Universita’ di Bari
Conferenza di Denver
1-3 gruppo A
1966
X-6-12 gruppo C
13-15 gruppo D
19-20 gruppo F
by GP&NA
4-5 gruppo B
16-18 gruppo E
Y-21-22 gruppo G
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Cariotipi a confronto
1-3 gruppo A
4-5 gruppo B
X-6-12 gruppo C
13-15 gruppo D
19-20 gruppo F
by GP&NA
16-18 gruppo E
Y-21-22 gruppo G
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Metodi colorazione differenziale
Colorano una regione specifica di alcuni o
di tutti i cromosomi
C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabili
dei cromosomi 1,9,16,Y
Creano un’alternanza di bande chiare e
scure lungo l’asse del cromosoma
specifica per ogni coppia di omologhi.
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QM-banding pattern
utilizzando la mostarda di quinacrina......
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DAPI e QM
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G-bande
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R-bande
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Diagramma
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46,XX - cariotipo normale Femminile
Terminologia
46,XY - cariotipo normale Maschile
Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni:
- numero totale dei cromosomi (46)
- sesso dell’organismo
47,XY,+21
Maschio con 47 cromosomi (invece di 46)
ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down)
46,XX,del(14)(q23)
46,XY,dup(14)(q22q25)
46,XX,r(7)(p22q36)
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del=delezione
dup= duplicazione
r=ring (cromosoma ad anello)
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cromosoma
sul vetrino
FISH
sintesi di una sonda complementare
marcata con un fluorocromo
denaturazione
doppia elica
di DNA
AT C GGTATC C TA
TAGG C ATAG G AT
AT C GGTATC C TA
TAGG C ATAG G AT
AT C GGTATC C TA
TAGG C ATAG G AT
A
denaturazione
AT C GGTATC C TA
TAGG C ATAG G AT
TAGG C ATAG G AT
ibridazione della sonda sui
cromosomi denaturati
sul vetrino
AT C GGTATC C TA
TAGG C ATAG G AT
osservazione
del vetrino
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FISH : microscopio a fluorescenza


Osservazione
al microscopio
filtro di emissione
filtro di eccitazione
Lampada a vapori
di mercurio
CCD camera


Elaborazione al
computer
obiettivo/
condensatore
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fotografia
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FISH: metafase in DAPI
Cromosomi
1. denaturati
2. colorati con DAPI
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FISH: segnali
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FISH: merge
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Analisi del cariotipo
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con
colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione delle
metafasi e acquisizione delle immagini
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Allestimento del preparato
fitoemoagglutinina
(stimola la crescita)
colchicina
(ultimi 30’)
Ipotonica (20’)
sangue
periferico
proliferazione
centrifugazione
centrifugazione
48-96h
terreno di
coltura
fissativo
pellet
risospeso
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pellet
risospeso
fissativo
centrifugazioni (2-3)
risospensione
in poco
fissativo
allestimento del
preparato
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Analisi del cariotipo
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con
colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio,
selezione delle metafasi e acquisizione
delle immagini
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Colorazione QM
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
Fluorocromi: QM,
DAPI. Necessario un
microscopio
a flurescenza
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Colorazione Giemsa
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
G-banding con
Giemsa dopo
trattamento
con tripsina
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Analisi del cariotipo
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con
colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio,
selezione delle metafasi e acquisizione
delle immagini
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Selezione delle metafasi
 Ottima
ma…..
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Selezione delle metafasi
 Puo’
essere
anche cosi’..
Cromosomi non
ben riconoscibili,
difficili anche da
contare.
Scartare! (potendo)
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Selezione delle metafasi
 .. O cosi’
 Troppo contratti
pero’ si puo’ usare
per contarli.
Scartare! (potendo)
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Selezione delle metafasi
Sufficiente
 Si possono contare
Puo’ essere utile per
analizzare i cromosomi
non sovrapposti
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Selezione delle metafasi
Discreta
 Si possono
contare, e anche
se ci sono alcune
sovrapposizioni,
si possono
analizzare
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Selezione delle metafasi
 Buona
 Si possono
contare, e anche
se ci sono alcune
sovrapposizioni,
la morfologia dei
cromosomi e’
buona
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Come si fa il cariotipo?
1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER
SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL
NUMERO CROMOSOMICO
2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’
3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE
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Fare il cariotipo
46
10
9
11
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16
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Cariotipo ordinato
CARIOTIPO IN QM (specifico il bandeggio)
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