LA TECNOLOGIA del
DNA RICOMBINANTE o
CLONAZIONE MOLECOLARE
Corso di Biotecnologie
12 Maggio 2008
Rappresentazione schematica del clonaggio (I)
DNA SORGENTE
VETTORE DI
CLONAZIONE
1
DNA BERSAGLIO
2
frammentazione enzimatica
3
linearizzazione enzimatica
congiungimento DNA bersagliovettore di clonazione
introduzione del DNA nella
cellula ospite (trasformazione) e
isolamento delle cellule con il
gene clonato
cellula ospite
Produzione della
proteina
dal gene clonato
proteina codificata
dal gene clonato
tutto ciò è possibile… grazie alla scoperta delle endonucleasi di restrizione
Le Endonucleasi di Restrizione (I)
Enzimi batterici: endonucleasi di TIPO II:
- Riconoscono e tagliano corte sequenze di DNA
(4-8bp);
- le sequenze riconosciute sono palindromiche,
cioè risultano ugluali se lette su ogni filamento
nella stessa direzione
- il taglio produce estremità piatte o coesive
Esempio di una delle prime endonucleasi di tipo II meglio caratterizzate:
EcoRI
EcoRI
EcoRI
genere:
Escherichia
specie:
Coli
Ordine di caratterizzazione di
diverse endonucleasi
appartenente allo stesso
ceppo:
organismo (I)
R
SITO DI
RICONOSCIMENTO
P
OH
5’- GAATTC - 3’
3’- CTTAAG – 5’
PRODOTTI
5’- G
3’- CTTAA
P
AATTC - 3’ FORMAZIONE
DI ESTREMITÀ
G – 5’ COESIVE
OH
Le Endonucleasi di Restrizione (II)
Enzima
Sito di riconoscimento
EcoR I
GAAT T C
C T TAA G
BamH I
G GATC C
C CTAG G
Hind III
AA G C T T
T T C GAA
KPN I
G G TAC C
C CATG G
NOT I
GCGGCCGC
CGCCGGCG
EcoR V
GATATC
C TATAG
Xho I
CTCGAG
GAGCTC
Isoschizomeri
Sebbene gli enzimi di restrizione isolati siano oltre 3500, le sequenze bersaglio che possono
essere tagliate sono molte di meno (appena più di duecento). E’ evidente che molti enzimi
isolati da batteri diversi hanno la stessa specificità di sequenza,sono cioè isoschizomeri.
…grazie alla scoperta delle endonucleasi di restrizione…
Le librerie geniche:
collezione di cloni derivante dalla totalità di DNA estratto da un organismo e
digerito con un enzima di restrizione:
Le librerie genomiche:
composta dalla totalità del DNA cromosomico di un organismo (es: se si vuole
studiare l’organizzazione genica);
Le librerie di cDNA: composta dall’mRNA di una cellula o di un tessuto in un particolare momento (es:
studiare il profilo di espressione di una particolare proteina in u particolare momento o tessuto)
Confronto tra I principali passaggi richiesti per la costruzione di librerie genomiche e di cDNA
1
Libreria genomica
Libreria di cDNA
1
2
Estrazione del DNA
cromosomico
Estrazione dell’mRNA
2
3
Taglio del DNA con
endonucleasi di restrizione
(digestione parziale o totale)
Produzione di cDNA
(trascrittasi inversa)
3
4
Inserimento di ogni frammento
di DNA in un vettore
Inserimento di ogni cDNA
in un vettore
4
5
Trasformazione batterica
Screening di librerie geniche
1. Ibridazione su colonia del DNA
Piastra
madre
matrice
Trasferimento cellule
o ciascuna colonia formatasi sulla
piastra madre, si trasferisce un
campione su una matrice solida
(membrana di nylon o nitrocellulosa)
o si piastrano cellule provenienti
dalla reazione di trasformazione
su terreno con antibiotico
Subcultura della cellule
dalle colonie positive
provenienti dalla piastra madre
o si lisano le cellule della matrice
e si denatura il DNA liberato,
deproteinizzandolo e legandolo
irreversibilmente alla matrice
Incubazione con la sonda di DNA
complementare al DNA di interesse.
Lavaggi che eliminano la sonda non legata.
Autoradiografia che rivela i cloni
identificati con la sonda
Screening di librerie geniche
2. Immunodosaggio di colonie
Piastra
madre
1. Trasferimento
cellule
matrice
2. ciascuna colonia formatasi sulla
piastra madre, si trasferisce un
campione su una matrice solida
(membrana di nylon o nitrocellulosa)
3. si lisano le cellule
della matrice e si
ancorano le proteine
alla matrice
Subcultura della cellule
dalla colonia positiva
proveniente dalla piastra madre
4. Anticorpo primario (l)
l
l
l
6. Eliminazione per lavaggio del
secondario non legato e si effettua una
reazione cromatica che funziona solo
in presenza del secondario.
5. Eliminazione per
lavaggio del primario e
incubazione con
anticorpo secondario
(w)
Estremità piatte
Esempio: HaeIII (da Haemophilus
parainfluenzae)
Estremità coesive
Esempio: EcoRI
La sequenza di DNA in doppia elica:
La sequenza di DNA in doppia elica:
5’-NNNNGGCCNNNN-3’
3’-NNNNCCGGNNNN-5’
5’-NNNNGAATTCNNNN-3’
3’-NNNNCTTAAGNNNN-5’
viene tagliata nel seguente modo:
viene tagliata nel seguente modo:
5’-NNNNGG pCCNNNN-3’
3’-NNNNCCp GGNNNN-5’
5’-NNNNG pAATTCNNNN-3’
3’-NNNNCTTAAp GNNNN-5’
In questo caso il taglio è perfettamente
simmetrico. Le estremità piatte sono saldate in
modo inefficiente dalla DNA ligasi, perché non
restano associate a lungo.
Tutte le estremità generate dagli enzimi che
operano un taglio sfalsato, siano esse
sporgenti in 5’ o in 3’, sono “appiccicose”,
cioè possono formare ponti idrogeno tra le
due
code
a
filamento
singolo
complementari.
Rappresentazione schematica del clonaggio (II) - estremità coesive
reannealing
annealing
Tutti questi appaiamenti (annealing-reannealing) sono transitori a causa della debolezza dei legami
a idrogeno tra il numero ridotto di basi a livello delle estremità coesive. Questi legami vengono
stabilizzati grazie all’uso dell’enzima DNA LIGASI in un processo noto con il nome di ligazione.
Enzima T4 DNA ligasi (isolato dal batteriofago T4) forma legami covalenti tra il gruppo fosfato 5’
di una estremità e il gruppo 3’ OH della catena adiacente. L’enzima lavora a 10°C e richiede ATP.
Rappresentazione schematica del clonaggio (III) - estremità coesive
Siti di
restrizione
BAMH1
gene per resistenza
ad antibiotico
plasmide
DNA estraneo
Siti di
restrizione
ECOR1
BAMH1
ECOR1
BAMH1
ECOR1
BAMH1
GATCC
G
G
CCTAG
ECOR1
G
CTTAA
C
TC G
A
G
G
CTTAA
estremità coesive
G
T AG
CC
AATTC
G
Ibridazione delle
estremità e ligazione
annealing
reannealing
AATTC
G
Trattamento del DNA con estremità piatte
La ligazione di frammenti con estremità piatte non è efficiente quanto quella di frammenti con estremità
coesive, perciò prima di unire il DNA con il vettore di clonaggio è necessario eseguire alcune procedure
aggiuntive:
1.
DNA a estremità
piatte
AGGIUNTA DEL LINKER
5’ pGGGATCCC
3 CCCTAGGG
linker
Taglio con BamHI
Unione del linker al DNA con estramità
piatte mediante DNA ligasi
5’ pGGGATCCC
3’ CCCTAGGG
GGGATCCC
CCCTAGGG
Taglio con BamHI
5’ pGATCCC
3’
GG
plasmide
GG
CCCTAGp
Unione delle estremità
coesive mediante DNA ligasi
Vettori per il clonaggio (I)
Per clonare una qualsiasi molecola di DNA è necessario inserirla in un vettore per il clonaggio.
Questi elementi di DNA possono essere mantenuti e propagati in un organismo ospite in cui il
vettore possa replicarsi. Un tipico ospite è Escherichia Coli che cresce e si divide
rapidamente. Qualsiasi vettore con un origine di replicazione adatta si replica con successo in
E.Coli (assieme al DNA inserito). Quindi, qualsiasi DNA inserito in un vettore può essere
amplificato (se ne possono produrre quantità illimitate) e usato per successive analisi
Libreria genica: ogni vettore
contiene un frammento diverso di
DNA estraneo
Isolamento di un clone mediante
screening della libreria
Amplificazione
del singolo clone
Vettori per il clonaggio (II)
- SONO STATI SVILUPPATI DA MOLECOLE PRESENTI IN NATURA (PLASMIDI BATTERICI, BATTERIOFAGI) O
COMBINAZIONE DEGLI ELEMENTI CHE LI COMPONGONO (COSMIDI).
Plasmidi (i)
• DNA extracromosomico circolare di piccole dimensioni presente in molti batteri che conferisce
resistenza a antibiotici, capacità di metabolizzare substrati e capacità di coniugazione.
• anni ’70: alcuni di questi vettori sono stati modificati in laboratorio (digestioni e successive ligazioni)
pr costruire vettori di clonaggio (es: pBR322 da Bolivar e Rodriguez);
• un plasmide artificiale è molto più piccolo di quello naturale e viene più facilmente inserito nei batteri
nel processo noto come trasformazione;
• un origine di replicazione del DNA di tipo batterico cosicchè il DNA può essere replicato dalla cellula
ospite
• plasmidi come pBR322 hanno un origine di replicazione rilassata, che non segue cioè la divisione
cellulare, in modo che la replicazione del plasmide è molto più frequente di quella cromosomica. In
questo modo ogni cellula produce molte molecole di plasmide.
• Sono stati introdotti due geni che codificano per la rsistenza agli antibiotici
• in vari punti del palsmide ci sono siti singoli di riconoscimento per una serie di enzimi di restrizione.
Alcuni di questi siti possono essere inseriti in un gene che codifica per la resistenza ad un antibiotico,
cosicchè la presenza di un particolare inserto può essere rivelata dalla perdita di resistenza a quello
stesso antibiotico (inattivazione inserzionale).
Vettori per il clonaggio (III)
pBR322
Esempio di mutagenesi inserzionale (singolo taglio con BamHI)
Inattivazione Inserzionale
Plasmide ricircolarizzato
T4 DNA LIGASI
+
pBR322 dig BamHI
singolo sito di restrizione
Plasmide che contiene
più copie del frammento
Plasmide contenente l’inserto
Frammento di DNA
cromosomico dig BamHI
colonie cresciute su piastra
contenente
Ampicillina,
crescono solo le cellule che
contengono il plasmide
TRASFORMAZIONE: incorporazione
di piccole molecole circolari in E.Coli
Recupero delle colonie
contenenti plasmide+inserto
presenti sulla piastra AmpR
Piastramento in replica
utilizzando un tampone
di velluto sterile
incubazione
Piastra contenente
Tetraciclina
crescono solo le cellule
con plasmide senza insertto:
Plasmidi (ii) : pUC
• gene per la resistenza alla tetraciclina;
• origine di replicazione per E.Coli;
• Multiple Cloning Site (MCS) o polylinker: siti
di restrizione unici più comuni;
• MCS è parte del gene lacZ che codifica per
la b-galattosidasi;
Plasmidi (iii) : pUC
Quando si trasformano cellule di E.Coli con il plasmide pUC, il
gene può essere attivato aggiungnedo nel terreno l’induttore
isopropil-b-D-tiogalattopiranoside (IPTG), la cui presenza
induce l’espressione della b-galattosidasi. L’ezima funzionale
idrolizza una sostanza incolore detta 5-bromo-4-cloro-3indolil-b-galattopiranoside (X-Gal) producendo un composto
blu insolubile.
1. Vettori non ricombinanti (senza inserto)
INDUZIONE CON IPTG
MCS
X-Gal idrolizzato: placca blu
GENE PER LA b-GALATTOSIDASI
2. Vettori ricombinanti (senza inserto)
INDUZIONE CON IPTG
GENE INSERITO
INSERIMENTO DEL DNA NEL
MCS CON INTERRUZIONE DEL
GENE b-GAL
X-Gal NON idrolizzato: placca bianca
Vettori derivati da virus (I)
-
Per inserti lunghi (più di 5kb) si usano vettori derivanti dal batteriofago l in quanto offrono una
efficienza di clonaggio superiore di circa 16 volte rispetto ai vettori plasmidici;
il batteriofago l è un fago con DNA lieare a doppia elica, lungo circa 49 kb in grado di infettare
E.Coli, inserendogli il proprio DNA attraverso la membrana cellulare
il DNA del fago l può replicarsi secondo due modalità:
1.
2.
si integra nel cromosoma di E. Coli dove resta quiesciente fino a quando un segnale ne
promuove l’escissione (ciclo lisogenico)
si replica aapena infetta la cellula, sintetizza le proteine della testa e della coda, si
formano nuove particelle fagiche (ciclo litico)
Vettori derivati da virus (II)
DNA
testa
coda
I fagi sono stati utilizzati per la costruzione di librerie geniche perchè hanno permesso di introdurre
frammenti più grandi di DNA rispetto ai plasmidi. Il DNA del batteriofago l è lungo circa 50 kb,
approssimativamente 20 dei quali risultano indispensabili agli eventi di integrazione-escissione (I/E). Per
formare le genoteche si è ragionato sulla possibilità di sostituire queste 20 kb con altrettante kb di DNA
clonato. Una simile molecola di DNA si potrebbe perpetuare sotto forma di batteriofago l “ricombinante”
tramite cicli litici forzosi.
Cosmidi
Possono trasportare 40 kb di DNA clonato e possono essere mantenuti come plasmidi in E. Coli.
Vettori di clonaggio
Vector system
Host cell
Insert capacity (kb)
Plasmid
E. coli
0.1-10
Bacteriophage l
E. coli
10-20
Cosmid
E. coli
35-45
Bacteriophage P1
E. coli
80-100
BAC (bacterial artificial
chromosome)
E. coli
50-300
P1 bacteriophage-derived
AC
E. coli
100-300
YAC
Yeast
100-2,000
La trasformazione (I)
introduzione del DNA nella
cellula ospite (trasformazione) e
isolamento delle cellule con il gene
clonato
Produzione della
proteina
dal gene clonato
proteina codificata
dal gene clonato
La trasformazione (II)
TRASFORMAZIONE: assunzione di DNA da parte di un organismo
1970: Mandel and Higa osservarono che batteri, trattati con soluzioni di
CaCl2 e riscaldati velocemente, potevano essere trasformati con DNA del
batteriofago λ quindi questo trattamento conferiva ai batteri un transiente
stato di “competenza”
COMPETENZA: capacità di assumere DNA
= numero di colonie positive/microgrammo di DNA trasformato
Nel corso degli anni sono stati fatti diversi tentativi per migliorare
l’efficienza di trasformazione. Le due tecniche maggiormente utilizzate oggi
sono:
Trasformazione per CaCl2
Elettroporazione
Trasformazione Per Elettroporazione
Le cellule batteriche unite
al DNA vengono sottoposte
ad una veloce scarica
elettrica che permette la
formazione di “elettropori”
che favoriscono l’entrata di
DNA.
Competenza: 108-1010 cellule
trasformate /μg di DNA
Trasformazione in CaCl2
Crescita di un ceppo E.Coli in
terreno ricco di nutrienti.
Le cellule si raccolgono quando
sono in fase logaritmica
 I cationi divalenti schermano le cariche negative sul DNA (dei gruppi fosfato)
 La combinazione di bassa temperatura e di cationi divalenti può aiutare a cristallizzare
regioni della membrana rendendo più accessibili i canali di assunzione del DNA
Sommario delle fasi importanti nella clonazione del DNA
1.
2.
3.
Vettore plasmidico e DNA esogeno da inserire devono avere estremità compatibili. I due “pezzi” di DNA
sono fusi creando molecole di DNA ricombinante;
Introduzione del DNA in cellule batteriche ospiti idonee (trasformazione)
Selezione delle cellule resistenti all’antibiotico e selezione dei cloni che hanno assunto il DNA
ricombinante
Primo esempio di clonaggio
gene di
interesse
BamHI
EcoRI
VETTORE I
Secondo esempio di clonaggio
gene di
interesse
Not1
BglII
VETTORE I
…Come si procede ???...
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
se decido di clonare il gene di interesse BamHI-EcoRI devo essere sicura che gli stessi enzimi non
tagliano all’interno della mia sequenza genica;
Devo disegnare due oligo, uno frw con la sequenza che possiede il sito di riconoscimento per l’enzima
BamHI e uno reverse che contiene il sito di riconoscimento per l’enzima EcoRI
Amplificazione per PCR della sequenza genica di interesse con gli oligo disegnati;
Purificazione della PCR preparativa
Digestione con gli enzimi BamHI e EcoRI per la formazione delle estremità coesive
Digestione del vettore pOTB7 con BamH1 e EcoRI
Ligazione con l’ezima T4 DNA ligasi
1.
se decido di clonare il gene di interesse BamHI-EcoRI devo essere sicura che gli stessi enzimi non
tagliano all’interno della mia sequenza genica;
1 atggagatgg aaaaggagtt cgagcagatc gacaagtccg ggagctgggc ggccatttac
61 caggatatcc gacatgaagc cagtgacttc ccatgtagag tggccaagct tcctaagaac
121 aaaaaccgaa ataggtacag agacgtcagt ccctttgacc atagtcggat taaactacat
181 caagaagata atgactatat caacgctagt ttgataaaaa tggaagaagc ccaaaggagt
241 tacattctta cccagggccc tttgcctaac acatgcggtc acttttggga gatggtgtgg
301 gagcagaaaa gcaggggtgt cgtcatgctc aacagagtga tggagaaagg ttcgttaaaa
361 tgcgcacaat actggccaca aaaagaagaa aaagagatga tctttgaaga cacaaatttg
421 aaattaacat tgatctctga agatatcaag tcatattata cagtgcgaca gctagaattg
481 gaaaacctta caacccaaga aactcgagag atcttacatt tccactatac cacatggcct
541 gactttggag tccctgaatc accagcctca ttcttgaact ttcttttcaa agtccgagag
601 tcagggtcac tcagcccgga gcacgggccc gttgtggtgc actgcagtgc aggcatcggc
661 aggtctggaa ccttctgtct ggctgatacc tgcctcttgc tgatggacaa gaggaaagac
721 ccttcttccg ttgatatcaa gaaagtgctg ttagaaatga ggaagtttcg gatggggctg
781 atccagacag ccgaccagct gcgcttctcc tacctggctg tgatcgaagg tgccaaattc
841 atcatggggg actcttccgt gcaggatcag tggaaggagc tttcccacga ggacctggag
901 cccccacccg agcatatccc cccacctccc cggccaccca aacgaatcct ggagccacac
961 aatgggaaat gcagggagtt cttcccaaat caccagtggg tgaaggaaga gacccaggag
1021 gataaagact gccccatcaa ggaagaaaaa ggaagcccct taaatgccgc accctacggc
1081 atcgaaagca tgagtcaaga cactgaagtt agaagtcggg tcgtgggggg aagtcttcga
1141 ggtgcccagg ctgcctcccc agccaaaggg gagccgtcac tgcccgagaa ggacgaggac
1201 catgcactga gttactggaa gcccttcctg gtcaacatgt gcgtggctac ggtcctcacg
1261 gccggcgctt acctctgcta caggttcctg ttcaacagca acacatag
Programma che permette di fare un’analisi di restrizione della sequenza
2.
Devo disegnare due oligo, uno frw con la sequenza che possiede il sito di riconoscimento per l’enzima
BamHI e uno reverse che contiene il sito di riconoscimento per l’enzima EcoRI
ggcccgtcatggagatggaaaaggagttcgagcagatcgacaagtccgggagctgggcggccatttac
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------gccggcgcttacctctgctacaggttcctgttcaacagcaacacatag
Costruzione dell’oligo frw
Codina di 5-6 nt - sequenza riconosciuta dall’enzima di restrizione (BamHI) – sequenza compresa di atg
(codone di inizio). L’oligo deve essere lungo circa 15-30 nt
CTAGCGGATCCGGCCCGTCATGGAGATGGAA
Costruzione dell’oligo reverse
Sequenza fino al codone di stop (stop incluso)- sequenza riconosciuta dall’enzima di restrizione- e
codina di 5-6 nt. Fare il reverse complement
TTCCTGTTCAACAGCAACACATAGGAATTCCTAGC
GCTAGGAATTCCTATGTGTTGCTGTTGAACAGGAA
CTAGCGGATCCGGCCCGTCATGGAGATGGAA
CCGGGCAGTACCTCTACCTTTTCCTC-------------------------------------------GGCCCGTCATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATCGACAAGTCCGGGAGCTGGGCGGCCATTTAC
-----------------------------------------------------------------CGGCCGCGAATGGAGACGATGTCCAAGGACAAGTTGTCGTTGTGTATC
GCCGGCGCTTACCTCTGCTACAGGTTCCTGTTCAACAGCAACACATAG
AAGGACAAGTTTGTCGTTGTGTATCCTTAAGGATCG
•
•
•
•
•
Amplificazione per PCR della sequenza genica di interesse con gli oligo
disegnati;
Purificazione della PCR preparativa
Digestione con gli enzimi BamHI e EcoRI per la formazione delle estremità
coesive
Digestione del vettore pOTB7 con BamH1 e EcoRI
Ligazione con l’ezima T4 DNA ligasi