Ereditarietà X-Linked
Madre
Padre
X X
X Y
Figlia
Figlio
Cromosoma X
Geni sottoposti
ad inattivazione
Cromosoma Y
Geni attivi
Regione
pseudo-autosomica
X Inactive
SpecificTranscript
Xq13
circa 80 geni
circa 870 geni
- SRY
- Geni della
spermatogenesi
Cromosoma Y
Delezioni interstiziali dell’Y
nel 5-10% dei soggetti con
azoospermia o grave oligospermia
non ostruttiva
Delezioni del cromosoma Y
Le microdelezioni del cromosoma Y rappresentano una causa
importante di sterilità maschile con oligo- azoospermia e la
loro identificazione
• fornisce un corretto inquadramento diagnostico
• permette di evitare trattamenti empirici costosi e inutili
• ha importanti conseguenze etiche se il paziente è candidato per le
tecniche di riproduzione assistita
almeno 3 regioni importanti per la spermatogenesi
Casi di azoospermia o oligospermia severa :
il 5-10% è portatore di anomalie citogenetiche del
cromosoma Y
il 5-10% è portatore di delezioni submicroscopiche di Yq NON sono individuabili
all’analisi del cariotipo (microdelezioni) ma
possono essere identificate mediante STS-PCR
STS “sequence tagged sites” sono sequenze
note di DNA genomico che possono essere
amplificate tramite PCR
Int J of andrology (1999) – Hum Reprod (2001)
Laboratory guidelines for molecular
diagnosis of Y-chromosomal microdeletions
M.Simoni et al.
• elenco di STS da non utilizzare
• set di STS primers consigliati:
AZFa:
AZFb:
AZFc:
sY84,sY86
sY127,sY134
sY254,sY255
Se viene trovata una delezione per valutare la esatta
estensione si consiglia l’uso di altri STS che si trovino
all’estremità prossimale e distale della regione
(particolarmente importante per AZFa e b in pazienti
candidati all’ICSI)
Multiplex a
sY254 (c)
sY 86 (a)
sY127 (b)
Multiplex b
sY84 (a)
sY134 (b)
sY255 (c)
Frequenza delle microdelezioni Y
estema variabilità tra i vari studi (1%-55%)
dipende dai criteri di selezione
pazienti azoospermici o gravemente oligospermici
(<5 milioni spermatozoi/ml) la percentuale è dell’11%
(solo le forme idiopatiche : 18%)
se si considerano pazienti con più di 5 milioni di
spermatozoi/ml la percentuale è inferiore all’1%
Casistica laboratorio Genetica Medica:
1/600 AZFa 2/600 AZFb 12/600 AZFc
6/600 AZFb+c
2/600 AZFa+b+c
Tot. 23/600 (3.8%)
AZFa
AZFb
DBY - UTY Del
interstiziale
USP9Y*
RBMY1A
(multicopia)
DAZ
(4-7 copie)
AZFc
BPY2
CDY1
rara
Azoospermia con sole
cellule si Sertoli (SCOS)
Del
interstiziale
rara
Arresto della
spermatogenesi alla
pubertà prima o durante
la meiosi
Del
interstiziale c
comune
Del
terminale c
intermedia (periodo fertile giovanile)
Del
(2 copie una
nel cluster
interstiziale bc
DAZ una
all’estremo 3’) Del
terminale abc
Presenza di cellule
germinali in vario stadio
di maturazione ma
pochi spermatozoi
comune
Fenotipo variabile dalla
SCOS alla oligospermia
rara
Azoospermia con sole
cellule si Sertoli (SCOS)
Mutazioni puntiformi in USP9Y* in 2 maschi con ipospermatogenesi
Variabilità fenotipica delle delezioni
• non costante correlazione genotipo-fenotipo
• in genere:
– azoospermia (84%)
– grave oligospermia (meno di 1 x106ml) (14%)
– moderata oligospermia (1-5 x106ml) (2%)
• alterazione della spermatogenesi variabile anche in
delezioni apparentemente simili
• del Y anche in azoo- oligospermici con
criptorchidismo o varicocele grave
• del Y può promuovere la perdita del cromosoma con
mosaicismo somatico 45X / 46XY
• del Y molto centromeriche associate a bassa statura
Sex reversal
Inattivazione dell’X
solo uno dei due crom. X è attivo nelle femmine
meno di
100 cellule
propagazione
clonale
Zigote
femminile
stadio di
morula
casuale
innattivazione
X pat. / X mat.
Inattivazione bilanciata dell’X
Cosa succede se una donna porta un gene non
funzionante sull’X
gene
mutato
Zigote
femminile
Innattivazione casuale
X paterno / X materno
il 50% delle cellule
non esprime quel gene
Inattivazione dell’X
• Compensa le differenze di “dose genica” tra maschi e
femmine
• Alcuni geni sfuggono all’inattivazione
(regioni pseudo-autosomiche alle estremità del
cromosoma X)
• I geni XIST-TSIX in Xq13 sono essenziali per
l’inattivazione
• La metilazione è uno dei meccanismi dell’inattivazione
Inattivazione sbilanciata
dell’X
Perchè ?
• Un cromosoma X porta una mutazione LETALE
• C’è una traslocazione bilanciata X ; autosoma
• La regione che controlla l’inattivazione è alterata
• E’ avvenuto “per caso”
Inattivazione Sbilanciata dell’X:
effetto della selezione
gene
mutato
Zigote
femminile
Inattivazione
casuale
stadio embrionale
Selezione
nei tessuti in cui la
funzione del gene è
indispensabile
Malattie X-Linked recessive
Femmina
SANA
Madre
( portatrice )
Padre
X X
X Y
Femmina
PORTATRICE
Maschio
MALATO
Maschio
SANO
Ereditarietà X-Linked recessiva
Ereditarietà X-Linked recessiva
Distrofia Musculare di Duchenne
DMD
Giorgio
Ester
Enrico
Giorgio ha 3 anni
• modesto ritardo nell’iniziare a camminare
• cammina con lentezza
• ha difficoltà a stare eretto
• non corre
• all’esame obiettivo
– ipertrofia dei gastrocnemi
– debolezza dei muscoli prossimali
• Creatina Kinasi
(CPK) = 10,000 ui
Biopsia Muscolare
Controllo
Normale
Giorgio
Colorazione Ab anti-Distrofina
Controllo
Normale
Giorgio
Distrofina
proteina associata alla membrana :
- il dominio N-terminale lega l’actina
- lungo dominio con 24 ripetizioni omologhe ad α-elica
- una regione vicina al C-terminale ricca di cisteine che lega il calcio
- il dominio C-terminale che lega altre proteine di membrana
Gene DMD
2,4 Mb (12 cMorgan)
8 promotori 79 esoni (0.6%)
mRNA 14 kb trascritto in 16 ore
DM Duchenne : mancata espressione di distrofina
- delezioni molto grandi (65-70%) , duplicazioni (10%)
- mutazioni frameshift (10%), stop codon (5%)
- delezione “in-frame” con perdita delle regioni C-terminale o N-terminale
(domini che legano le proteine)
DM Becker : alterata qualità o quantità di distrofina
- delezioni “in-frame” (85%)
- di cui il 46% nella regione dei “spectrin repeats”
Ricerca diretta delle delezioni nella DMD
- preparazione del DNA genomico
- amplificazione con PCR multiplex
di 9 o più esoni
- separazione dei frammenti in
gel di agarosio
- visualizzazione con EB e raggi UV
- fotografia (o immagine digitale)
Giorgio è affetto da
Distrofia Musculare di Duchenne
• Diagnosi confermata da biopsia muscolare
• Il test genetico non ha evidenziato delezioni
( delezioni-dupl. sono presenti nel 70% dei malati )
• Giorgio ha probabilmente una mutazione puntiforme
Malattia X-linked recessiva - incidenza di 1 / 3300
tasso di nuove mutazioni di 10-4 / meiosi (1/3 dei casi)
Albero famigliare allargato
dopo colloqui con la cugina Rosa e la zia Giovanna
Elena
Enrico Ester Giorgio
Giovanna
Rosa
La cugina Rosa
vuol sapere che rischio ha di avere un figlio malato
• Osservando la famiglia,
la probabilità che Rosa sia portatrice è =
25%
• Ancor prima del test genetico,
si può migliorare la stima del rischio ?
Creatina Kinasi (CPK)
• fuoriesce dalle membrane del muscolo
danneggiato
• molto elevata nei maschi malati
• livelli elevati solo in 2/3 delle portatrici
– Giovanna e Rosa
hanno
CPK normale
Stima “Bayesiana” del rischio
Probabilità “complessiva “ :
tiene conto della
probabilita a priori di essere e di non essere portatore
( appartenendo ad dato albero famigliare )
e di altri fattori che
modificano queste due probabilità (prob. condizionali)
Zia Giovanna :
ha CPK normale e due figli maschi sani
Elena
Enrico Ester Giorgio
Giovanna
CPK normale
Rosa
CPK normale
Quale è la probabilità
che Zia Giovanna sia portatrice ?
Che lo sia
Che non lo sia
1/2
1/2
con CPK Normale ?
1/3
1
con 2 figli Maschi Sani ?
1/4
1
1/24
1/2
Probabilità “ a priori ”
Prob. condizionale 1/2 .1/3 .1/4 =
Prob. finale
1/24
1/24 + 1/2
= 1/13
1
:
12
Cugina Rosa :
ha 1/2 della probabilità di Giovanna e CPK normale
Elena
Enrico Ester Giorgio
Giovanna
CPK normale
Rosa
CPK normale
Il rischio a priori per Rosa
è
la metà di quello di Zia Giovanna
1/13 x 1/2 =
1/26
Quale è la probabilità
che Rosa sia portatrice ?
Che lo sia
Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/2 =
1/26
25/26
1/3
1
1/26 .1/3 =
1/78
25/26
= 1/76
1
con CPK Normale ?
Prob. “ a posteriori ”
1/78
Prob. finale
Che non lo sia
1/78+25/26
:
75
Probabilità che Rosa possa
avere un figlio affetto
Prob. di essere portatrice X rischio di trasmissione
1/ 76 x 1/4
=
1 / 304
1/304 è la probabilità che la cugina Rosa
possa avere un figlio affetto
Elena
Giovanna
CPK normale
(1/13)
Enrico Ester Giorgio
Rosa
CPK normale (1/76)
Uso del Linkage nella malattia DMD
( mutazione non trovata )
Giovanna
Elena
Enrico Ester Giorgio
Rosa
Analisi di linkage
• Linkage = concatenazione
• Alleli corrispondenti a loci tra loro vicini sullo
stesso cromosoma tendono ad essere
trasmessi insieme (come una singola unità)
durante la meiosi
Allele 2
Allele 1
Gene wt
Gene con mutazione
Allele 1
Allele 3
locus polimorfico A (1, 2, 3, 4)
locus polimorfico B (1, 2, 3, 4, 5)
Analisi di linkage
2
1
wt
Mut
1
3
1
2
wt
Mut
1
3
La frequenza di ricombinazione
è una “misura della distanza”
tra loci diversi :
 = 0.5 (50%) loci lontani
 = 0 (0%) loci vicinissimi
 = 0.02 (2%) loci vicini
unità di misura = centiMorgan
cM = 1 ricombinazione/100 meiosi
Esempio di marcatori polimorfici
impiegati nel linkage della DMD
DMD
Esone 79
3’
2,4 Mb (12 cMorgan)
alleli
Microsatellite C
GENE
Microsatellite B
Esone 1
5’
Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6
Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli
Uso del Linkage: 1 marcatore (A)
5’ UT
( e se ci fosse una ricombinazione tra mut. e marcatore? )
Giovanna
Elena
7
1
Enrico Ester Giorgio
1
3
7
1
Rosa
7
3
Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D)
( c’è stata ricombinazione tra mut. e marcatore ? )
Giovanna
Elena
5
4
6
5
4
7
1
3
7
1
Enrico Ester Giorgio
Rosa
4
5
6
1
7
3
Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D)
Sarà stata trasmessa la mutazione ad Ester ?
2
5
4
9
7
1
Enrico Ester Giorgio
Elena
Giovanna
6
5
4
3
7
1
Rosa
2
4
4
5
6
9
7
1
7
3
1 e 2 ricombinazioni tra marcatori
1
mut
1
mut
1
2
mut
mut
mut
mut
Esempio di marcatori polimorfici
impiegati nel linkage della DMD
DMD
Esone 79
3’
2,4 Mb (12 cMorgan)
alleli
Microsatellite C
GENE
Microsatellite B
Esone 1
5’
Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6
0.124 = 0.0002
4 ricombinazioni
in 1 su 5000 casi
Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli
Se il marito di Rosa avesse un aplotipo 4-1 ??
4
Nuove mutazioni
10-4 / meiosi
(1/3 dei casi)
1
Giovanna
Elena
5
4
6
5
4
7
1
3
7
1
Enrico Ester Giorgio
Rosa
4
4
5
6
1
1
7
3
Analisi del rischio in famiglie X-linked
• Informazioni dall’albero famigliare
• Calcolo del rischio secondo Bayes
• Ricerca della mutazione (test diretto)
• Uso del linkage (test indiretto)
• Attenzione alle ricombinazioni !
( usare più marcatori… meglio se intragenici )
Caso negativo per delezioni
e duplicazioni DMD
62
Francesc o
82
M artina
14
1
1
1
2
2
3
2
2
1
Davi de
16
2
2
3
1
3
1
1
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
1
2
2
3
1
3
1
1
1
1
30
5’DYS-II
1 1
5’-5N3
1 1
5’-7n4
1 2
2 2
STR44
2 3
STR45
3 1
2 1
STR49
2 1
1 1
DMD1-2c
DXS1214
3’DYS MS
1.2 kb a monte dell’esone 1
introne 1
introne 25
13.8 kb a valle dell’esone 44
1.2 kb a valle dell’esone 45
introne 49
introne 56
introne 62
esone 79
18
62
Francesc o
82
M artina
14
1
1
1
2
2
3
2
2
1
Davi de
16
2
2
3
1
3
1
1
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
1
2
2
3
1
3
1
1
1
1
30
1 1
1 1
1 2
2 2
2 3
3 1
2 1
2 1
1 1
18
5’DYS-II
5’-5N3
5’-7n4
STR44
STR45
STR49
DMD1-2c
DXS1214
3’DYS MS
kb a monte dell’esone 1
In caso1.2
di
introne gravidanza:
1
introne 25
- villocentesi
indell’esone
11ma44set
13.8 kb a valle
1.2 kb a valle dell’esone 45
- determinazione
del sesso (SRY)
introne 49
introne 56
p
- informativa
introne 62 solo la trasmissione X
esone 79
62
Frances co
82
Martina
14
1
1
1
2
2
3
2
2
1
Dav ide
16
2
2
3
1
3
1
1
1
1
1
1
2
2
1
2
2
1
1
2
2
3
1
3
1
1
1
1
30
1 1
1 1
1 2
2 2
2 3
3 1
2 1
2 1
1 1
1
1
1
2
2
3
18
introne 1 - 25
esone 63 - 79
1
1
1
2
2
3
2
2
1