Mutazioni somatiche e germinali Progenie normale Tessuto somatico Progenie normale Tessuto germinale Mutazione somatica Clone cellulare Mutazione germinale mutante Progenie mutante Popolazioni finali Cloni cellulari mutanti Tempo Eventi mutazionali Mutazione tardiva Popolazioni iniziali Mutazione precoce TASSO DI MUTAZIONE E FREQUENZA DI MUTAZIONE Il tasso di mutazione misura la frequenza con cui una mutazione si origina ex novo in un’unità di tempo “biologico” (di solito una generazione) La frequenza di mutazione misura la frequenza della mutazione in una popolazione nel momento dell’osservazione Il tasso di mutazione è di una nuova mutazione ogni 7 divisioni cellulari La frequenza di mutazione nella 4° generazione è di 2 mutanti su 8 cellule L’analisi dei mutanti nei batteri: il piastramento in replica Terreno non selettivo Terreni selettivi Il test di fluttuazione sull’origine delle mutazioni Numerosità iniziale in ogni provetta: 105 batteri Tasso di mutazione: 1 ogni 107 batteri per generazione Frequenza attesa di provette in cui la mutazione è avvenuta alla 4°generazione: 8 su 100 Frequenza attesa di provette in cui la mutazione è avvenuta alla 2° generazione: 2 su 100 frequenza attesa di mutanti in quelle provette alla 5° generazione: 8 Numerosità finale in ogni provetta: 1,6x106 batteri frequenza attesa di mutanti in quelle provette alla 5° generazione: 2 Si è effettivamente che al trattamento, Dunque le mutazioniverificato preesistono poche provette avevano molti che mutanti quindi non le induce ma elemolte seleziona (mutazioni precoci) soltanto: le pochi mutazioni non sono adattative avevano mutanti (mutazioni tardive) Danno al DNA e sua riparazione: origine delle mutazioni H H ON H O H N H HC N H C N H C C C C C C C H C C CH H N N N N N C H C N N C C N C C C N C N CC O O HN H T H G A C Mutazioni spontanee: p. es. tautomeria Mutazioni indotte: p. es. da UV Dimero di Timina TT AA TT AA Fotoriattivazione: riparazione corretta TT AA Mutazione genica: transizione AT > GC DNA mutato UV Luce solare HH Riparazione SOS: soggetta a errore Escissione di nucleotidi Riparazione per escissione: corretta TT AA Escissione di basi Mutazione genica Mutazione cromosomica strutturale Cromosomi diversi Raggi X Cromatidi fratelli Riparazione per ricombinazione non omologa: soggetta ad errore Mutazioni indotte: p. es. da raggi X Riparazione per ricombinazione omologa: corretta Mutazioni Geniche e fenotipi • Mutazione genica: evento per cui un gene si trasforma da una forma allelica ad un’altra e il nuovo allele è ereditato secondo le leggi di Mendel. • Retromutazione: mutazione da un allele anormale ad un allele standard. • Mutazione morfologica: mutazione che si esprime in un’alterazione della forma dell’organismo. • Mutazioni letali,subletali, detrimentali: mutazioni che determinano la morte, la bassissima sopravvivenza o il danneggiamento dell’organismo. • Mutazioni condizionali: mutazioni il cui fenotipo si manifesta solo in particolari condizioni ambientali. • Mutazioni biochimiche: mutazioni che determinano la perdita o il cambiamento di un passaggio biochimico. • Mutazioni nutrizionali: mutazione per cui microrganismi passano da un genotipo standard con cui è possibile la crescita con terreno minimo (prototrofi) a un nuovo genotipo in cui è richiesta la somministrazione supplementare di specifiche sostanze (auxotrofi). • Mutazioni per resistenza: mutazioni che determinano la capacità di resistere a sostanze tossiche o a organismi patogeni cui invece il genotipo standard è sensibile. Mutazioni Geniche e effetti molecolari Mutazioni per sostituzione di base: • Sinonima: la tripletta mutata viene trascritta in un codone che codifica lo stesso aminoacido • Non sinonima: la tripletta mutata viene trascritta in un codone che codifica un altro aminoacido. • Senza senso: la tripletta mutata viene trascritta in un codone di terminazione (vedere 3° credito). Tutte le mutazioni geniche: • Con perdita di funzione: l’allele che ne deriva è un allele recessivo il cui prodotto ha perso la propria attività biologica (knock out). • Con acquisto di funzione: l’allele che ne deriva è un allele dominante il cui prodotto ha modificato la propria attività biologica, rendendola incondizionata. • Silente: l’allele che ne deriva non modifica l’attività biologica del proprio prodotto. Mutazioni cromosomiche strutturali a b c d Anello a b b c d c d e c d d e e Delezione interstiziale Delezione terminale a b Duplicazione Fissione centrica Fusione centrica a b Inversione paracentrica d c e b e Inversione pericentrica a b a b c d + e a b a d c f g h i l a b Dicentrico c d g f c d + h i l f g e Traslocazione reciproca Origine delle mutazioni cromosomiche strutturali 1: una rottura A A B B DELEZIONE TERMINALE (instabile) C ROTTURA A A B B A B B A C SI PERDE IL FRAMMENTO ACENTRICO SI POSSONO SALDARE LE ESTREMITA’ DI ROTTURA, DOPO LA REPLICAZIONE DEL CROMOSOMA I 2 CROMATIDI FRATELLI, SALDATI … OPPURE SI ROMPONO. RECIPROCAMENTE, NON SI POSSONO SEPARARE IN ANAFASE… Origine delle mutazioni cromosomiche strutturali 2: crossing over ineguale A A B B C A B C B B B B C C A B C DELEZIONE INTERSTIZIALE (stabile) C C CROSSING OVER INEGUALE IRREGOLARE A A B B APPAIAMENTO C A A A B APPAIAMENTO A A B B C C A B IRREGOLARE B B complementari DUPLICAZIONE IN TANDEM (stabile) CROMOSOMA NORMALE C B B Su un’altra scala (di- trinucleotidi) questo meccanismo può spiegare l’espansione dei microsatelliti, alla base di gravi patologie umane C TRIPLICAZIONE IN TANDEM (stabile) Origine delle mutazioni cromosomiche strutturali 3: due rotture su due bracci diversi dello stesso cromosoma F A B B E F B E A C D C D 2 rotture C D C A E D SI PERDE ANELLO IL FRAMMENTO (instabile) ACENTRICO A A E F F B B C D F E D C A B E INVERSIONE PERICENTRICA (stabile) F Origine delle mutazioni cromosomiche strutturali 4: due rotture sullo stesso braccio dello stesso cromosoma C B E E D F D C E D SI PERDE DELEZIONE IL FRAMMENTO INTERSTIZIALE ACENTRICO (stabile) B A C E D C F F A B A B A F F C E D A B D B A C E F INVERSIONE PARACENTRICA (stabile) Origine delle mutazioni cromosomiche strutturali 5: due rotture su due cromosomi diversi A G B H C I D L E M F N 2 rotture SI PERDE IL FRAMMENTO ACENTRICO Cromosoma Dicentrico (instabile) A G B H C TRASLOCAZIONE RECIPROCA STABILE I M L N D E F Origine delle mutazioni cromosomiche strutturali 6: riordinamenti al livello del centromero A B A B C C D E D 2 rotture SI PUO’ PERDERE IL CROMOSOMA PUNTIFORME F FISSIONE CENTRICA STABILE ? FUSIONE CENTRICA STABILE E F Mutazioni numeriche aneuploidi Gamete (spora) aploide (n) Cellula diploide (2n) Cellula trisomica (2n+1) Cellula monosomica (2n-1) Cellula tetrasomica (2n+2) Cellula nullisomica (2n-2) Cellula con aneuploidia multipla Gamete (spora) con aneuploidia multipla Gamete (spora) disomico (n+1) Gamete (spora) nullisomico (n-1) Gamete (spora) trisomico (n+2) Origine di mutazioni numeriche 1: non disgiunzione, monosomie e trisomie Mitosi Meiosi I Meiosi II 2n +1 2 (n +1) n +1 Non disgiunzione Non disgiunzione Non disgiunzione 2n - 1 2 (n – 1) n-1 Il risultato di una nondisgiunzione alla mitosi è la comparsa di cellule monosomiche e trisomiche Il risultato di una nonIl risultato di una nondisgiunzione alla disgiunzionemplici alla meiosi I è la comparsa meiosi II è la comparsa paia di gameti e disomici Se i di gameti nullisomici partecipano alla e di gameti nullisomici nullisomici econ disomici fecondazione gameti aploidi normali, ne risultano disomici zigoti monosomici e trisomici rispettivamente NON DISGIUNZIONE E ANEUPLOIDIE DEI CROMOSOMI SESSUALI Xw Xw P F1 Xw+ Y Xw XwY Xw Xw+ Xw Y Progenie normale aneuploidia XXY Xw+ Progenie eccezionale (1/2000) Gameti Xw+ Xw Xw XwXwXw+ LETALE Xw+ sterile Y X0 drosofila uomo In drosofila il sesso è determinato dal rapporto numerico fra autosomi e cromosomi X Nell’uomo il sesso è determinato dalla presenza/assenza del cromosoma Y 0 XwXwY Y LETALE Non disgiunzione in un oocita Mutazioni numeriche euploidi Cellula diploide (2n) Gamete (spora) aploide (n) Cellula autotetraploide (4n) Gamete (spora) diploide (2n) Cellula triploide (3n) Cellula monoploide (n) Cellula allotetraploide (2n+2n’) Gamete (spora) anfidiploide (n+n’) Origine di mutazioni numeriche:2 AUTOPOLIPLOIDIE A-IN MITOSI Il blocco di una mitosi di una Se c’è un blocco nella prima cellula diploide da origine a cellule mitosi tetraploidi di uno zigote,lo zigote Ile blocco di k mitosi l’organismo che nedaderiva origine a cellule con 2k+1n diventano tetraploidi cromosomi 4n cromosomi duplicati DUPLICAZIONE (interfase) 2n cromosomi duplicati BLOCCO DELLA MITOSI 4 n cromatidi Origine di mutazioni numeriche:2 AUTOPOLIPLOIDIE B- MEIOSI E FECONDAZIONE Blocco di una delle due divisioni meiotiche Fecondazione multipla Gamete non ridotto ZIGOTE 3 n ALLOPOLIPLOIDIA: gli ibridi anfidiploidi MEIOSI ABORTIVE, STERILITA’ Fecondazione interspecifica, fra specie diverse ma compatibili, con sviluppo dell’ibrido Zigote anfidiploide ibrido, vitale Successive divisioni mitotiche, differenziamento inividuo anfidiploide ibrido, vitale ma sterile I cromosomi non sono a 2 a 2 omologhi: in 1° divisione meiotica non riescono ad appaiarsi e segregano casualmente Di conseguenza i gameti sono sbilanciati geneticamente, quindi sterili ALLOPOLIPLOIDIA: origine di individui allopoliploidi Cellula anfidiploide INDIVIDUO ALLOTETRAPLOIDE FECONDO ZIGOTE Fecondazione fra gameti ALLOTETRAPLOIDE Salto di una mitosi nella linea germinale anfidiploidi GAMETE ANFIDIPLOIDE 1° DIVISIONE MEIOTICA NORMALE Meiocita allotetraploide Comportamento in meiosi delle mutazioni cromosomiche (I divisione meiotica): Mutazioni sbilanciate (duplicazioni e delezioni in eterozigosi, trisomie e monosomie) Eterozigote per una duplicazione Eterozigote per una delezione Trisomico Monosomico GAMETI NORMALI 50% a a A A b b B B B B a a A A b b a a A A b b B B A A B B a a b b GAMETI SBILANCIATI 50% Con duplicazione Con delezione Disomico Nullisomico ALTRI EFFETTI GENETICI: Un individuo eterozigote per una mutazione sbilanciata •soppressione del crossing over entro la regione deleta; produce metà gameti normali e metà gameti sbilanciati •pseudodominanza (la delezione di un allele dominante consente l’espressione di un allele recessivo) Comportamento in meiosi delle mutazioni cromosomiche (I divisione meiotica): inversioni paracentriche in eterozigosi A Crossing over all’interno dell’ansa fra i geni B e C E C Anafase I C BD A D E B D A C A C B B D E C E EFFETTI I gametiGENETICI: con i prodotti del crossing overdei nella regione del • soppressione prodotti invertita su 4) non sono crossing over(2entro la regione invertita; vitali Il cromatidio è instabile: • riduzione della dicentrico fecondità. forma un ponte di cromatina che si rompe e si perde D B A A D E C B Il frammento acentrico si perde E Comportamento in meiosi delle mutazioni cromosomiche (I divisione meiotica): inversioni pericentriche in eterozigosi Crossing over all’interno dell’ansa fra i geni B e C Cromatidi sbilanciati C B A A D C BD A B C D E E A E D C B D C B A D C B E Anafase II E Anafase I A E EFFETTI GENETICI: I gameti con i prodotti del • soppressione dei prodotti del crossing over nellala regione crossing over entro regione invertita (2 su 4) sono invertita; sbilanciati, con delezioni e • riduzione della fecondità. duplicazioni complementari; quindi non sono vitali o lo sono poco Comportamento in meiosi delle mutazioni cromosomiche (I divisione meiotica): traslocazioni reciproche in eterozigosi C C C C Segragazione A Segregazione B GENETICI: A B EFFETTI alternata: D D adiacente: si formano Anafase I si formano coppie di coppie di coinvolti; gameti gameti bilanciati: 2 confra i geni dei cromosomi • pseudoassociazione sbilanciati con delezioni i cromosomi normali e e duplicazioni 2 con i cromosomi A B A B • riduzione della fecondità. D complementari traslocati D E E E E F F F F Comportamento in meiosi delle mutazioni cromosomiche (I divisione meiotica): fusioni centriche in eterozigosi Segragazione con non disgiunzione Segregazione EFFETTIcorretta: GENETICI: secondaria: si formano si formano di B coppie C A B C B C A A coppie di gameti gameti bilanciati: 2 con • pseudoassociazione fra i geni deisbilanciati cromosomi coinvolti; con i cromosomi normali e nullisomie e disomie con il cromosoma •2riduzione della fecondità. complementari fuso A B C A B C A B C La trasposizione (ATGGC)n (GCCAT)n La trasposizione consiste nello spostamento di segmenti cromosomici da un sito cromosomico all’altro, grazie a particolari sequenze fiancheggiatrici e a enzimi (tra cui le trasposasi), i cui geni sono spesso inserite all’interno degli elementi trasponibili. Sequenze specifiche Geni per la trasposizione Elemento trasponibile Ds La trasposizione ha talvolta effetti mutageni specifici: il sistema degli elementi trasponibili Ac e Ds nel mais producono la rottura dei cromosomi nel sito di provenienza di Ds e l’inattivazione del gane Wx, in cui si inserisce Ds, inducendone la mutazione. La retro-trasposizione cromosoma trascrizione RNA retrotrascrizione La retro-trasposizione consiste nella trascrizione come RNA di segmenti cromosomici, che vengono retro-trascritti come DNA che si inserisce in altri siti cromosomici. DNA Sequenze specifiche Geni per la trasposizione La retro-trasposizione è il meccanismo che consente l’allungamento delle sequenze telomeriche in Drosophila sequenza trasponibile telomerica Test di mutagenesi: i loci specifici Trattamento mutageno AABBCCDD X ABCD gameti normali (999) AbCD gamete mutato (1) aabbccdd abcd gameti (1000) AaBbCcDd AabbCcDd % m u t a n t i Dose mutageno Test di mutagenesi: ClB + + l B X X + + + + P + + C Trattamento con agente mutageno X Y l B C+ + l* l C+ B + + Raramente l B + + C F1 2 :1 X X X Y X X l* + + + + X X l B C+ + X X l* + + l B X Y C 2 : 1 di F2 Assenza EFFETTI BIOLOGICI DELLE MUTAZIONI: 1 mutazioni germinali, precoci e somatiche Le mutazioni che insorgono in meiosi o dopo o che vi passano senza subire variazioni, determinano nella progenie i seguenti effetti: 1) MUTAZIONI GENICHE: il loro effetto dipende dalla dominanza e dal loro specifico effetto biologico. 2) MUTAZIONI CROMOSOMICHE SBILANCIATE (delezioni, duplicazioni, aneuploidie): sono dannose in eterozigosi e ancora più dannose in omozigosi. 3) MUTAZIONI STRUTTURALI BILANCIATE (inversioni, traslocazioni, fusionifissioni centriche): producono un difetto di fecondità negli eterozigoti 4) AUTOPOLIPLOIDIE: sono mal tollerate negli animali, ben tollerate nelle piante. 5) ALLOPOLIPLOIDIE: sono ben tollerate nelle piante e del tutto feconde. Le mutazioni che insorgono nello zigote, durante la segmentazione o nelle prime fasi dell’embriogenesi, eventualmente prima della distinzione fra cellule somatiche e germinali sono le MUTAZIONI PRECOCI, che determinano il loro effetto in settori del corpo tanto più ampi quanto più precoce è la mutazione; sono una delle cause del MOSAICISMO (presenza di cellule con due o più genotipi diversi in un individuo). Le mutazioni che insorgono nelle cellule somatiche sono le MUTAZIONI SOMATICHE, che determinano il loro effetto in settori limitati delle cellule somatiche. EFFETTI BIOLOGICI DELLE MUTAZIONI: 2 mutazioni somatiche e cancro Cellule normali mutageni Mutazioni somatiche Cancro Displasia Il cancro viene indotto da una successione di mutazioni somatiche che coinvolgono geni connessi al controllo della proliferazione cellulare e che conferiscono ai cloni cellulari mutati una proliferazine incontrollata. Metatstasi La predisposizione genetica al cancro consiste in genotipi che derivano dalla trasmissione ereditaria via linea germinale di assetti genetici (alleli, cromosomi mutati etc) e che facilitano l’insorgenza di tumori: p. es. genotipi difettivi per la riparazione del DNA danneggiato, come l’omozigosi per gli alleli recessivi di Xeroderma pigmentosum, difettiva per la riparazione da escissione (diapositiva 5), aumentano il tasso delle mutazioni somatiche. p. es. genotipi potenzialmente difettivi per il controllo del ciclo cellulare, come l’eterozigosi per gli alleli recessivi di RB1, che in omozigosi non controllano pù il passaggio da G1 a S, consentendo una proliferazione indiscriminata. Mutazioni e cancro Le mutazioni somatiche che portano al cancro riguardano in particolare: a) geni che tutelano la stabilità del ganoma – protezioneriparazione del DNA (p. es. Xp); Go G1 S Controllo Induzione pRB1 pABL b) geni “oncosoppressori” che controllano la progressione nel ciclo cellulare (p. es RB1); c) “protooncogeni”, che inducono la proliferazione cellulare in seguito a stimoli specifici (p. es. ABL). I meccanismi principali per cui le mutazioni somatiche innescano la trasformazione tumorale sono •espressione di nuovi alleli dovuti a mutazione genica; •effetto di posizione in inversioni e traslocazioni, per cui un gene modifica la sua espressione in funzione delle regioni cromosomiche adiacenti o addirittura si formano geni “ibridi”; • alterazione del dosaggio genico in seguito a mutazioni cromosomiche sbilanciate o ad amplificazione; • pseudodominanza o “perdita di eterozigosità” per cui si manifestano alleli recessivi in seguito alla perdita dei corrispondenti alleli dominanti in seguito a delezione, monosomia o ulteriori mutazioni alleliche verso l’allele recessivo. Cromosoma “Philadelphia” RB1 RB1- Cromosoma 13 RB1Delezione - pseudodominanza BCR ABL Cromosoma 22 Cromosoma 9 BCR-ABL Traslocazione – gene ibrido