inserita non deve avere omologie con il
genoma e si utilizza come target della sonda per la
quantificazione “Real Time - LC” oppure per discriminarla su gel.
Primers con la coda (3’ o 5’)
Riguardiamo come si fa mutagenesi di un amplicone
I primers con la coda si usano per creare omologie tra sequenze
e favorire appaiamennti tra ampliconi diversi, bada al 5’ o 3’!
SA2.5-A2
SA2.1-A2
SA2.5A
SA2.6A
SA2.1A
SA2.2B
SA.8A
SA.9B
ggccggtaccGGATCCCGGTTCCTGATCACTG
ggccggtaccCTTCCTGCCAACCTGGGGGCTG
ggccacgcgtGGATCCCGGTTCCTGATCACTG
ggccacgcgtCCACAGTCACTGCCAGATGCTC
ggccacgcgtCTTCCTGCCAACCTGGGGGCTG
ggccacgcgtGGCTTTTGCCAGTCCTCCTAC
ggccacgcgtCGCTCGCTGCCCCACTCAGGAGG
ggccacgcgtCTCCTAGCAGGGTCTCCTCCCTGG
A cosa possono servire delle code ?
Se devo fare una mutagenesi posso adoperarle ? In che modo ?
Come devono essere le code ? Quali requisiti devono avere ?
Cerchiamo dove mappano a quali geni appartengono ?
PCR competitiva “end point”
Quantificazione:
confronto amplicone / competitore
- valore relativo non assoluto
fluorescenza osservata su gel con Et.Br.(bromuro di etidio)
- diverso peso molecolare oppure su “Real time” con sequenza
interna diversa riconoscibile da sonda specifica
- competitore amplificato nella stessa reazione (fisicamente
nella stessa provetta)
- la quantificazione relativa misurata col rapporto tra la conc.
(fluorescenza-luminanza) dell’amplicone e del competitore
- determinazione da un numero ampio di diluizioni note del
competitore, mantenendo costante la quantità di DNA del
campione da quantificare.
Come si fa la PCR competitiva
Perchè competitiva
- analisi della concentrazione del competitore e dell’amplicone
- le due sequenze competono per i primers
- Perché competono ?
- come è fatto il competitore ? È un “mutante dell’amplicone”
per inserzione, mutaz. con PCR a 3 passaggi (vedi lez.15-16)
5’
5’
3’
pr frw
amplicone w.t.
3’
3’
5’
pr rev
5’
3’
pr frw
seq mutata
3’
3’
5’
3’
pr rev
amplicone mutante
5’
3’
5’
5’
Procedura competitiva
- reazione col DNA del campione in analisi ed il DNA del
competitore.
- primers in comune amplificano i due diversi ampliconi.
- almeno 5 reazioni con 5 diluizioni del competitore e stessa
concentrazione del DNA in analisi.
- In ogni provetta la quantità di DNA amplificata sarà
proporzionale alla quantità iniziale del DNA dei due templati
aggiunti alla reazione: il competitore ed il wt.
- competitore a concentrazione nota
- PCR messa a punto per assenza di amplificati spuri
gel PCR competitiva end point
long amplicon 271bp
300 bp
compDNA
mtDNA
compDNA dilut. x 10-6 6
9
15
18
27
48
60
medium amplicon 240bp
300 bp
compDNA
mtDNA
compDNA dilut. x 10-5
Confronta le
concentrazioni del
competitore nei tre
diversi esempi.
Come si interpreta?
3
6
9
15
18
27
48
60
si tratta di PCR nested
short amplicon 146bp
compDNA
mtDNA
compDNA dilut. x 10-4
200 bp
1
3
6
9
15
18
27
48
Come mai cambia il peso
anche del competitore ?
Plot valori di fluorescenza gel PCR
competitiva
log. mtDNA/compDNA
Come si ottengono i valori:
ascissa = log conc in peso
ordinata = log rapporto fluoresc corretto
log. fmol x10-6
long
medium
short
gel di PCR competitiva II caso
amplicone primers 146 bp
Campione - I
200 bp
compDNA
mtDNA
compDNA dilut. x 10-6
9
18
27
36
48
60
Campione - II
200 bp
compDNA
mtDNA
compDNA dilut. x 10-5
3
9
18
24
30
36
Campione - III
200 bp
compDNA
mtDNA
compDNA dilut. x 10-4
3
6
9
18
27
48
Confronta le
concentrazioni
del competitore
nei tre esempi.
Come si può
spiegare ?
Plot valori del II esempio
MBM-I-II-III-IV ±S.E.
log. mtDNA/compDNA
1
0.5
0
-0.5
-1
MBM-I
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
MBM_II
MBM-IV
log. fmol x10-6
MBM-III
La concentrazione del competitore è stata determinata per
assorbanza allo spettrofotometro a 260 nm lunghezza d’onda,
1 OD a 260 nm = 50  DNA / ml;  = microgrammi
Determinazione dei valori
Analisi del gel PCR “end point” con transilluminatore ad UV
- ogni banda letta con telecamera per luminanza
- si determina l’area di una singola banda e si riporta su tutte le
bande.
- si sottrae dalla luminanza di ogni singola banda la luminanza
di una regione uguale ma senza DNA per determinare il valore
di sottofondo (background che non è underground).
- si normalizza il valore della fluorescenza per la lunghezza del
frammento dovuto al fatto che il competitore è più lungo
dell’amplicone w.t.
- la fluorescenza è data da un intercalante e quindi a parità di
concentrazione è proporzionale alla lunghezza del frammento,
- il competitore più lungo del frammento da quantificare avrà
anche maggiore fluorescenza a parità di molecole.
determinazione dei valori II
dopo i valori di fluorescenza di ogni singola banda
- determinare rapporto tra i valori del DNA dell’amplicone wt
(in questo caso mtDNA bovino) e del competitore.
- frazione maggiore o minore di 1 se il mtDNA > competitore. il punto di uguale luminanza tra i due DNA avrà il rapporto
uguale ad 1.
- valore del rapporto dato come log in base 10 e quindi il
punto di isomolarità (num. = denom.) sarà 0
- un numero sufficiente di valori di diluizione del competitore
può determinare una retta che incontrerà il valore 0 se le
diluizioni hanno il competitore con la concentrazione che si
inverte rispetto al campione in analisi.
- comp > mtDNA / comp < mtDNA
Cosa si deduce
Dal primo esempio che abbiamo fatto si può dedurre che un
DNA estratto da una matrice trattata ad alta temperatura
120°C è parzialmente degradato. La lunghezza media dei
frammenti di DNA è intorno ai 150 nucleotidi e infatti si
amplifica circa 10 volte meno un amplicone di lunghezza di
240 paia di basi e ancora 10 volte meno con 270 bp.
Dal secondo esempio si deduce che le matrici trattate a
temperatura crescente hanno un’amplificabilità diversa dovuta
al trattamento termico. Tra 110 °C , 120 °C
e 133 °C la misura media dei frammenti di DNA scende in
maniera tale per cui tra la temperatura più bassa e la più alta
la conc di frammenti di 146 bp amplificabili è circa 100 volte
maggiore.
limiti del metodo
Il limite di questo metodo:
- conc. bande visibili su gel,
- rischio saturazione del lettore a livello di luminanza,
- rischio sottovalutazione della concentrazione.
1! calibrazione reazione per ottenere un “range” di intervallo
in cui i valori non vanno a saturazione.
2! diluizioni del competitore con l’inversione di quantità tra le
concentrazioni del comp. con quelle del frammento wt.
3! la quantificazione non si può fare per estrapolazione, ma
solo per interpolazione.
Per intenderci bisogna che la retta dei valori del log.del
rapporto wt / comp. passi per il valore 0.
PCR quantitativa
Real Time e Light cycler
1 PCR quantitativa
- quantificazione non “end point” ma in fase logaritmica
- non arriva a saturazione.
- assioma: proporzionalità della quantità amplificata a quella
iniziale
- ad ogni ciclo (dal punto di superamento del sottofondobackground) un raddoppio ed in tre cicli si avvicinerà ad 1 log.
- questo metodo assume che si possa confrontare
l’amplificazione del DNA di un campione di controllo a varie
diluizioni col nostro campione in esame.
- Se vi ricordate con il saggio Northern si normalizza rispetto
ad un mRNA “house keeping” per poter fare un confronto
- con questo metodo si quantifica con una curva standard.
Real time e Light cycler
metodo e principi
Confronto plausibile se è standard il sistema di estrazione dei
campioni sempre dalla stessa matrice (per es. sangue come
nel caso di determinazione di viremia o di livello di infezione
da HIV o di qualunque altro patogeno).
- esistono sitemi robotizzati di estrazione da sangue e di PCR
successiva.
- con estrazione automatica ed il tipo di campione costante il
confronto tra PCR è plausibile (conc linfociti costante).
- determinazione dei valori di varie diluizioni note
dell’amplicone con i quali si costruisce una curva standard di
riferimento.
- Un algoritmo misura il rapporto tra incremento di
fluorescenza e n. dei cicli
- confronto rispetto alla curva standard = concentrazione
Assunzioni e possibilità di errore
- confronto tra quantità di DNA di due PCR diverse
- assunzione che le reazioni avvengano in maniera
assolutamente ripetibile,
- campioni confrontati sono estratti dalla stessa matrice o:
- efficienze di estrazione del DNA uguali nei due campioni
- DNA estratti con la stessa efficienza e protocollo
Meglio se il metodo di estrazione è automatizzato e sempre
sulla stessa matrice.
Con questa premessa si può assumere che il confronto con
una curva standard sia plausibile. Tutto al più se c’è un errore
questo si ripercuoterà su tutti i campioni in quanto sono
estratti e amplificati tutti nelle stesse condizioni automatiche.
Se il metodo è manuale ogni analisi deve essere fatta in
triplicato e valutato l’errore standard.
Calcolo della concentrazione
La concentrazione del campione viene valutata interpolando il
punto di inizio della fase logaritmica dell’ amplificazione
determinato come il punto in cui lo strumento riesce a stabilire
un aumento sopra al “background” confrontandolo con i punti
della curva standard di riferimento.
La curva standard avrà delle amplificazioni a tre cicli di
differenza per ogni log di diluizione. Se all’interno di questi
valori casca il punto di inizio della fase log. del campione, si
può ricavare il valore della concentrazione dell’amplicone nel
campione (come per esempio il virus nel sangue).
Di solito è lo strumento che ha un algoritmo che fa il confronto
con la curva standard che si è determinata, sta all’operatore
vedere se il valore è interno o esterno alla curva medesima e
valutare se acquisire il dato o ripetere la PCR con un’altra
quantità di DNA adeguata.
Come funziona il metodo di
determinazione a fluorescenza
Sia il metodo Real time che Light Cycler funzionano con la
determinazione diretta del DNA reso fluorescente o con
colorazione aspecifica (SYBRgreen) o con primer
fluorescente o con sonda fluorescente.
I due metodi si basano su sistemi chimici diversi.
Il meccanismo “Real time” (applied biosystems AB) non è
diverso da un normale termociclatore (provette con 30-50 l)
salvo il laser che legge l’assorbanza nei vari pozzetti con le
provette, dovuta alla conc del DNA alla lunghezza d’onda
della fluorescenza (nel visibile).
Il meccanismo “Light Cycler” (Roche) è in provetta capillare
(20 l totale) in un rotore in cui il lettore laser sta fisso rispetto
a quello AB in cui si sposta per leggere nelle varie provette la
concentrazione.
La chimica dei metodi fluorescenti
Fluorescenza aspecifica con SYBRgreen (intercalante)
Fluorescenza specifica sonda taqman Appl Biosyst
(quencer e attività eso-nucleasica della TAQ)
quencher
pr frw
fluoroforo
pr rev
sonda
Fluorescenza con enhancer doppia sonda (Roche) FRET
enhancer
fluoroforo attivabile
primer rev
sonda
Metodo Taqman
TaqMan probes are oligonucleotides that contain a fluorescent
dye on the 5' base (typically) and a quenching dye on the 3' end.
Taq esonucleasi idrolizza il quencher,
fluoroforo emette
Metodo FRET
fluorescence resonance energy transfer
b
c
a
a, ccitazione - b, passaggio di energia - c, emissione
ancòra FRET
Se si amplificano due ampliconi
La melting curve lo mostra
Ultima FRET
SCHEMA ESERCITAZIONE INGEGNERIA GENETICA
12 DICEMBRE 2006
1 PCR DNA
Amplicone conetenente polimorfismo umano enhancer Ig
- corsa elettroforetica GEL SYBRSAFE
- osservazione TRANSILLUMINATORE
a)preparazione della reazione
a.1) preparazione mix di reazione
a.2) aliquotazione o aliquotamento e aggiunta campioni DNA
a.3) reazione PCR nel termociclatore con programma cicli
b) caricamento del gel, corsa elettroforetica
- valutazione dei genotipi osservati nel gel