IL DNA fingerprinting umano oggi
Prof.ssa Claudia Donnini, Università di Parma
Bologna, 7 settembre 2005
Campione XY
Campione YZ
Sesso
Femminile
Sesso
Maschile
TH01
8-9
TH01
6-7
D21S11
30.2-31
D21S11
28-32.2
D18S51
13-19
D18S51
16-19
vWA
16-18
vWA
18-18
FGA
21-21
FGA
21-23
D8S1179
8-10
D8S1179
11-12
TPOX
8-8
TPOX
11-11
CSF1PO
11-12
CSF1PO
10-10
D16S539
10-12
D16S539
8-13
D7S820
7-12
D7S820
11-11
D13S317
9-12
D13S317
10-12
D5S818
12-13
D5S818
11-13
D3S1358
14-16
D3S1358
16-18
D19S433
13-14
D19S433
14-16
D2S1338
16-23
D2S1338
18-20
1) Che cosa significano sigle e numeri?
2) Come si è arrivati all’uso di questa tipologia di profilo e perché?
Il DNA nucleare della specie Homo sapiens
è costituito da:
23 cromosomi nelle cellule della linea germinale,
contenuto in DNA: circa 3x109 paia di basi (bp)
23 coppie di cromosomi nelle cellule somatiche,
contenuto in DNA: circa 2x3x109 paia di basi (bp)
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25.000 caratteri
1985. Il Dr Alec Jeffreys i suoi collaboratori, dell’Università di Leicester, in
Inghilterra,
- mettono in evidenza l’esistenza di profili individuali (il fingerprinting del
DNA) e
- dimostrano, con le loro analisi, l’esistenza di una relazione familiare cioè
di una compatibilità ereditaria risolvendo una disputa in un caso di
immigrazione
(Jeffeys et al., 1985, Nature 314: 67-73; Jeffeys et al, 1985 Nature 316: 76-9 ;
Jeffrey et al., 1985, Nature 317: 818-9)
Jeffreys e coll. scoprono che
esistono nel DNA umano delle regioni
(minisatelliti/VNTR= Variable Number Tandem Repeat)
in cui brevi sequenze di DNA (da 10 - 15 bp)
vengono ripetute in tandem numerose volte e
in più loci sui cromosomi e
che il numero di ripetizioni è altamente variabile nei diversi
individui
da Brooker, Genetica, ed. Zanichelli
Questo metodo di fingerprinting viene definito:
Multilocus RFLP-VNTR
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
indica che, a causa del numero variabile di
ripetizioni, vengono creati dal taglio con un enzima di
restrizione, frammenti di DNA di diverse dimensioni.
da Snustad-Simmons, Principi di Genetica, Edises II ed.
Single-locus RFLP-VNTR
(Restriction Fragment Length Polymorphism-Variable
Number Tandem Repeat Polymorphism)
VNTR: numero variabile di ripetizioni seriali (tandem
repeats) (da 9 a 40bp che possono essere ripetute anche
centinaia o migliaia di volte, dimensione da 500 a 23000
bp)
Single-locus: ripetizione localizzata in un solo locus
cromosomale.
Di conseguenza se applico lo stesso protocollo
sperimentale di Jeffreys et al.
e uso come sonda una Single-locusVNTR
verranno individuati
due frammenti se l’individuo è eterozigote (ha
ricevuto dai genitori DNA con numero diverso di
ripetizioni).
un unico frammento se l’individuo è omozigote (ha
ricevuto da entrambi i genitori DNA con lo stesso
numero di ripetizioni)
1986. Negli Stati Uniti viene ammessa per la
prima volta in tribunale un’analisi con
RFLP, in un caso di stupro (Stato della Florida
contro Tommy Lee Andrews).
1987. L’analisi del DNA a fini forensi subisce una
battuta di arresto. A New York, nel processo
contro Joseph Castro, la corte sceglie di rendere
inammissibile l’analisi del DNA ai fini della
inclusione.
Il problema può essere così riassunto
“la cosa da cui la deduzione è fatta deve essere sufficientemente
stabilita per avere una generale accettabilità nel particolare campo
a cui si riferisce”
In particolare nel processo in questione per decidere l’ammissibilità
la corte chiede che la prova del DNA deve rispondere a tre criteri:
1) E’ fondata la teoria che riguarda l’analisi del DNA?
2) Le tecniche utilizzate nell’analisi sono in grado di
produrre risultati affidabili?
3) In questo caso i test sono stati eseguiti in modo corretto?
Tale decisione è il fattore che più ha contribuito a aumentare
l’attenzione sulla emissione di normative per la
certificazione di qualità e la standardizzazione dell’analisi.
Vantaggi:
Riproducibilità - Elevato potere discriminatorio
Svantaggi:
- Richiedere quantità discrete di DNA (50-500ng) e
quindi il non potere essere utilizzato a partire da
tracce biologiche e
- di richiedere tempi abbastanza lunghi.
Si sono quindi cercate, per l’analisi del
fingerprinting,
nuove regioni ripetute nel DNA
ma sufficientemente brevi per potere essere
amplificate per PCR anche in caso di
degradazione parziale del DNA:
- microsatelliti / STR (Short Tandem Repeat
polymorphism)
L’amplificazione di una STR darà origine a
due bande se l’individuo è eterozigote
un'unica banda se l’individuo è omozigote
Numerose STR sono state validate e se ne é stabilito
nelle diverse popolazioni umane la frequenza delle
singole ripetizioni
(Hammond et al, 1994 Am J Hum Genet 55:175-189;
Garofano et al, 1998 J Forensic Sci 43: 837-840;
Garofano et al., 1998 Forensic Science Int. 97: 53-60)
ENFSI
CODIS
(7 loci)
(13 loci)
TH01
TH01
D21S11
D21S11
D18S51
D18S51
vWA
vWA
FGA
FGA
D8S1179
D8S1179
TPOX
CSF1PO
D16S539
D7S820
D13S317
D5S818
D3S1358
D3S1358
ENFSI (European Network of Forensic Science Institutes)
CODIS (Combinated DNA Index System) della FBI.
Per rendere il più efficace possibile l’analisi da traccia
l’amplificazione delle STR
e di una regione del gene dell’amelogenina, che serve per
l’identificazione del sesso,
viene fatta contemporaneamente.
L’allineamento tra
il gene dell’amelogenina umana presente sul cromosoma X
il gene dell’amelogenina umana presente sul cromosoma Y
ha messo in evidenza alcune differenze
In particolare c’e una regione lunga
106 pb sull’X
112 pb sull’Y
L’amplificazione di questa regione permette di distinguere tra ♀♂
♀: se c’è una unica banda da 106 pb
♂ : se ci sono due bande, una da 106 pb e una da 112 pb
Per potere distinguere i prodotti di amplificazione
delle singole STR
i primers (oligonucleotidi) per l’amplificazione sono
legati a diverse molecole fluorescenti
(generalmente da 3 a 5).
Per ovvie ragioni ad una identica molecola fluorescente
vengono legati primers che amplificano regioni di
diversa dimensione e quindi non confondibili.
La ragione dell’uso di primers fluorescenti è legata
al fatto che l’analisi degli amplificati viene fatta con
un sistema di elettroforesi capillare che consente
di distinguere gli amplificati sulla base del colore .
Sample injection
Mixture of dye-labeled
PCR product from
Multiplex PCR reaction
Sample separation
Sample Detection
CCD Panel
Ar +
LASER
(488 nm)
Color
Separation
Fluorescence
Capillary
ABI Prism
spectrograph
Il capillare, che
contiene una
soluzione
polimerizzante, è
dotato di una
finestrella attraverso
la quale il laser eccita
ad una precisa
lunghezza d’onda il
campione di DNA
marcato con un
determinato
fluoroforo che ne
permette
l’identificazione.
Le bande, la cui dimensione dipende dal numero di
ripetizioni, vengono trasformate in picchi.
Si possono anche utilizzare programmi che trasformano i picchi in numeri
Campione XY
Campione YZ
Sesso
Femminile
Sesso
Maschile
TH01
8-9
TH01
6-7
D21S11
30.2-31
D21S11
28-32.2
D18S51
13-19
D18S51
16-19
vWA
16-18
vWA
18-18
FGA
21-21
FGA
21-23
D8S1179
8-10
D8S1179
11-12
TPOX
8-8
TPOX
11-11
CSF1PO
11-12
CSF1PO
10-10
D16S539
10-12
D16S539
8-13
D7S820
7-12
D7S820
11-11
D13S317
9-12
D13S317
10-12
D5S818
12-13
D5S818
11-13
D3S1358
14-16
D3S1358
16-18
D19S433
13-14
D19S433
14-16
D2S1338
16-23
D2S1338
18-20
Se confronto profili individuali:
NON identità genetica: ESCLUSIONE
IDENTITA’ genetica: COMPATIBILITA’
In quest’ultimo caso,
viene effettuata un’analisi statistica dei risultati ed
infine viene fornita una percentuale di attribuzione
che sarà tanto più prossima al 100% quanto maggiore
sarà il numero di regioni del DNA analizzate.
Generalmente l’analisi da 9 a 15 STR consente di
raggiungere una percentuale di attribuzione superiore al
99,9999%.
Il più importante limite dell’analisi del DNA in criminalistica è
rappresentato dai gemelli monozigotici
Testi consigliati
John M. Butler
"Forensic DNA typing: biology and technology behind STR
markers".
1a ed
ACADEMIC PRESS 2001
N. Rudin and K. Inman,
“An introduction to Forensic DNA analysis”
Second edition
CRC Press 2002
Indirizzi web utili
ENSFI http://www.enfsi.org/ewg/dnawg/tor/
CODIS http://www.fbi.gov/hq/lab/codis/index1.htm
DNA e crimine
http://www.ncsl.org/programs/health/genetics/dna.htm
http://www.denverda.org/html_website/denver_da/DNA_Res
ources_index.html
http://www.denverda.org/html_website/denver_da/DNA_re
sources.html
http://www.ncsl.org/programs/health/genetics/DNAadmiss.
htm
http://www.alalinc.net/library/rguides/dna_research.pdf
http://www.nap.edu/readingroom/books/DNA/