Tassonomia del genere
Mycobacterium
Enrico Tortoli
Centro Regionale di Riferimento
per i Micobatteri
Firenze
Le pietre miliari della tassonomia
• Adamo è autorizzato da Dio a dare
un nome a tutti gli esseri viventi
(Genesi 2.19)
• 4o secolo a.C., Aristotele si
cimenta nella differenziazione di
piante ed animali
• 1o secolo d.C., Plinio il vecchio
dedica 4 libri della Naturalis
historia alla zoologia, e 8 alla
botanica
• 18o secolo: Linneo introduce il
sistema binomio
Pietre miliari nella tassonomia dei
micobatteri
•
•
•
•
•
•
1896 Lehmann e Neuemann descrivono:
• Il genere Mycobacterium
• M. leprae
• M. tuberculosis
1899 descrizione di:
• M. smegmatis
• M. phlei
1901 descrizione di M. avium
1923 descrizione di:
• M. paratuberculosis
• M. chelonae
1926 descrizione di M. marinum
1938 descrizione di M. fortuitum
Pietre miliari nella tassonomia dei
micobatteri
• 1967 L. Wayne fonda lo IWGMT
• Analisi dei caratteri fenotipici
• Tassonomia numerica
• Studi cooperativi
• 1987 lo IWGMT riconosce il valore degli studi
basati sull’omologia del DNA
• Ceppi con omologia >70% appartengono alla stessa
specie
• 1990 E. Böttger adotta, per primo, il
sequenziamento genico per l’analisi della
tassonomia del genere Mycobacterium
Classificazione
• regno: Bacteria
• tipo: Actinobacteria
• classe: Actibobacteridae
• ordine: Actinomycetales
• famiglia: Corynebacteriaceae
- genere: Mycobacterium
I complessi
•
•
•
•
M. tuberculosis complex
M. avium complex
M. terrae complex
M. fortuitum complex
La tassonomia dei micobatteri
• fino agli anni ’80
• basata esclusivamente sui caratteri
fenotipici
• negli ultimi 15 anni
• sempre più basata sui caratteri
genotipici
Tassonomia basata sul genotipo
• Le varie regioni del genoma sono soggette
alle mutazioni in maniera diversa
• I geni che codificano per funzioni essenziali
(house keeping genes) sono poco soggetti
alle mutazioni e le rare sostituzioni di
nucleotidi sono “conservative”
• Nelle regioni non codificanti le mutazioni
sono largamente tollerate
• A metà strada si collocano le regioni
codificanti per funzioni non essenziali e,
fra le regioni non codificanti, quelle che
vengono trascritte
Principali target genetici degli
studi tassonomici
•
•
•
•
•
16S rDNA
23S rDNA
hsp65
ITS
rpoB
Il 16S rRNA
• 1.500 pb
• altamente conservato
• divergenza <6%
• singola copia nei
micobatteri a crescita
lenta; doppia copia in
quelli a crescita rapida
• 2 regioni ipervariabili
• A: elica 10 (inizio
posiz. 120)
• B : elica 18 (inizio
posiz. 430)
L’elica 18 del 16S rRNA
M.
M.
M.
M.
tuberculosis
chelonae
simiae
terrae
5’
5’
5’
5’
CCA
GTA
GCA
GTA
TCG
GGG
GGG
TCG
ACG
ACG
ACG
GCG
AAG
AAG
AAG
AAG
GTC
CGA
CGC
CTC
CGG
AGG
AAG
CGT
GTT
TGA
TGA
GGT
CTC
CGG
CGG
TTT
TCG
TAC
TAC
CTG
GAT
CTA
CTG
CGG
TGA
CAG
CAG
GGT
CGG
AAG
AAG
GAC
TAG
AAG
AAG
GGT
GTG GAG AAG AAG C
G
C
AAC TGG AGA AGA AGC
L’elica 18 del 16S rRNA
M.
M.
M.
M.
tuberculosis
chelonae
simiae
terrae
5’
5’
5’
5’
CCA
GTA
GCA
GTA
TCG
GGG
GGG
TCG
ACG
ACG
ACG
GCG
AAG
AAG
AAG
AAG
GTC
CGA
CGC
CTC
CGG
AGG
AAG
CGT
--G
----GGT
TTC
----TTT
TCT
----CTG
CGG
----CGG
ATT
--T
--T
GGT
GAC
GAC
GAC
GAC
GGT
GGT
GGT
GGT
AGG
ACC
ACC
AAC
TGG
TAC
TGC
TGG
AGA
AGA
AGA
AGA
AGA
AGA
AGA
AGA
AGC
AGG
AGC
AGC
L’elica 10 del 16S rRNA
M.
M.
M.
M.
M.
tuberculosis
simiae
chelonae
terrae
smegmatis
5’
5’
5’
5’
5’
CAC
CAC
CAC
CAC
CAC
TTC
TTC
TCT
TCT
TTT
GGG
GGG
GGG
GGG
GGG
ATA
ATA
ATA
ATA
ATA
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
CTG
CTG
CTG
CTG
CTG
GGA
GGA
GGA
GGA
GGA
AAC
AAC
AAC
AAC
AAC
TGG
TGG
TGG
TGG
TGG
GTC
GTC
GTC
GTC
GTC
TAA
TAA
TAA
TAA
TAA
TAC
TAC
TAC
TAC
TAC
CGG
CGG
CGG
CGG
CGA
ATA
ATA
ATA
ATA
ATA
GGA
TGA
TGA
GGA
GAC
CCA
CCA
CCA
CCG
CCT
CGG
CGG
CAC
CGC
TCT
GAT
AAC
ACT
GCT
GAT
GCA
GCA
TCA
TCA
CCG
TGT
TGT
TGG
TGG
ATG
CT
TT
TG
TG
GTC
L’elica 10 del 16S rRNA
M.
M.
M.
M.
M.
tuberculosis
simiae
chelonae
terrae
smegmatis
5’
5’
5’
5’
5’
CAC
CAC
CAC
CAC
CAC
TTC
TTC
TCT
TCT
TTT
GGG
GGG
GGG
GGG
GGG
ATA
ATA
ATA
ATA
ATA
AGC
AGC
AGC
AGC
AGC
CTG
CTG
CTG
CTG
CTG
GGA
GGA
GGA
GGA
GGA
AAC
AAC
AAC
AAC
AAC
TGG
TGG
TGG
TGG
TGG
GTC
GTC
GTC
GTC
GTC
TAA
TAA
TAA
TAA
TAA
TAC
TAC
TAC
TAC
TAC
CGG
CGG
CGG
CGG
CGA
ATA
ATA
ATA
ATA
ATA
GG-A
TG-A
TG-A
GG-A
GACC
CCA
CCA
CCA
CCG
CTT
CGG
CGG
CAC
CGC
CTG
GAT
AAC
ACT
GCT
ATC
GCA
GCA
TCA
TCA
CGA
TGT
TGT
TGG
TGG
TGG
CT
TT
TG
TG
TC
Filogenesi basata sul 16S rDNA
• Micobatteri a crescita lenta
• Specie a crescita lenta “classiche”
• Specie correlate a M. simiae
• Specie correlate a M. terrae
• Micobatteri a crescita rapida
• Specie a crescita rapida “classiche”
• Specie a crescita rapida termotolleranti
ITS
• Spaziatore interposto fra rDNA 16S e rDNA 23S
• Lunghezza compresa fra 270 a 400 pb con
variabilità concentrata in un tratto di 220 pb
• Molte specie ne hanno più di una copia
• A causa dell’elevata variabilità molte specie sono
caratterizzate da più di un sequevar nel ITS; i
sequevar sono particolarmente numerosi in:
•
•
•
•
MAC
M. fortuitum complex
M. gordonae
M. kansasii
23S rDNA
• 3.115 pb
• Tratto variabile lungo 250 pb
• Altissimamente conservato, alcune
specie (in particolare quelle del
MAC) non sono ben differenziabili
hsp65
• Gene codificante per la heath shock
protein da 65 kDa
• Lunghezza 4.400 pb con 2 regioni
ipervariabili incluse in un tratto
variabile di 420 pb
• Variabilità superiore a quella del 16S
rDNA
• Miglior potere discriminatorio
delle specie strettamente correlate
rpoB
• Gene lungo 3.500 pb codificante per una (la ß) delle 5
subunità della RNA polimerasi, il principale enzima
del processo di trascrizione
• Altamente conservato ma più variabile del 16S rDNA
• Presente in singola copia
• Un tratto ipervariabile di 300 pb, include l’hot spot in
cui si concentrano le mutazioni associate alla resistenza
alla rifampicina
• Un secondo tratto ipervariabile di 720 pb è
particolarmente idoneo ala differenziazione delle
specie micobatteriche a crescita rapida
• Ceppi con divergenza >3%: specie differenti
• Ceppi con divergenza <2%: singola specie
Contenuto di G+C
• I micobatteri hanno un contenuto di guanina
+ citosina (61 - 71 mol%) più alto rispetto
agli altri microorganismi
• Alcuni generi correlati al genere
Mycobacterium hanno un alto contenuto di
G+C
• L’informazione fornita dal contenuto di
G+C ha un significato grossolanamente
Analisi filogenetica
• Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
importanti informazioni per la filogenesi
• Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
grafiche del cammino dell’evoluzione
• Diversi algoritmi
• Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
• Bootstrap: analisi della robustezza dell’albero
• Diverse rappresentazioni grafiche
• Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .
Analisi filogenetica
• Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
importanti informazioni per la filogenesi
• Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
grafiche del cammino dell’evoluzione
• Diversi algoritmi
• Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
• Bootstrap: analisi della robustezza dell’albero
• Diverse rappresentazioni grafiche
• Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .
Analisi filogenetica
• Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
importanti informazioni per la filogenesi
• Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
grafiche del cammino dell’evoluzione
• Diversi algoritmi
• Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
• Bootstrap: analisi della robustezza dell’albero
• Diverse rappresentazioni grafiche
• Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .
Analisi filogenetica
• Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
importanti informazioni per la filogenesi
• Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
grafiche del cammino dell’evoluzione
• Diversi algoritmi
• Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
• Bootstrap: analisi della robustezza dell’albero
• Diverse rappresentazioni grafiche
• Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .
Discrepanze emergenti dall’analisi
filogenetica di regioni diverse
• Correlazioni in base al 16S
rDNA
• Complesso M. fortuitum, M.
peregrinum
• Complesso M. chelonae, M. abscessus
• Complesso M. smegmatis
• Correlazioni in base al rpoB
• Complesso M. fortuitum, M.
peregrinum
• Complesso M. chelonae, M. abscessus
• Complesso M. mucogenicum
• Complesso M. mageritense
• Complesso M. smegmatis
• Complesso M. wolinskyi
Una proposta interessante
• L’analisi filogenetica di vari geni combinati in
un’unica sequenza ne aumenta il potere
discriminatorio
• Geni sparsi qua e là nel genoma forniscono
un’immagine più fedele dell’evoluzione
dell’intero cromosoma
• PROBLEMA: non esiste un database
Evoluzione dei micobatteri
a crescita lenta
a crescita lenta, correlati a M. terrae
a crescita lenta, correlati a M. simiae
a crescita rapida, termotolleranti
a crescita rapida
I caratteri fenotipici
• Caratteri biochimici
• Caratteri colturali
•
•
•
•
Velocità di crescita
Pigmento
Temperature di crescita
Analisi dei lipidi di parete
• Sensibilità agli antibiotici
Principali caratteri tassonomici
• Ruolo centrale del genotipo
(sequenziamento e/o omologia DNADNA)
• Criteri fenotipici di esclusione
• Velocità di crescita
• Pigmento
• Temperature di crescita
• Composizione lipidica della parete
Gennaio 2009: il genere Mycobacterium
• 133 specie ufficialmente riconosciute
• 7 specie, ben caratterizzate, ma non ufficialmente
riconosciute
• Specie a crescita rapida 53%
• Specie a crescita lenta 47%
• Specie non cromogene 51%
• Specie scotocromogene 46%
• Specie fotocromogene 3%
• Specie patogene 61%
• Specie isolate esclusivamente dall’ambiente 17%
• Specie isolate dall’uomo ma non patogene 16%
• Specie isolate esclusivamente da animali 6%