Alessia Stell
Laboratorio A. Maggi
9 Novembre 2010
Cosa sono
Come si producono
Microarray e Tiling Arrays
Quali utilizzi hanno
 Cosa sono i chip a DNA
• I chip a DNA sono costituiti da un array di
microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde
identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al
supporto (vetro, plastica, silicio o beads di
polistirene)
• Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le
probe sono fissate al supporto (in una posizione
nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare
(target) sono marcati con biotina o con marker
fluorescenti e ibridizzati alle sonde
• Il DNA target, legato alla sonda, può essere
identificato utilizzando uno scanner, capace di
rivelare il segnale emesso
 Cosa sono i chip a DNA
• I chip a DNA sono costituiti da un array di
microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde
identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al
supporto (vetro, plastica, silicio o beads di
polistirene)
• Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le
probe sono fissate al supporto (in una posizione
nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare
(target) sono marcati con biotina o con marker
fluorescenti e ibridizzati alle sonde
• Il DNA target, legato alla sonda, può essere
identificato utilizzando uno scanner, capace di
rivelare il segnale emesso
 Cosa sono i chip a DNA
• I chip a DNA sono costituiti da un array di
microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde
identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al
supporto (vetro, plastica, silicio o beads di
polistirene)
• Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le
probe sono fissate al supporto (in una posizione
nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare
(target) sono marcati con biotina o con marker
fluorescenti e ibridizzati alle sonde
• Il DNA target, legato alla sonda, può essere
identificato utilizzando uno scanner, capace di
rivelare il segnale emesso
 Come si producono
• FOTOLITOGRAFIA (in situ):
Fasci di luce e maschere fotolitografiche sono
utilizzati per produrre le sonde direttamente sul
supporto;
• SPOTTED MICROARRAYS:
Le sonde sono sintetizzate prima della loro
deposizione sull’array, e solo successivamente
“spottati” sul supporto.
 Microarray e Tiling array
• MICROARRAY DI ESPRESSIONE: le sonde utilizzate rappresentano
porzioni di trascritti noti
Gene 1
Gene 2
• TILING ARRAYS: coprono l’intero genoma o porzioni definite di
genoma (tutti i promotori, solo alcuni cromosomi…)
Gene 1
Gene 2
 Quali utilizzi hanno
• MICROARRAY DI ESPRESSIONE: utilizzati quasi esclusivamente per l’analisi
dei livelli di espressione di trascritti noti, confrontata in diverse condizioni (es.
controllo-trattamento, cellula sana-cellula tumorale etc.)
Gene 1
Gene 2
• TILING ARRAYS: Utilizzati per
• analisi unbiased dell’espressione genica (geni non noti e miRNA);
• ChIP-on-chip (chromatin immunoprecipitation on a chip)
• Array CGH (comparative genomic hybridization): tecnica usata in
diagnostica per l’individuazione di copy number variations e anomalie del
DNA
Gene 1
Gene 2
 da dove siamo partiti
 dove volevamo arrivare
 quali tecnologie abbiamo usato
I gruppi sperimentali
 Da dove siamo partiti
• Gli estrogeni sono i principali ormoni sessuali nella
donna ed influenzano la fisiologia femminile sotto
vari aspetti
• Gli estrogeni permeano nelle cellule e legano il
loro specifico recettore, una proteina intracellulare
che , una volta attivata, è in grado di dimerizzare e
attivare la trascrizione di specifici geni
Cervello
Sistema
Cardiovascolare
Sistema
Riproduttivo
Osso
 Da dove siamo partiti
• Il modello animale utilizzato nel nostro laboratorio per lo studio
dell’attivazione del recettore degli estrogeni in vivo è il modello ERE-Luc
Luciferasi
Estrogen Receptor
Responsive Element
Fotoni
Luciferasi
Luciferina +
ATP
Estrogen Receptor
Responsive Element
CA
 Da dove siamo partiti
• Con questo modello abbiamo osservato l’attività del recettore degli estrogeni
in condizioni fisiologiche nell’animale femmina ciclante, e ci siamo focalizzati
sullo studio del ruolo del recettore degli estrogeni nel fegato
OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
CONDIZIONE FISIOLOGICA
1500 pg/ml
pg/ml
10 pg/ml
OVARIE
80 pg/ml
40 pg/ml
10 pg
 dove volevamo arrivare
Prepuberi
Femmine adulte
ciclanti
> 22 mesi
(menopausa)
Gravide
 quali tecnologie abbiamo usato
Microarray di espressione
Tiling Arrays
Analisi delle differenze di espressione genica nelle due
diverse condizioni
Analisi delle regioni di binding sulla cromatina di ERalfa
nelle due diverse condizioni
I livelli di estrogeni circolanti influenzano
l’espressione genica? Quali sono i geni
differenzialmente espressi?
Dove si localizza ERalfa?
La sua localizzazione è influenzata dagli
estrogeni circolanti?
 I gruppi sperimentali
OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
CONDIZIONE FISIOLOGICA
1500 pg/ml
80 pg/ml
40 pg/ml
10 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA
OVARIECTOMIA + induzione con ESTRA
1500 pg/ml
80 pg/ml
40 pg/ml
10 pg/ml
METESTRO
PROESTRO
Bassi livelli di estrogeno circolante
Alti livelli di estrogeno circolante
Workflow
Output
Analisi dei Dati
Risultati
 Workflow
Microarrays
Congelamento
Estrazione RNA
Retrotrascrizione
Marcatura
Ibridazione
 Output
Quasi 40.000 trascritti conosciuti
 Output
I dati grezzi vengono raccolti in un file: File CEL
E normalizzati: file RMA
… e analizzati grazie all’aiuto del team di bioinformatici
Met > Pro
Livello E2
 Output
Lista dei geni individuati
Met < Pro
Pro
Met
 Analisi dei dati
Come otteniamo informazioni da questa lista di geni?
Analizzandoli uno ad uno….
… o utilizzando specifici software
che consentono di ottenere in
modo semplice informazioni sulla
funzione dei geni identificati
CATEGORIE DI GENE ONTOLOGY
 Analisi dei dati
• GENE ONTOLOGY: può essere considerato una specie di enciclopedia che
raccoglie tutte le informazioni disponibili sui geni noti, attraverso delle
definizioni e delle parole chiave condivise.
• E’ suddiviso in 3 categorie:
• Processi biologici
• Funzioni molecolari
• Componenti cellulari
Un prodotto genico ha una o più funzioni cellulari, può essere coinvolto in diversi processi biologici e
infine potrebbe essere associato a diversi compartimenti cellulari.
http://www.geneontology.org/
http://www.geneontology.org/GO.tools.browsers.shtml
http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp
 Risultati
BIOSINTESI DEI LIPIDI e COLESTEROLO
Met > Pro
(pVal=5.10 e-6)
A
B
C
D
E
F
16%
DETOXIFICATION
(pVal=1.20 e-4)
G
H
REGOLAZIONE della TRASCRIZIONE dell’mRNA
Met < Pro
(pVal=4.80 e-2)
I
L
M
 Risultati
Biosintesi degli acidi grassi
Biosintesi del colesterolo
Ciclo Krebs
B
Z
X
W
J
Y
C
E
D
….
F
TG
Workflow e messa a punto
Output
Analisi dei dati
Risultati
 Workflow e messa a punto
Crosslinking
Sonicazione
500
100
DNA
Crosslinking inverso
Purificazione DNA
LM-Amplification
Frammentazione
Marcatura
Ibridazione
Binding Regions
ChIP-chip
Immunoprecipitazione
mRNA
 Output
Cutoff
1. Rilevazione del segnale relativo alle sequenze
Chipped, e posizionamento sul DNA
2. Definizione dei picchi relativi alle regioni di binding
tramite specifico algoritmo
3. Normalizzazione e analisi dei picchi che superano il
limite di cutoff
 Output
Chr 10
23476246
23477332
BED file
 Analisi dei dati
http://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/
Analizzandoli uno ad uno….
… chiedendo l’aiuto dei
bioinformatici che hanno creato di
sicuro qualche software che ti sarà
d’aiuto
 Analisi dei dati
> > > >
• Dove si localizzano (cromosomi)
• Dove si localizzano rispetto a geni noti
• Quali sequenze legano
• Quali sono i geni che si trovano nelle vicinanze?
• http://genome.ucsc.edu/
Chr 10
Risultati
553
siti di binding
15%
444
siti di binding
Risultati
Proestro
27%
Metestro
12%
18%
28%
51%
58%
Geni che presentano un sito
di binding a PROESTRO
nell’intorno di 20kb
Geni che presentano un sito
di binding a METESTRO
nell’intorno di 20kb
Regolazione dell’espressione
genica (pVal=8.50 e-5)
Regolazione dell’attività
riproduttiva (pVal=3.90 e-4)
Metabolismo dei lipidi e del
colesterolo (pVal=1.30 e-3)
Reagolazione dell’attività
riproduttiva (pVal=1.40 e-3)
Significato biologico
Real time PCR
Esperimenti sull’animale
Real Time PCR
• I geni epatici coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi e del
colesterolo mostrano un andamento regolare durante il ciclo
regolato dalla fluttuazione di estrogeni circolanti
ACLY
FASN
***
***
4
***
4
***
ELOVL6
***
*
3
***
**
*
3
3
2
2
2
1
1
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0
0
P
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**
2.5
2.0
3
1.5
1.5
2
1.0
1.0
1
0.5
0.5
0.0
E
M
D
P
Fatty acid biosynthetic pathway
E
***
***
2.5
2.0
0
M
M
D
DHCR7
*
4
P
E
PMVK
MVD
5
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D
***
0.0
P
Cholesterol biosynthetic pathway
E
M
D
trus
DHCR7
5
**
2.0
**
MVD
**
2.0
1.5
1.5
1.0
1.0
0.5
0.5
0.0
0.0
PMVK
DHCR7
M
2
1
1
DHCR7
2.5
PMVK
****
**
**
1.52.0
1.01.5
0.5
1.0
0.0
0.5
MVD
5
4
3
2
1
0
2.5
5
P
Fold Induction Over Proestrus
3
Fold Induction Over Proestrus
M
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2.02.5
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Fold Induction Over Proestrus
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Fold Induction Over Proestr
2
Fold Induction Over Proestrus
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M
*
Fold Induction Over Proestrus
• I geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo
0
appaiono sregolati durante0 le diverse fasi fisiologiche
0 della vita di
una donna
E
3
Fold Induction Over Proestrus
M
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InductionOver
OverProestrus
Proestrus
*
FoldInduction
Induction
Over
Proestrus
Fold
Over
Proestrus
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P
Fold Induction Over Proestrus
4
trus
2.5
E
P
Fold Induction Over Proestrus
Real Time PCR
4
*
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
4
3
2
1
0
 Successivi esperimenti sull’animale
Prepuberi
Femmine adulte
ciclanti
> 22 mesi
(menopausa)
Gravide
• Il livello di espressione
dei geni epatici coinvolti
nel metabolismo lipidico
e del colesterolo
appaiono sregolati
durante le diverse fasi
fisiologiche della vita di
una donna
• Si modifica anche il
contenuto di lipidi del
sangue e del fegato?
• Qual è la
conseguenza
biologica?
• Come può essere
ripristinato il profilo
lipidico corretto?
[email protected]